Summary
La technique électrophysiologique de l'enregistrement intracellulaire est démontrée et utilisée pour déterminer les sensibilités spectrales des cellules photoréceptrices unique dans l'œil composé d'un papillon.
Abstract
l'enregistrement intracellulaire est une technique puissante utilisée pour déterminer comment une seule cellule peut répondre à un stimulus donné. Dans la recherche de la vision, l'enregistrement intracellulaire a été historiquement une technique couramment utilisée pour étudier la sensibilité des cellules photoréceptrices individuelles à différents stimuli de lumière qui est encore utilisé aujourd'hui. Cependant, il reste un manque de méthodologie détaillée dans la littérature pour les chercheurs qui souhaitent reproduire des expériences d'enregistrement intracellulaire dans les yeux. Nous présentons ici l'insecte comme un modèle pour l'examen de la physiologie de l'œil plus généralement. cellules photoréceptrices insectes sont situés près de la surface de l'œil et sont donc faciles à atteindre, et bon nombre des mécanismes impliqués dans la vision sont conservés à travers embranchements des animaux. Nous décrivons la procédure de base pour l' enregistrement in vivo intracellulaire de cellules photoréceptrices dans l'œil d'un papillon, avec le but de rendre cette technique plus accessible aux chercheurs ayant peu d' expérience dans l' electrophysiology. Nous introduisons l'équipement de base nécessaire, comment préparer un papillon vivant pour l'enregistrement, comment insérer une microélectrode de verre dans une seule cellule, et, enfin, la procédure d'enregistrement lui-même. Nous expliquons également l'analyse de base de données de réponse premières pour la détermination de la sensibilité spectrale de types de cellules individuelles. Bien que notre protocole met l' accent sur la détermination de la sensibilité spectrale, d' autres stimuli (par exemple, la lumière polarisée) et les variations de la méthode sont applicables à cette configuration.
Introduction
Les propriétés électriques des cellules telles que les neurones sont observées en mesurant le flux d'ions à travers les membranes cellulaires comme un changement de tension ou de courant. Une variété de techniques électrophysiologiques ont été développés pour mesurer des événements bioélectriques dans les cellules. Neurones trouvés dans les yeux des animaux sont accessibles et leurs circuits sont souvent moins complexes que dans le cerveau, ce qui rend ces cellules de bons candidats pour l'étude électrophysiologique. Les applications courantes de l' électrophysiologie dans l'œil comprennent électrorétinogramme (ERG) 1,2 et microélectrodes enregistrement intracellulaire. ERG consiste à placer une électrode dans ou sur l'oeil d'un animal, l' application d' un stimulus lumineux et en mesurant la variation de la tension en tant que somme des réponses de toutes les cellules voisines 3-6. Si l'on est particulièrement intéressé à la caractérisation des sensibilités spectrales des cellules photoréceptrices individuelles, souvent plusieurs types de cellules répondent simultanément à des forces différentes à un stimulus donné; ainsipeut être difficile de déterminer la sensibilité des types cellulaires spécifiques à partir des données ERG surtout s'il y a plusieurs types de cellules photoréceptrices spectralement similaires dans l'œil. Une solution potentielle est de créer transgénique Drosophila avec le gène photorécepteur (opsine) d'intérêt exprimé dans les cellules majorité R1-6 dans l'œil, puis effectuer ERG 7. Les inconvénients potentiels de cette méthode non à faible expression de la protéine de photorécepteur 8, et la longue période de temps pour la génération et le dépistage des animaux transgéniques. Pour les yeux avec moins de types de photorécepteurs spectralement distinctes, l' adaptation de l'œil avec des filtres colorés peut aider à abaisser la contribution de certains types de cellules à l'ERG, ce qui permet une estimation de la sensibilité spectrale maxima 9.
