Summary
细胞内记录的电生理学技术证明和用于确定在一个蝴蝶的复眼单一的感光细胞的光谱灵敏度。
Abstract
细胞内记录是用于确定如何单个小区可以对给定的刺激响应的强大技术。在视觉研究，细胞内记录在历史上一直用于单个感光细胞的敏感性研究到至今仍在使用的不同的光刺激的常用技术。然而，仍详细方法在文献中为希望的眼睛来复制细胞内记录实验研究缺乏。在这里，我们目前的昆虫作为检查眼睛的生理更普遍的模式。昆虫感光细胞位于眼睛的表面附近，因此容易达到，而且许多涉及视力的机制跨越动物门保守的。我们描述了一个蝴蝶的眼睛在体内的感光细胞内录制的基本步骤，使得用这种方法更容易被研究人员在电子很少以往的经验的目标lectrophysiology。我们需要引入，如何准备活蝴蝶记录，如何插入玻璃微电极到一个单元格，最后录制过程本身的基本设备。我们还说明原始响应数据的基本分析，用于确定个体细胞类型的光谱灵敏度。虽然我们的协议的重点是确定的光谱的灵敏度，其他刺激（ 例如 ，偏振光），并且该方法的变型也适用于这种设置。
Introduction
细胞如神经元的电性能通过测量穿过细胞膜的离子流在电压或电流的变化观察到的。各种电生理技术已经开发了用于测量细胞的生物电活动。在动物的眼睛中发现的神经元接触，而其电路是较少复杂比在大脑中，使这些细胞的良好候选为电生理研究。在眼电生理常见的应用包括电图（ERG）1,2和微电极细胞内记录。 ERG涉及将一个电极或动物的眼，施加光刺激，并测量作为所有附近小区3-6的响应的总和在电压的变化。如果一个人在描述个人感光细胞的光谱灵敏度特别感兴趣，经常多种细胞类型同时在不同的优势，一个给定的刺激作出反应;因此可能难以确定来自ERG数据特定细胞类型的敏感性，特别是如果有几种不同类型的眼睛的光谱相似感光细胞。一个可能的解决办法是建立转基因果蝇与在大多数R1-6细胞的眼睛表示有兴趣感光（视蛋白）基因，然后执行尔格7。该方法的潜在缺点包括不向感光体蛋白8的低表达，并用于转基因动物的产生和筛选时间长帧。与种类较少光谱不同的光感受器的眼睛，用彩色滤光片的眼睛的适应可与降低一些细胞类型的ERG的贡献，从而使光谱灵敏度最大值9的估计帮助。
细胞内记录是另一种技术，其中一个精细电极刺入细胞和施加的刺激。电极仅记录逐张idual细胞的反应，使得从记录和分析多个单个细胞可以产生生理不同的细胞类型10-14的具体的灵敏度。虽然我们的协议侧重于光谱灵敏度的分析，细胞内的尖锐的电极记录的基本原理是修改其他应用程序。使用不同的制备试样，例如，和使用锋利的石英电极，可以在大脑从视叶或其他区域更深记录，这取决于所提出的问题。例如，从个人感光细胞15的响应时间，在视神经细胞活性裂片16（椎板，髓质或小叶17），脑18或其他神经节19还可以记录有类似的技术，或颜色刺激可以与偏振20来代替-22或运动刺激23,24。
光转导，该方法通过使光能量被吸收并转换成电化学信号，是共同的几乎所有现今动物门25一个古老的性状。在感光细胞发现，负责发起可视光转视色素视紫红质是。在所有动物中视紫红质是由视蛋白的蛋白质，所述7次跨膜G蛋白偶联受体家族的成员，和相关联的发色团是从视网膜或类似的分子26,27衍生的。视蛋白的氨基酸序列和发色团结构影响视紫红质，以不同波长的光的吸光度。当光子被发色团吸收的视紫红质被激活，启动了在最终导致膜结合离子通道28的开口的细胞的G蛋白级联。不像大多数神经元，感光细胞经历，可以作为一个相对变化响应的幅度不断变化的光刺激来衡量分级的潜在变化。通常，一个给定的感光器类型表明只有一个视蛋白基因（虽然存在例外8,10,29-31）。复杂的色觉，在许多脊椎动物和节肢动物发现的那种，与感光细胞的数百或数千各表达一种或偶尔多个视紫红质类型的复合眼实现。可视信息通过经由复杂的下游神经信号在眼睛和大脑比较在感光镶嵌反应，导致完全的颜色和运动图像的感知捕获。
测定感光细胞通过细胞内记录不同波长的光的原始应答后，就可以计算出其光谱感光度。此计算是基于Univariance的原理，其中指出，感光细胞的反应是依赖于它吸收的光子的数量，但不能在它吸收32的光子的特定性质。任何光子是ABSO通过视紫红质rbed会诱发同一种反应。在实践中，这意味着，一个细胞的原始响应振幅由于或者增加光强度（更多的光子吸收）增加， 或者在波长朝其峰值灵敏度的移位（视紫质的较高的概率吸收该波长）。我们使在公知的强度和相同波长的响应在不同波长和相同的强度，但未知相对感光度与细胞反应利用这一原理。细胞类型通常由波长在哪些其灵敏度峰识别。
在这里，我们显示了细胞内记录和蝴蝶的眼睛光感受器的光谱灵敏度分析的一种方法，其重点是使这种方法更广泛的研究团体更容易获得。虽然细胞内记录在文献中仍然普遍，尤其是相对于昆虫的色觉，我们已经发现塔的材料和方法吨描述通常太短，以允许该技术的再现。我们目前在视频格式的方法，允许其更容易复制的目的。我们还使用容易获得和负担得起的设备描述技术。我们解决经常不报共同注意事项，优化一个新的和复杂的技术，当它慢下来研究。
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Protocol
所有动物的人道待遇越好。昆虫被运来自哥斯达黎加昆虫供应，哥斯达黎加蛹。
1. 袖蝶属蛹护理
- 杭所有蛹用昆虫针湿盒间隔2-3厘米。
- 羽化后，让翅膀晾干然后继续蝴蝶存活至少1天在湿盒和记录每天前喂稀释的蜂蜜水溶液。
- 加水稀释蜂蜜体积约20％的蜂蜜水溶液，倒入浅培养皿。
- 把个人的蝴蝶培养皿中，一个接一个。在触摸与它们的前跗溶液，蝴蝶将自动延长他们proboscides和从培养皿饮用。如果他们的长鼻不自动扩展，使用产钳拉出来长鼻，并介绍给蜂蜜的解决方案。
2.光学跟踪，校准和测量电实验光照条件的键相
- 将带有外壳和通用电源和至少一米长，提供明亮的白色光的表的一个端部连接的聚光透镜组件150W的氙弧灯。
注意：氙弧灯产生极其明亮的光与强烈的紫外线的强度。防护眼镜应该始终佩戴并指示由制造商以防止因与大气中的氧气的UV光相互作用的臭氧累积应使用灯。 - 设置在长度的光道一米离开壳体组件通过（ 图1）的光。
- 在光道与相距近似距离上按以下顺序发生：1）一个凸二氧化硅或石英透镜从冷凝器组件40厘米，2）的中性密度滤光轮（没有在光路进一步沿着当前滤波器）22厘米赛道上，3）驱动单元快门从ND滤镜14厘米S，4）的凹二氧化硅或石英透镜紧邻快门以下，和5）的准直光束探针还6厘米沿着轨道的远端。
- 贴上直径600微米光缆准直光束探测器。
注意：根据光强度，5-10毫米直径的光纤电缆可能需要足够的光传送到其他棉片和可以取代此。 - 调整的距离，高度和每个光学元件的角度，使光束离开组件是在最高强度可能。
- 作为光学跟踪元素可与不同的应用程序略有不同，请确保所有元素在UVA和可见光范围（315-700纳米）的光。
- 一旦光道被组装时，测量通过设置使用分光计传递的光。校准分光计第一使用校准灯与已知的光谱和制造商的软件。
注意：我们描述了以下设置使用海洋光学的产品为清楚起见，但其他厂商（ 例如 ，Avantes公司）销售的产品相媲美。- 开始测量前打开钨校准灯至少45分钟。
- 为了校准，通过USB连接光谱仪到计算机上安装了相关软件。然后通过紫外可见发射余弦校正连接分光计钨校准灯。
- 从“文件”选项卡中选择“新建绝对辐射测量”，然后选择谱仪“源”。
- 按照提示创建一个新的校准“CAL”文件。出现提示时，加载提供的数据文件钨校准灯在可见光范围（300-800纳米）到软件，它可以自动计算从光谱仪输出校正频谱已知的频谱。
- 保存校准文件。当initi加载此文件alizing使用光谱仪光光谱以后的测试软件。
- 一旦光谱仪校准，使用此记录从实验装置的光的光谱。此后被打开软件时，选择“新建绝对辐射测量”并加载以前保存的校准文件。接下来所有遮光到光谱仪拍摄暗光谱。
- 与目前的测量所需的试验光条件的光谱仪，调整积分时间（4毫秒），平均扫描（5），和棚车宽度（5），所以频谱正确缩放和平滑。保留设置同样为所有光谱测量，因此，从不同的测量的光强度可比拟。
- 测量为未衰减白色光光谱，对于在实验过程中所使用的所有中性密度过滤器，并为每个带通干涉滤光器（ 图2）。
- 中号通过从步骤2.2.2至分光计固定用光缆的自由端easure而不在光路中的任何过滤器的白光光谱。与来自步骤2.3加载的校准文件，使用光谱仪的软件作为文本文件保存白光光谱。