l'enregistrement intracellulaire est une autre technique où une électrode fine empale une cellule et un stimulus est appliqué. Les enregistrements d'électrodes seulement que indivLa réponse de la cellule idual de telle sorte que l' enregistrement à partir et à l' analyse de plusieurs cellules individuelles peut donner des sensibilités spécifiques des types cellulaires 10-14 physiologiquement différents. Bien que notre protocole se concentre sur l'analyse de la sensibilité spectrale, les principes de base de l'enregistrement intracellulaire avec des électrodes pointues sont modifiables pour d'autres applications. À l'aide d'une autre préparation d'un échantillon, par exemple, et en utilisant des électrodes de quartz acérées, on peut enregistrer de plus profondément dans le lobe optique ou d'autres régions du cerveau, en fonction de la question posée. Par exemple, le temps de cellules photoréceptrices individuelles 15 de réaction, l' activité cellulaire dans l'optique lobes 16 (lamina rachidien ou lobula 17), du cerveau 18 ou d' autres noyaux 19 peuvent également être enregistrées avec des techniques similaires, ou des stimuli de couleur peut être remplacée par une polarisation 20 -22 ou le mouvement des stimuli 23,24.
Phototransduction, le processus par lequel la lumièrel' énergie est absorbée et convertie en un signal électrochimique, est un trait commun à l' ancienne presque tous nos jours phylums animaux 25. Le pigment visuel trouve dans les cellules photoréceptrices et responsable de l'initiation est rhodopsine cycle visuel. Rhodopsine chez tous les animaux sont constitués d'une protéine opsine, un membre de la famille des récepteurs de G couplé à la protéine transmembranaire 7 et un chromophore associé qui est dérivé de la rétine ou une molécule similaire 26,27. Opsine séquence d'acides aminés et la structure chromophore affecter l'absorbance de la rhodopsine à différentes longueurs d'onde de la lumière. Lorsqu'un photon est absorbé par le chromophore de la rhodopsine est activé, initiant une cascade de protéine G dans la cellule qui conduit finalement à l'ouverture des canaux ioniques liés à la membrane 28. Contrairement à la plupart des neurones, les cellules photoréceptrices subissent des changements potentiels graduées qui peuvent être mesurés comme un changement par rapport à l'amplitude de la réponse à l'évolution des stimulus lumineux. Typiquement, une donnéetype de photorécepteur exprime un seul gène opsin (bien que des exceptions existent 8,10,29-31). Sophisticated vision des couleurs, du type trouvé dans de nombreux vertébrés et des arthropodes, est atteint d'un œil complexe de centaines ou des milliers de cellules photoréceptrices exprimant chacun un ou parfois les types de rhodopsine plus. L'information visuelle est capturé en comparant les réponses sur la mosaïque de photorécepteur via la signalisation neuronale aval complexe dans l'œil et le cerveau, ce qui entraîne la perception d'une image complète avec la couleur et le mouvement.
Après avoir mesuré les réponses d'une cellule premières photorécepteur à différentes longueurs d'onde de la lumière par enregistrement intracellulaire, il est possible de calculer la sensibilité spectrale. Ce calcul est basé sur le principe de Univariance, qui stipule que la réponse d'une cellule de photorécepteur dépend du nombre de photons qu'elle absorbe, mais pas sur les propriétés particulières des photons qu'il absorbe 32. Tout photon qui est absorbed par rhodopsine induira le même genre de réponse. Dans la pratique, cela signifie que première amplitude de la réponse d'une cellule augmentera en raison soit une augmentation de l' intensité lumineuse (plus de photons à absorber), ou à un changement de longueur d' onde vers son pic de sensibilité (probabilité plus élevée de rhodopsine absorber cette longueur d' onde). Nous faisons usage de ce principe dans les réponses cellulaires relatives à l'intensité connue et la même longueur d'onde à des réponses à différentes longueurs d'onde et la même intensité, mais la sensibilité relative inconnue. Les types de cellules sont souvent identifiées par la longueur d'onde à laquelle leurs pics de sensibilité.
Ici, nous montrons une méthode pour l'enregistrement et l'analyse de sensibilité spectrale des photorécepteurs dans l'œil d'un papillon intracellulaire, avec un accent sur qui rend cette méthode plus accessible à la communauté de recherche plus large. Bien que l'enregistrement intracellulaire reste courante dans la littérature, notamment en ce qui concerne la vision des couleurs chez les insectes, nous avons trouvé that descriptions de matériaux et de méthodes sont généralement trop courte pour permettre la reproduction de la technique. Nous présentons cette méthode dans le format vidéo dans le but de permettre sa réplication plus facile. Nous décrivons également la technique en utilisant un équipement facile à obtenir et abordable. Nous nous adressons à des mises en garde communes qui sont souvent pas signalés, qui ralentissent la recherche lors de l'optimisation d'une technique nouvelle et complexe.
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Protocol
Tous les animaux ont été traités le plus humainement possible. Les insectes ont été expédiés sous forme de pupes du Costa Rica entomologique Supply, Costa Rica.
1. Heliconius pupes soins
- Suspendre tous les pupes espacées 2-3 cm de distance dans une chambre humidifiée en utilisant des broches d'insectes.
- Après l'éclosion, permettent des ailes à sécher puis garder les papillons vivants pendant au moins 1 jour dans une chambre humidifiée et se nourrissent d'une solution diluée de miel par jour avant l'enregistrement.
- Diluer le miel avec de l'eau à une solution de miel de 20% en volume, et verser dans une boîte de Pétri peu profonde.
- Amener les papillons individuels à la boîte de Petri, une par une. En touchant la solution avec leurs tarses avant, les papillons prolongeront automatiquement leurs proboscis et boire de la boîte de Pétri. Si leur rostre ne se prolonge pas automatiquement, utilisez une pince pour tirer la trompe sur et l'introduire à la solution de miel.
2. Optique Piste, Calibration et Measurestion des Conditions expérimentales légères
- Placez un W Xenon lampe à arc 150 avec boîtier et alimentation universelle et une lentille condenseur ensemble attaché à une extrémité d'une table au moins un mètre de long pour fournir de la lumière blanche et brillante.
ATTENTION: les lampes à arc xénon produisent une lumière extrêmement brillante avec des intensités UV fortes. Des lunettes de protection doivent être portés en tout temps et la lampe doit être utilisé selon les instructions du fabricant pour empêcher l'accumulation d'ozone causée par l'interaction de la lumière UV avec l'oxygène atmosphérique. - Mettre en place une optique piste d' un mètre de longueur pour la lumière sortant de l'ensemble de logements pour passer à travers (Figure 1).
- Place dans l'ordre suivant sur la piste optique avec des distances approximatives d'intervalle: 1) une silice convexe ou lentille de quartz de 40 cm de l'ensemble de condenseur, 2) une roue de filtre de densité neutre (sans filtre actuellement dans le chemin de lumière) 22 cm plus long la piste, 3) un obturateur avec l'unité d'entraînement 14 cm du filtre NDs, 4) une silice ou de quartz lentille concave de sonde de faisceau immédiatement adjacent suivant l'obturateur, et 5) une collimation 6 cm plus long bout de la piste.
- Apposer un câble à fibre optique 600 um de diamètre à la sonde de faisceau de collimation.
Remarque: En fonction de l'intensité lumineuse, un câble de fibre optique de diamètre 5-10 mm peut être nécessaire pour fournir suffisamment de lumière pour d'autres préparations et peut être substitué pour cela. - Régler la distance, la hauteur et l'angle de chaque élément optique, de sorte que le faisceau lumineux sortant de l'ensemble est à l'intensité la plus élevée possible.
- Comme éléments de piste optiques peuvent différer légèrement avec des applications différentes, veiller à ce que tous les éléments transmettent la lumière dans l'UVA et visible (315-700 nm).
- Une fois que la piste optique est assemblé, mesurer la lumière qui passe à travers l'installation à l'aide d'un spectromètre. Calibrer le premier spectromètre utilisant une lampe d'étalonnage avec un spectre connu et le logiciel du fabricant.
Remarque: Nous décrivons la configuration suivante en utilisant des produits Ocean Optics pour plus de clarté , mais d' autres fabricants (par exemple, Avantes) vendons des produits comparables.- Allumer la lampe de calibration de tungstène au moins 45 minutes avant de prendre des mesures.
- Pour calibrer, attacher le spectromètre via USB à un ordinateur avec le logiciel associé installé. Puis connecter le spectromètre à la lampe de calibration de tungstène au moyen d'un émetteur cosinus correcteur UV-visible.