注意：光谱保存为文本文件列出的波长（X坐标）中的一列和光在第二列中的强度（y坐标），使得数据可以被加载到电子表格用于步骤2.6。 - 使用相同的设置作为步骤2.5.1，由旋转中性密度（ND）滤光轮中的光道在实验过程中使用的每个光密度（OD）（0-3.5 OD）记录的光谱，并保存为文本文件每个OD。
- 使用相同的设置步骤2.5.1，将10纳米半带宽干扰滤波器逐个放入光路，并记录每个滤光片观察频谱。重复此过程为每个41种不同的干扰滤波器W¯¯第i个的峰值透射率间隔每10纳米从300至700纳米。间隔更远（20纳米）过滤器是大多数应用上可接受的（对于光谱，参见图2）。
- 中号通过从步骤2.2.2至分光计固定用光缆的自由端easure而不在光路中的任何过滤器的白光光谱。与来自步骤2.3加载的校准文件，使用光谱仪的软件作为文本文件保存白光光谱。
- 正确对中的光的强度差时，干涉滤光器被放置在光路中。每个干涉滤光器允许光子不同总数来传递，和一些过滤器的低传输使得难以进一步衰减强度，使所有过滤器允许光子数目相等。
- 计算每个10nm的带宽干涉滤光器的相对强度（I），在表达式I = T /秒，其中T是各为10nm干涉滤光器的光谱曲线下面积（从2.5.3）求解我和s为最大绝对辐射白色光中的每一个过滤器（参见图2为在520纳米的示例）的峰值波长（γ保存的文本文件的自2.5.1值）。
- 所有除以计算intensit通过在2.6.1计算出的最大强度值独立实体正常化为一个，并采取用作施加于各波长的原始灵敏度的校正因子的相对归一化值的倒数（参见步骤6.4）。
- 一组实验之前只有一次执行步骤2.1至2.6。以上的实验过程中周期性地记录在明亮的光线和中性密度滤光片的氙弧灯的绝对辐射，以确保光刺激的强度不发生变化。
- 在实验的过程中，如果通过干涉滤光片的透射光的任何细胞反应接近最大响应振幅，使用ND滤镜来衰减信号。如果实验期间使用ND滤镜，占光谱灵敏度的计算过程中强度的相应下降。
- 设置光道，标定和过滤器天或数周的实验开始之前。保持器覆盖，防止灰尘堆积。
3.录音设备安装
- 通过法拉第笼喂养用于校准的相同光纤电缆和装入一个测角器上，如万向臂周长（参见图3为图）。电缆将是从检体的眼约10厘米的距离。
- 放置一个金属舞台上的振动隔离表一个电极固定器直接安装在一个显微控制舞台上方（ 图4）。放置万向臂使试样的头部是在由臂的旋转运动产生的球面的中心。
- 使用细胞内的前置放大器系统，它包括一个放大器（法拉第笼外）和前置放大器（探头，法拉第笼内部的制备附近）安装在其上放置样品将被放置在金属级的探头。
- 通过同轴电缆连接到探头BNC连接。拆分在同轴电缆的另一端开放只有针尖和电缆的外金属护套从内部线分开。
- 焊接外鞘（保持在地电位）到一个绝缘铜导线的一端与另一端的鳄鱼夹。这鳄鱼夹会附着在试样平台（步骤5.1.4）在金属参比电极。
- 焊接同轴电缆的内部钢丝，以薄的银线，以作为记录电极。这个导线应足够薄在步骤5.2.3至被送入溶液填充的玻璃电极。
- 放置连接于摆臂和碱法拉第笼外的板凳立体显微镜，因此，它可以摆动到降低电极进入眼睛，进出再次一旦电极是在眼转回。
- 确保所有金属里面的法拉第笼正确接地。
- 外法拉第笼，装上preamplif呃到50-60 Hz的噪声减速机（可选）的输入和输出连接到使用BNC T-适配器示波器的一个通道。
- 使用T-适配器的另一端，连接通过示波器传递到硬件中的一个信道的信号。通过USB电缆，这将允许记录有前置放大器响应由软件的计算机上读取附加这个硬件的计算机。
- 附上从光道的快门驱动到使用另一种T型适配器示波器的第二信道和这个连接到脉冲发生器，将控制传递到眼睛（步骤5.5）的光闪烁的频率和持续时间。
注：该钻机本身的设置应该只需要进行一次。打破这里，直到准备开始录音。
4.准备上记录的天
- 实验前打开氙气灯至少45分钟，然后打开玻璃微电极拉马至少30分钟前PUL凌玻璃电极。
- 打开所有录音设备（快门，放大器，噪声消除器，脉冲发生器，示波器，和数据采集硬件），确保快门被默认所以没有光通过光纤电缆封闭。
- 拉细硼硅（或铝）的玻璃微电极（100-250兆欧电阻是理想的）用玻璃微电极拉马。只有被拉到几个小时内使用玻璃电极。
- 回填用3M氯化钾（KCl）中的电极。请注意，此溶液可以根据研究人员的需要进行修改， 例如 ，染料注入。
5.标本准备和录制过程
- 准备标本
- 所以头部是不动，并从该管的一端突出贴上的小塑料管与热蜡内的个体蝴蝶。蜡向下长鼻，天线，和翼（ 图5）。
- 按住ŧ他用一块干一块蜡的腹部和保持放置湿纸巾腹部背后的管内加湿管。确保标本是完全不动。
- 用一小块蜡到一个小平台，一个连接到一个磁性底座一个球窝关节安装在管。
- 在解剖显微镜下，插入直径0.125毫米的银线成可经由口器的头部被用作参考电极。实验前，永久修复线到平台以这样的方式，一旦平台放置在台上用于记录在步骤3.3.2铜导线可以夹在到它。
- 一旦参考电极是在一个合适的位置时，它可以通过快速熔化，然后在导线周围冷却蜡被保持在适当位置。
- 使用易碎的碳钢刀片，用刀片保持器的刀片的柄部和折断的小片用于切割角膜。
- 切一小口（〜10 ommatidi在直径）在左角膜使用剃刀刃和封孔用凡士林以防止干燥。
- 一旦角膜被切断，插入记录电极到眼睛中尽快因为血淋巴中的眼睛会很快硬化，使之无法插入的电极。如果可能的话在钻机在记录将于执行清扫。
注意：凡士林不应在眼睛的其余部分涂因为这将散焦光学系统。- 如果尚未在舞台上，安装的检体和平台放置到在记录钻机阶段。从步骤3.3.2使用鳄鱼夹将试样平台上的参考电极连接探头地线。
注意：如果可能使用红色滤光器照亮的动物。 - 使用带有鹅颈附件短暂点亮一个立体镜下检体，同时降低了记录电极到眼睛中的光源。
- 在SERT连接到探头从步骤3.3.3成在玻璃微电极的背面的氯化钾溶液中的银线。安装电极支架上的玻璃电极。
- 调整电极支架使微电极正上方先前切割角膜，对角膜上方一毫米的洞。降低使用显微直到一个电路被完成，如由在电位（mV）在示波器上的大变化的微电极插入眼睛。
- 如果尚未在舞台上，安装的检体和平台放置到在记录钻机阶段。从步骤3.3.2使用鳄鱼夹将试样平台上的参考电极连接探头地线。
- 一旦进入眼睛，挥动法拉第笼外的体视镜，并关闭光源照射样品。所以眼睛变得暗适应的房间应避光保存。
- 通过从放大器施加1 nA的电流，并注意到在电压的变化检查电极的电阻。电阻通常应该在100-250兆欧之间的范围内。较高电阻指示堵塞或电极的弯曲，和ELECTR的低电阻的颂破损。
- 激活脉冲发生器，以便在快门打开允许光的具有50毫秒的持续时间的闪光每0.5秒，并允许它继续闪烁在实验的持续时间。
- 调整脉冲发生器所以允许多达50毫秒持续时间的闪烁。闪烁之间的持续时间和0.5秒的停顿保持标本尽可能接近在实验过程中适应尽可能暗。五十毫秒靠近最短闪光时间，这将引起相同的幅度响应更长闪光持续时间。
- 在开始时和在实验（步骤5.16）的端部都重新测量响应。在约二十分钟实验的过程中，这些闪光灯设置不随时间降解的响应。不同的棉片可能需要调整这些闪光灯设置。
- 使光缆朝向眼睛的万向臂的位置。
- 检查每个灯闪电压变化的示波器。在电压的负变化表示该电极还没有进入的小区。
- 移动万向臂检体周围，直到它被定位成一角度在其中有一个最大的电压响应的眼睛。
- 旋转显微来回，导致电极的非常小的垂直运动在两个方向上同时轻敲该电极座的碱或使用的前置放大器蜂鸣音功能。继续进行微调，直到出现在示波器（ 图6）去极化光响应。
- 再次调整万向臂找到发病的，其中一道闪光产生最大的去极化信号的角度。使用显微小的调整，并使用巴斯函数的放大器作为需要确保该电极稳定地记录该小区和它会留在整个实验的细胞（见步骤5.11）。
- 一旦建立稳定，开始RECO录制。一个稳定的记录应该不大，以静息电位，低背景噪声，并且始终如一大去极化应答没有变化（至少10:1的信噪比）。
- 运行计算机上的软件，并开始了“新实验”，这将打开一个弹出窗口有四个通道。
- 调整电压规模的软件窗口500毫伏的右上角。第一通道将显示来自实时电极记录的响应，而第二个信道将记录由函数发生器产生的方波，如果信号通过示波器馈送到数据采集硬件，表示当快门打开。另外两个通道是不必要的。
- 点击“开始”的右下角开始记录，并且允许软件在实验的持续时间运行。调节的X（时间）和Y（电压）的变焦轴，使得响应是清楚的。
- 首先，白光，最多记录用ND滤镜轮10个人响应为3.5 OD（约5-10秒）。
- 下一个记录相同数量的反应在3.3的OD，然后3.1，3.0，2.5，2.3，2.1，等等，每一组合，直到0.0的OD。这些反应振幅为ND过滤器系列将在第6节提供响应登陆强度曲线如果出现脱色，在实验过程中，使用明亮的刺激较少闪烁。