- Sélectionnez "New Absolute Irradiance Measurement" dans l'onglet "Fichier", puis sélectionnez le spectromètre comme la «Source».
- Suivez les instructions pour créer un étalonnage nouveau "cal" fichier. Lorsque vous êtes invité, charger le fichier de données fourni pour le spectre connu de la lampe d'étalonnage de tungstène dans la gamme de la lumière visible (300-800 nm) dans le logiciel, qui calcule automatiquement le spectre corrigé de la sortie du spectromètre.
- Enregistrez le fichier d'étalonnage. Chargez ce fichier lorsque initializing le logiciel pour toutes les mesures futures de spectres lumineux en utilisant le spectromètre.
- Une fois que le spectromètre est calibré, l'utiliser pour enregistrer les spectres de lumière à partir du dispositif expérimental. Au-delà lorsque le logiciel est ouvert, sélectionnez "Nouveau Absolute Irradiance Mesure" et charger le fichier d'étalonnage préalablement enregistré. Prenez ensuite un spectre sombre en bloquant toute la lumière au spectromètre.
- Avec le spectromètre mesure actuellement les conditions expérimentales souhaitées de lumière, régler le temps d'intégration (4 msec), numérisations en moyenne (5), et la largeur de wagon (5), de sorte que le spectre est correctement mis à l'échelle et lissées. Conserver les paramètres de la même pour toutes les mesures spectrales de sorte que les intensités lumineuses des différentes mesures peuvent être comparées.
- Mesure des spectres pour la lumière blanche sans atténuation, pour tous les filtres de densité neutre à utiliser au cours des expériences, et pour chaque filtre d'interférence passe - bande (Figure 2).
- Mesure le spectre de la lumière blanche sans filtres dans le trajet de la lumière par l'apposition de l'extrémité libre du câble à fibre optique de l'étape 2.2.2 vers le spectromètre. Avec le fichier d'étalonnage chargé de l'étape 2.3, enregistrer le spectre de la lumière blanche en utilisant le logiciel du spectromètre comme un fichier texte.
Remarque: Les spectres enregistrés au format texte dans une liste de la longueur d'onde (coordonnées x) dans une colonne et l'intensité de la lumière (y coordonnées) dans la deuxième colonne, de sorte que les données peuvent être chargées dans un tableur à l'étape 2.6. - En utilisant la même configuration que l'étape 2.5.1, enregistrer le spectre de chaque densité optique (DO) (0-3,5 DO) utilisé au cours d'expériences en faisant tourner la densité neutre (ND) roue de filtre dans la piste optique, et enregistrez le fichier texte pour chaque OD.
- En utilisant la même configuration que l'étape 2.5.1, placez le filtre 10 nm demi-interférence de la bande passante, un par un dans le chemin de lumière et d'enregistrer le spectre observé pour chaque filtre. Répétez cette procédure pour chacun des 41 filtres d'interférence différents wtransmittances ième pics espacés tous les 10 nm de 300 et 700 nm. Filtres plus espacés (20 nm) sont acceptables pour la plupart des applications (pour les spectres, voir la figure 2).
- Mesure le spectre de la lumière blanche sans filtres dans le trajet de la lumière par l'apposition de l'extrémité libre du câble à fibre optique de l'étape 2.2.2 vers le spectromètre. Avec le fichier d'étalonnage chargé de l'étape 2.3, enregistrer le spectre de la lumière blanche en utilisant le logiciel du spectromètre comme un fichier texte.
- Corriger les différences d'intensité de la lumière lorsque des filtres d'interférence sont placées dans le trajet lumineux. Chaque filtre d'interférence permet à un nombre différent de photons à passer, et de la faible transmission de certains filtres, il est difficile d'atténuer davantage l'intensité de telle sorte que tous les filtres permettent à un nombre égal de photons.
- Pour le calcul de l'intensité relative (I) pour chaque filtre d'interférence à bande passante 10 nm, de résoudre I dans l'expression, I = T / s, où T est l'aire sous la courbe spectrale de chaque filtre d'interférence 10 nm (de 2.5.3) et s est l'irradiance absolue (valeur y de fichier texte enregistré à partir de 2.5.1) au maximum de la lumière blanche à la longueur d' onde maximale de chaque filtre (voir la figure 2 pour un exemple à 520 nm).