- 记录单元在所有波长下的响应，使用干涉滤光器。
- 首先找到峰值波长。没有在光路（0.0 OD）ND滤镜，放置一个紫外线发射滤波器在光路上，并简要观察响应幅度。带有蓝色发射器，绿色发射滤波器，和一个红色发射滤波器，这应该得到在峰值响应将是一些想法重复。
- 在大约使用过滤器350，450，550，650纳米找到峰值灵敏度的一般地区步5.14.1。确切的波长并不在这个初始搜索阶段重要，因为所有波长将被记录在下一个步骤。如果估计存在峰值敏感性，或以前已记录的，使用一种称为波长快速识别峰值响应。
- 一旦峰值响应或接近它是确定的，在该波长为10回应（大约5秒）的记录。
- 在10纳米的步骤在峰值响应，记录与其他干扰滤波器的波长记录，从300-700纳米之后。从峰值开始，通过由一个从光路径中的一个交换过滤器出来（ 例如 ，如果峰值响应是在520nm，在该波长，然后再为510nm记录响应，随后530走出朝向两个短和更长的波长纳米，500纳米，540纳米，490纳米，550纳米，依此类推，直到没有没有响应）。
- 允许每个滤波器多达10反应（每5秒）。当交换干扰滤波器，使细胞RESPOND 1-2闪烁白光而不在光路中，有利于监测峰值响应是否随时间降解的任何过滤器。减少的响应的数量，或者如果发生漂白增加OD值。
- 如果在任何干涉滤光器的响应过于接近，在0的OD在白光下的最大响应，然后用ND滤镜衰减。干涉滤光器，并在该试验中使用的光缆的尺寸大大衰减的光的强度，因此，通常不需要ND滤镜。
- 如果记录仍然围绕峰值响应，其用作用于确认之前的响应幅度的pseudoreplicate并有助于确保的反应不会随时间劣化稳定，重新记录波长。一旦所有的波长都记录下来，再记录在ND系列下的反应，如在步骤5.12。
- 在录像过程中对软件完成后点击“停止”，并保存记录进行分析。
- 实验后，通过冷冻或冷却几分钟，随后通过快速切断的头部和破碎胸廓牺牲个人。
- 关闭所有设备。如果需要做分析之前在这里休息。
6.光谱灵敏度分析
- 与用于记录的原始响应的软件，计算的10个体反应的平均响应振幅在ND串联，并为每个干涉滤光器的每个滤光器。
- 创建响应对数强度（VlogI）从ND滤光器系列记录在步骤5.12-5.13（ 图7）的功能。通过绘制在X轴上强度（OD值），和响应的对数单位来在y轴上的每个强度做到这一点。
- 以导出在不同波长的细胞的光谱灵敏度，通常适合中落拉什顿方程从步骤6.2中的数据，并使用这个方程涉及不同波长吨实验获得的光谱响应以引发一个恒定波长根据该响应（在这种情况下，白光）需要O相对光子。
注：中落拉什顿方程为：V / V 最大 = I N /（I N + K n），其中我是刺激强度，V是响应振幅，V max是最大响应幅值，K为刺激强度给予半2V 以下 ，且n是指数斜率。各种方法可用于以适合该方程的VlogI数据，包括曲线拟合软件，或基于代码的统计软件包。 - 为了适应使用简单的计算和电子表格程序纳卡-拉什顿方程，变换VlogI响应数据的每个刺激强度：登录[（V 最大 / V） - 1]。然后对变换后的数据进行线性回归以获得最佳拟合的直线的方程。
注：v MAX必须比任何测量的响应越大;保持这种一致性，这种方法估计2V 以下为1％GRE亚特比最高测量的响应。 - 从回归直线的方程，估算通过采取负斜率的指数（n），并登录（K）= y截距/ N。
- 以导出在不同波长的细胞的光谱灵敏度，通常适合中落拉什顿方程从步骤6.2中的数据，并使用这个方程涉及不同波长吨实验获得的光谱响应以引发一个恒定波长根据该响应（在这种情况下，白光）需要O相对光子。
- 一旦参数为2V 以下 ，正和K已经估计，确定由在给定波长的测量的光谱响应堵塞如（Ⅴ）以引发在各波长下的细胞的光谱响应需要的光子和解决的相对数对于一
- 通过对每个干涉滤光器（来自步骤2.4.3）在各波长下的校正因子相乘，从步骤6.3所计算的刺激强度（I）。
- 为了得到灵敏度，使他们可以比较所有的强度必须与在V日志-I曲线。通过与每个波长强度½2V 以下或K做到这一点，在步骤6.2.3计算。
- 减去每个波长校正强度（步骤6.4）从K.
- 然后，对每个波长强度，添加此“距离K“值，K和乘以（-1）。
- 下一个带由在该系列的每个波长增加的最低数据点的绝对值阳性的所有数据点。
- 通过采取所有新计算强度的倒数从步骤6.5.1查找在每个波长的灵敏度。转换数据，以使灵敏度光谱落在0和1之间。
- 从相同类型的平均一个以上的小区记录的最后应答和情节与标准误差条或95％置信区间（ 图8）之后。
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Representative Results
用于记录设置的许多元素，书面说明不提供足够的细节。 图1是涉及完整记录设置的组件的示意图。在图2中，光谱被绘制为白光和各干涉滤光器，得到为什么需要校正因子的感觉和所需要的计算这个校正。 图3显示了照片，并且用于这些的万向臂的图实验。 图4是示出在记录阶段和显微操作的合成图像。 图5示出了在实验蝴蝶的制备几个步骤。
一旦记录开始，响应于光闪光的电压的负变化意味着该电极是一个细胞外，如在图6a。该反应的强度依赖于电极的附近提示要感光细胞，和光闪烁的入射角。响应要大（> 30毫伏）前尖足够 接近细胞刺穿。 图6B显示了一个明确的去极化响应光刺激，标志着进入感光细胞。静息电位应该是稳定的，并响应振幅要大（至少40毫伏），虽然绝对振幅可以有很大的变化。我们测量相对的反应，所以它更重要的是，信噪比是高的。如果大大静息电位的变化时，响应的波形看起来异常，或最大响应太低，然后比较相对响应在所有干扰滤波器变得不可能。不可记录的例子示于图6c，6d中 。
完成一个成功的记录后，ND响应必须绘制和中落拉什顿公式应安装数据33，Shown 如图7所示 。这个数字是使用ND过滤器系列，不受任何干扰过滤器绘制。如果记录是稳定的，从ND滤光器系列中的数据应之前和试验之后类似。光谱灵敏度是由图7中的中落拉什顿方程拟合到VlogI情节，然后求解（Ⅰ）为在给定波长的每个响应（V）的测定，如在该协议的第6节的计算进行说明。
从单一的记录衍生光谱感光度的代表性示例在图8a绘出（请注意，此例示出了真实的计算出的数据，但峰被移位，因此这个结果是未公布的）。细胞类型可以通过以类似的波长峰值灵敏度并且灵敏度光谱的整体形状进行分类。然后类似的细胞类型进行平均，且平均灵敏度在Figu各波长绘制标准误差条重新8B。在昆虫中发现三种典型的细胞类型的光谱灵敏度示于图8c（大小和误差棒是从实际数据计算，但峰移位）。
图1：光路的记录组件组件的示意图 ，试样的设置，以及记录硬件表示。光学跟踪坐在法拉第笼外的板凳上， 氙 ，氙弧灯， 镉 ，冷凝器组件，LX，凸透镜，ND中性密度滤镜轮，CF，干涉滤光片，S，快门，LC，凹透镜， 钴 ，准直光束探测器，FO，光纤电缆。法拉第笼坐在在样品周围木凳。板凳坐在上面，但不接触振动隔离的大理石桌子底下。记录（RC）和参考（RF）电极被连接到探头（HS）。RC被导入眼（E）的和Rf被引入身体的另一部分。该探头是法拉第笼外的前置放大器（PA）设置的一部分。信号从通过Humbug的降噪（Hb）的前置放大器通过，并进入示波器（OS）。从示波器的信号通过PowerLab系统硬件（PLB）并进入膝上型计算机（CPU），其中它是由Labchart软件读通过。快门是由通过在示波器上的第二信道传递函数发生器（FG）的控制，并且还可以通过第二通道上的PowerLab系统硬件如果打算这个信号要被记录，以及被传递。
图2：白光和干涉滤光片的光谱用于计算校正因子的协议的步骤2.5测得的光谱显示从300至700纳米，对于白色光以及作为每个41干涉滤光器。每个干涉滤光器频谱与仅在光路中该过滤器测定。 Ť520对应于区域中的光谱峰值为520nm的过滤器下，和520对应于白色的光的强度在过滤器，520纳米的峰值波长。这些值在计算校正因子为每个过滤器（在此情况下520纳米），为在步骤2.6在协议中所述使用。
图3：用在实验中的万向接头臂周长的说明万向臂保持光缆和允许完全球形旋转角度调整，使光可以在向细胞被记录发病率的适当角度递送。 （A）俯视图。以一个角度（B）中从侧面看。数字对应于在所有面板的相同部分。 （1）的底板允许在水平面全圆形的旋转。 （2）垂直板可以在垂直平面中的臂的完整圆形旋转。 （3）本筒保持金属臂与末端的光纤电缆，它允许垂直于（2）的圆形旋转的第二竖直平面内。 （4）光缆被保持我N将在臂的端部，并且光被朝向在实验装置的检体的位置。