- Divisez tout intensit calculés par la valeur d'intensité maximale calculée 2.6.1 pour normaliser l'une, et de prendre l'inverse des valeurs normalisées par rapport à l'utilisation en tant que facteur de correction appliqué à la sensibilité brute à chaque longueur d'onde (voir étape 6.4).
- Effectuer les étapes 2.1 à 2.6 qu'une seule fois avant une série d'expériences. Au cours d'une expérience d'enregistrer périodiquement l'irradiance absolue de la lampe à arc xénon sous une lumière intense et les filtres à densité neutre, pour vous assurer que l'intensité du stimulus lumineux ne change pas.
- Au cours d'une expérience, le cas échéant réponse cellulaire à la lumière transmise à travers les filtres d'interférence se rapproche de l'amplitude de réponse maximum, utilisez les filtres ND pour atténuer le signal. Si les filtres ND sont utilisés au cours d'une expérience, tenir compte de la diminution correspondante de l'intensité lors du calcul de la sensibilité spectrale.
- Mettre en place la piste optique, l'étalonnage et filtres jours ou semaines avant les expériences commencent. Gardez les filtrescouvert pour éviter l'accumulation de poussière.
3. Matériel d'enregistrement Setup
- Nourrissez le même câble de fibre optique utilisé pour l' étalonnage par une cage de Faraday et monter sur un dispositif de goniométrie tel qu'un périmètre de bras Cardan (voir la figure 3 pour le diagramme). Le câble sera d'environ 10 cm de l'oeil de l'échantillon.
- Placez une étape de métal sur une table vibrationally isolé avec un porte-électrode monté directement au- dessus de la scène sous le contrôle d'un micromanipulateur (Figure 4). Placez le bras Cardan de telle sorte que la tête de l'échantillon est au centre de la sphère créée par le mouvement de rotation du bras.
- En utilisant un système de pré-amplificateur intracellulaire, qui comprend un amplificateur (en dehors de la cage de Faraday) et le préamplificateur (headstage, près de la préparation à l'intérieur de la cage de Faraday) monter le headstage au-dessus de la phase métallique, où l'échantillon sera placé.
- Connectez un câble coaxial à la headstage via unconnexion BNC. Divisez ouvert seulement la pointe de l'autre extrémité du câble coaxial, et séparer la gaine métallique extérieure du câble du fil intérieur.
- Soudez la gaine extérieure (maintenue au potentiel de masse) à une extrémité d'un fil de cuivre isolé avec une pince crocodile à l'autre extrémité. Cette pince crocodile se joindre à l'électrode de référence métallique sur la plate-forme d'échantillon (étape 5.1.4).
- Soudez le fil intérieur du câble coaxial à un fil mince d'argent, pour servir l'électrode d'enregistrement. Ce fil doit être suffisamment mince pour être introduit dans l'électrode de verre solution remplie à l'étape 5.2.3.
- Placez un stéréomicroscope attaché à un bras oscillant et la base sur le banc de bois en dehors de la cage de Faraday, de sorte qu'il peut être basculé pour abaisser l'électrode dans l'œil, et balança retour à nouveau une fois l'électrode est dans l'oeil.
- Assurez-vous que tout ce métal à l'intérieur de la cage de Faraday est correctement mise à la terre.
- En dehors de la cage de Faraday, fixez le preamplifer à l'entrée d'un réducteur de bruit de 50-60 Hz (en option), et connectez la sortie à un canal d'un oscilloscope à l'aide d'un adaptateur en T BNC.
- En utilisant l'autre extrémité de l'adaptateur en T, connecter le signal passant par l'oscilloscope à un canal du matériel. Attachez ce matériel à un ordinateur par un câble USB, ce qui permettra des réponses enregistrées avec le préamplificateur à être lus par le logiciel sur l'ordinateur.