图4：在录像设置的组件所使用的 （A）塑料管来保存标本。 （B）该标本和管安装在平台的俯视图。 （C）与磁性底座（1）球和联合平台侧视图。参比电极保持不动用胶水和蜡的平台（2）的一面。参考电极缠鳄鱼夹和代替焊接，提供了一个固定区，其中所述探头参考电极可以夹（3）。 （D）电极下放大20倍一角。比例尺，25微米。 （E）级，电焊钳和微操作设置。的探头（1）被固定在该装置上方银记录线（2），并用鳄鱼夹参考电极（3）附连。电极支架（4）固定到手动显微（5）与低于一则讯息可以与用于垂直运动的旋钮来调整，或者可以推或拉的电极保持器的水平运动。与样品中的磁性平台位于上只是在电极保持器下方的阶段（6）。 （F）的法拉第笼围绕与可以或拉升在前面向下的画面记录设置。铝箔被放在所有设备的下方，顶部橡胶垫。光纤电缆（1）通入来自外部的光道的笼，并且由万向臂（2）朝向所述阶段（3）定向。该记录阶段，并操纵装置被放置在一个砂箱（4）搁在设置下一个大理石表。所有其他设备搁在板凳顶不触及大理石桌子。沙盒坐在大理石桌子上一个洞切出的木桌，使试样完全振动从木质桌面设备隔离。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：蝴蝶准备 （A）蝴蝶插入管和头部，翅膀，和天线被固定用热蜡。淡漠电极插入（1），一块干蜡用来按住腹部（2），以及一个湿纸巾被放置在检体背后的口器。 （B）的头部特写打蜡了。可以从（1）保持从蜡或碎片明确记录的眼睛，所述参考电极（2）被插入口器和热蜡迅速熔化在它保持它在适当位置。（C）的切入其中粉白色感光细胞层可以看到眼睛的空穴。黑色颜料和黄血是不存在的。 （D）放置在眼睛的玻璃记录电极（1），与无关电极标本侧面观（2）连接到头部阶段，应完成一个电路在示波器上所看到。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。
图6：从样本录制原始响应每个响应对应于50毫秒的持续时间（黑色条）的单光闪烁。 （A）应只看到大的负电压的变化的一个例子之前进入细胞。 （B）一个干净的记录应该不会有大的背景噪声和大去极化反应，通常至少40毫伏。 （C）一种差记录的一个例子，由于主峰（箭头）后的负电势变化。 （D）一种不良记录的另一个例子。静息电位正在经历大的波动（红色条）和大量背景噪声会掩盖响应（箭头）的幅度。
图7：响应强度数线性函数实心圆圈表示从3.5的小区的测量的响应为0的OD，对于这个实验装置。光强度是对数刻度。在非常高的强度的响应是饱和的，并且在非常低的强度的小响应仍然存在，而不是沿着线下降到零。 ŧ他中落拉什顿方程33被装配到该非直线形状（虚线）。
图8：光谱灵敏度的例子 （A）单个代表性的细胞的反应，记录和相对光谱灵敏度计算。该单元的峰值在440纳米，这意味着它响应最好蓝光。单细胞数据可能看起来噪音（在380nm处峰值）。具有相同的相对峰值和形状（B）的细胞一起平均，并加入标准误差条。在这里，从七个人7片，蓝色细胞平均提供了强有力的证据表明，细胞类型在这个物种在440纳米的光敏感最大存在。 （C）的该过程可重复用于发现的所有类型的细胞，并绘制在一起。虫眼在他们的光谱灵敏度，但一个典型的插件有很大的不同等可能有如下所示的峰值，在370纳米，440纳米和510纳米。请注意，这些光谱灵敏度的使用真实数据的所有计算，但峰已被移位，因为数据还没有发表了此种。
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Discussion
细胞内记录可以是一个很难掌握的技术，由于涉及很多技术步骤。对于成功的试验几个要点必须加以考虑。首先，对具有在其上进行的实验的合适的振动隔离表是重要的。许多研究人员使用的空气的表，从而彻底桌面从基座分离，得到优异的振动隔离。我们设置包括在上面沙箱，在其中放置在显微/电极架/样品台设备厚厚的大理石桌子。这是一种有效的和更经济的替代空气表，特别是如果进入内部的气体或压缩的空气是一种限制。可以采取额外的减振措施，如被动式空气悬架，或增加减震元件到桌腿（ 例如 ，开网球，自行车管，厚凝胶垫）。另外，至关重要的是，实验装置是内法拉第笼一切正确接地。法拉第笼应具有在可录制时，笼子内工作时拆卸和更换容易的前一金属网筛。即使环境电噪声（从主交流电源特别是50 Hz的噪声），少量可以使一个本来很好的记录无法使用。
当准备围绕着小眼的标本，血淋巴和颜料层可能会妨碍成功的记录。如果在角膜孔切过大，在体内血淋巴的正常泵送使液体表面上下移动的切割位点，导致不稳定的记录。一旦孔被切断，血淋巴和表面颜料层会迅速凝结成甚至当用凡士林密封的不透痂，所以要尽快得到电极进入眼睛是很重要的。林格氏溶液，也可以用来代替凡士林。接地电极可被引入到口器或进入一个切口天线的树桩。
此外，它经常是有益的，以保持动物为暗适应成为可能。对于此方法，步骤包括：保持记录室很暗，从氙气灯进入法拉第笼，持续时间短的刺激闪烁（30-50毫秒），以及闪烁（0.5或更大）之间的足够低的频率阻挡杂散光。当视色素吸收一个光子，视紫红质的发色团从11- 顺 -3- hydroxyretinal到所有开关- 反 -retinal，诱导视蛋白蛋白质的构象变化，和激活整复为变视紫质，从而启动了G蛋白级联。当高强度的光线会使发色团物理上视蛋白分离蛋白发生光漂白。时间是在这个实验中的限制因素，因为该电极将仅稳定地记录来自小区内的反应为在一定时间内它掉出来之前或膜被损坏。出于这个原因，我们不打破，使细胞恢复，但我们使用闪光灯持续时间和频率，我们发现没有随着时间的推移细胞的反应。它如果发生光致漂白降低光的频率和强度是重要的。
在录制过程中，由电极的大电极尖端或大运动可以穿透膜时损坏电池。只有细的提示（至少〜100兆欧）和小运动应该接近用于记录的细胞时，可以使用。如果细胞内记录被应用于其它应用，如脑录音，极其精细，坚固电极可以使用石英玻璃被拉出，但专门的拉出器必须用于这些电极。当第一使牵引程序的电极，我们通过回填电极，在模拟设定它固定到电极架，以及放置在盐水溶液中的端部和接地电极检查尖端电阻。 ñ分机我们应用于测量在示波器上的电压变化的电流。要移动，我们使用手动显微沿两个轴移动电极尖端。其它操纵存在包括数字那些允许运动沿着所有三个轴并且这些可被用于这个或更复杂的应用。有许多方法来建立用于记录的阶段，也有在记录中使用和分析所观察到的数据的许多不同类型的硬件和软件。我们设置代表记录台的一个简单，方便，实惠的设置。
在构建VlogI曲线，函数由仲和桨33和其他34,35帐户用于绘制响应的非线性的部分开发的。各种方法被用于适合此曲线的数据，和我们绘制不需要曲线拟合软件一种这样的方法的结果，但其他的方法也是适用的36,37 （
该方法的一个限制是，如果研究生物体表达的眼睛多个基因相似的视蛋白，它可以是难以确定哪个视蛋白的mRNA可能对应于哪个频谱类感光细胞。为了克服这个问题，该方法已结合染料注射和原位杂交或免疫组织化学来成功地识别的视蛋白在记录单元10表示。
我们的方法很简单，研究人员不熟悉视觉电生理访问。这种技术是在神经科学常见，但具体的和明确的方法是不存在于文献中，使这种方法难以再现。尽管存在这种技术的许多变型，我们提供测量复眼光谱灵敏度的简单方法。生理数据的证据视觉生态学和进化41的故事的重要棋子。视蛋白序列变异与感光细胞的敏感性有着密切的联系，使得对于研究探讨的表型改变的遗传基础这种方法的理想。感光细胞的敏感性的测定也可以与行为颜色辨别测定法配对，表示重要鉴别阈值中辨色42-46的生理基础。在果蝇基因或治疗操作为例，这件Technique可以测量眼睛或脑部以及47,48的适当的生理功能的好方法。虽然我们不是第一或细胞内记录的眼睛最复杂的方法，我们的希望是，我们可以使这种方法更容易获得正式的神经外复制和整合的研究项目。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢已故的鲁迪·林堡制造的万向臂周长，金佰利贾米森，马修麦克亨利和拉朱Metherate借给我们设备和Almut Kelber和有川太郎，以资鼓励。这项工作是由美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金给KJM和美国国家科学基金会资助IOS-1257627亚行支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
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