- Fixer le conducteur de l'obturateur de la piste optique pour le second canal de l'oscilloscope en utilisant un autre adaptateur en T et le raccorder à un générateur d'impulsions qui va contrôler la fréquence et la durée des flashs lumineux livrés à l'oeil (étape 5.5).
Remarque: le programme d'installation de la plate-forme elle-même ne devrait être fait une fois. Casser ici jusqu'à ce que prêt à commencer les enregistrements.
4. Préparation au Jour de l'enregistrement
- Allumez la lampe au xénon au moins 45 min avant l'expérience et tourner sur l'extracteur de microélectrodes de verre au moins 30 min avant pulélectrodes de verre Ling.
- Allumez tous les équipements d'enregistrement (obturateur, amplificateur, bruit éliminateur, générateur d'impulsions, oscilloscope, et l'acquisition de données hardware) et assurez-vous que l'obturateur est fermé par défaut donc pas de lumière passe à travers le câble à fibre optique.
- Pull borosilicate fine (ou aluminosilicate) microélectrodes de verre (100-250 résistance à la MQ est idéal) à l'aide d'un extracteur de microélectrodes de verre. Utiliser des électrodes de verre en seulement quelques heures d'être tiré.
- Remblayer les électrodes avec 3 M de chlorure de potassium (KCl). Notez que cette solution peut être modifiée en fonction des besoins du chercheur, par exemple colorant injection.
5. Spécimen Prep et de la procédure d'enregistrement
- Préparer le spécimen
- Apposer un papillon individu à l'intérieur d'un petit tube en plastique avec de la cire chaude pour la tête est immobile et faisant saillie d'une extrémité du tube. Cirer bas proboscis, les antennes et les ailes (figure 5).
- Maintenez til abdomen avec un morceau sec de cire et de garder le tube humidifié en plaçant un tissu humide dans le tube derrière l'abdomen. Assurez-vous que l'échantillon est complètement immobile.
- Monter le tube à l'aide d'un petit morceau de cire sur une petite plate-forme avec un joint à rotule et douille qui est attaché à une base magnétique.
- Sous un microscope à dissection, insérer un fil d'argent d'un diamètre de 0,125 mm dans la tête par l'intermédiaire des pièces buccales pour être utilisé comme l'électrode de référence. Avant l'expérience, fixer définitivement le fil à la plate-forme d'une manière telle que le fil de cuivre dans l'étape 3.3.2 peut clipser sur elle une fois que la plate-forme est placée sur la scène pour l'enregistrement.
- Une fois que l'électrode de référence est dans une position appropriée, il peut être maintenu en place par la fonte rapidement, puis la cire de refroidissement autour du fil.
- En utilisant une lame de rasoir en acier au carbone cassable, poignée partie de la lame avec un porte-lame et de briser un petit morceau à utiliser pour couper la cornée.
- Coupez un petit trou (~ 10 ommatidiun diamètre) dans la cornée gauche en utilisant le razorblade et sceller le trou avec de la vaseline pour éviter la dessiccation.
- Une fois que la cornée est coupée, insérez l'électrode d'enregistrement dans l'oeil le plus rapidement possible parce que hémolymphe dans l'oeil va rapidement durcir et rendre impossible l'insertion d'une électrode. Si possible effectuer la dissection dans la plate-forme où l'enregistrement aura lieu.
Remarque: Vaseline ne doit pas être étalé sur le reste de l'œil comme cela défocalisation l'optique.- Si pas déjà sur la scène, placez le spécimen monté et la plate-forme sur la scène de la plate-forme d'enregistrement. Connectez le fil de terre headstage de l'étape 3.3.2 à l'électrode de référence sur la plate-forme d'échantillon à l'aide des pinces crocodiles.
Remarque: Si possible utiliser un filtre rouge pour éclairer l'animal. - Utilisez une source de lumière avec des pièces jointes à col de cygne à la lumière brièvement l'échantillon sous un stéréoscope tout en abaissant l'électrode d'enregistrement dans l'oeil.
- DansSeRT le fil d'argent relié à la headstage de l'étape 3.3.3 dans la solution de KCl dans le dos d'une microélectrode de verre. Monter l'électrode de verre sur le porte-électrode.
- Ajuster le porte-électrode de sorte que le micro-électrodes se trouve directement sur le trou préalablement découpée dans la cornée, d'environ un millimètre au-dessus de la cornée. Abaisser le microélectrodes dans l'oeil à l'aide du micromanipulateur jusqu'à ce qu'un circuit est terminé, comme indiqué par un grand changement de potentiel (mV) sur l'oscilloscope.
- Si pas déjà sur la scène, placez le spécimen monté et la plate-forme sur la scène de la plate-forme d'enregistrement. Connectez le fil de terre headstage de l'étape 3.3.2 à l'électrode de référence sur la plate-forme d'échantillon à l'aide des pinces crocodiles.
- Une fois dans l'œil, balancer le stéréoscope en dehors de la cage de Faraday, et éteindre la source de lumière éclairant l'échantillon. La chambre doit être maintenue sombre afin que l'œil devient sombre adapté.
- Vérifier la résistance de l'électrode par application d'un courant de 1 nA par l'amplificateur et en notant la variation de tension. La résistance doit typiquement dans la plage comprise entre 100-250 MQ. des résistances plus élevées sont une indication de blocage ou de flexion de l'électrode, et de faibles résistances électriquerupture ode.
- Activer le générateur d'impulsions de sorte que le volet ouvre permettant un flash de lumière d'une durée msec 50 toutes les 0,5 secondes, et lui permettre de continuer à clignoter pendant toute la durée de l'expérience.
- Ajuster le générateur d'impulsions de sorte qu'il permet clignote jusqu'à 50 msec. Cette durée et 0,5 secondes de pause entre les flashes maintient le spécimen le plus près à l'obscurité adaptée que possible au cours de l'expérience. Cinquante msec est proche de la durée la plus courte de flash qui permettra d'obtenir la même amplitude en réponse que des durées plus longues flash.
- réponses Re-mesure à la fois le début et la fin de l'expérience (étape 5.16). Au cours d'environ une expérience de vingt minutes, ces réglages du flash ne dégradent pas la réponse au fil du temps. Différentes préparations peuvent nécessiter des ajustements à ces réglages du flash.
- Positionner le bras de cardan de telle sorte que le câble à fibres optiques est dirigé vers l'oeil.
- Vérifiez l'oscilloscope pour le changement de tension à chaque flash de lumière.Une variation négative de la tension signifie que l'électrode n'a pas encore entré dans une cellule.
- Déplacer le bras de cardan autour de l'échantillon jusqu'à ce qu'il soit positionné à un angle par rapport à l'oeil au cours de laquelle il existe une réponse à la tension maximale.
- Tourner le micromanipulateur avant et en arrière, provoquant de très petits mouvements verticaux de l'électrode dans les deux directions tout en tapotant légèrement la base du porte-électrode ou en utilisant la fonction Buzz sur le préamplificateur. Continuer de faire des petits ajustements jusqu'à ce qu'une réponse à la lumière de dépolarisation apparaît sur l'oscilloscope (figure 6).
- Ajustez à nouveau le bras Cardan pour trouver l'angle d'incidence où un flash de lumière produit le plus grand signal de dépolarisation. Faire de petits ajustements avec le micromanipulateur et utiliser la fonction de Buzz sur l'amplificateur que nécessaire pour faire en sorte que l'électrode est stable enregistre la cellule et qu'il restera dans la cellule pour l'ensemble de l'expérience (voir l'étape 5.11).
- Une fois que la configuration est stable, commencez recording. Un enregistrement stable devrait avoir peu ou pas de changement dans le potentiel, à faible bruit de fond, et une constante grande réponse de dépolarisation au repos (au moins 10: 1 du signal à bruit).
- Exécutez le logiciel sur l'ordinateur, et de commencer une «nouvelle expérience», qui va ouvrir une fenêtre pop up avec quatre canaux.
- Ajuster l'échelle de tension dans le coin supérieur droit de la fenêtre du logiciel à 500 mV. Le premier canal affiche les réponses enregistrées à partir de l'électrode en temps réel, alors que le second canal enregistrera l'onde carrée produite par le générateur de fonction, si le signal est introduit dans le matériel d'acquisition de données via l'oscilloscope, montrant lorsque l'obturateur est ouvert . Les deux autres voies sont inutiles.
- Cliquez sur "Démarrer" dans le coin en bas à droite pour commencer l'enregistrement, et permettre au logiciel de fonctionner pendant la durée de l'expérience. Ajustez le zoom du x (temps) et y (tension) axes de sorte que les réponses sont claires.
- Tout d'abord, avec la lumière blanche, enregistrer jusqu'à 10 réponses individuelles avec la roue de filtre ND à 3,5 OD (environ 5-10 sec).
- Enregistrement suivant le même nombre de réponses à 3,3 OD, puis 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, etc. dans toutes les combinaisons jusqu'à 0,0 OD. Ces amplitudes de réponse à la série de filtres ND fournira la courbe d'intensité de réponse-log dans la section 6. Si le blanchiment se produit, utiliser moins de bouffées de stimuli lumineux au cours de l'expérience.
- Enregistrer la réponse de la cellule à toutes les longueurs d'onde, en utilisant des filtres d'interférence.
- D'abord trouver la longueur d'onde de crête. Sans filtres ND dans la trajectoire de la lumière (0,0 OD), placez un filtre de transmission UV dans la trajectoire de la lumière et brièvement observer l'amplitude de la réponse. Répéter l'opération avec un filtre bleu de transmission, un filtre de transmission vert, et un filtre de transmission rouge, ce qui devrait donner une idée de l'endroit où la réponse maximale sera.
- Utilisez les filtres à environ 350, 450, 550, 650 nm pour trouver la région générale de sensibilité maximale dansétape 5.14.1. La longueur d'onde exacte n'a pas d'importance dans cette phase de recherche initiale parce que toutes les longueurs d'onde seront enregistrées dans l'étape suivante. Si les estimations existent des sensibilités de pointe, ou ils ont été précédemment enregistrées, utilisation connue des longueurs d'onde d'identifier rapidement la réponse maximale.
- Une fois la réponse de pointe ou à proximité est identifié, record à cette longueur d'onde pour 10 réponses (environ 5 secondes).
- Après l'enregistrement à la longueur d'onde de réponse maximale, record avec les autres filtres d'interférence, 300-700 nm à 10 nm étapes. À partir de la pointe et de sortir vers les deux longueurs d' onde plus courtes et plus longues en échangeant les filtres hors de la trajectoire de la lumière , un par un (par exemple , si la réponse du pic est à 520 nm, fiche réponses à cette longueur d' onde, puis 510 nm, suivis par 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, et ainsi de suite jusqu'à ce qu'aucun il n'y a pas de réponse).
- Prévoir jusqu'à 10 réponses par filtre (5 sec chacun). Lorsque l'échange des filtres d'interférence, permettre à la cellule de respond à 1-2 éclairs de lumière blanche sans filtre dans le trajet de la lumière, ce qui est utile de vérifier si la réponse de crête se dégrade au fil du temps. Réduire le nombre de réponses ou d'augmenter la DO si le blanchiment se produit.
- Si la réponse sous un filtre d'interférence est trop proche de la réponse maximale sous une lumière blanche à 0 OD, puis atténuer avec des filtres ND. Les filtres d'interférence et de la taille du câble à fibre optique utilisé dans cette expérience atténuent fortement l'intensité de la lumière et ainsi de filtres ND sont généralement pas nécessaires.
- Si l'enregistrement reste stable, ré-enregistrer des longueurs d'onde autour de la réponse de crête, qui sert de pseudoreplicate pour confirmer amplitudes de réponse précédentes et contribue à assurer la réponse n'a pas dégradé au fil du temps. Une fois que toutes les longueurs d'onde sont enregistrées, ré-enregistrer les réponses en vertu de la série ND, comme à l'étape 5.12.
- Une fois que l'enregistrement est terminé, cliquez sur "Stop" sur le logiciel, et sauvegarder l'enregistrement pour l'analyse.
- Après une expérience, sacrifiez l'individu par congélation ou de refroidissement pendant plusieurs minutes, puis en rompant rapidement la tête et à l'écrasement du thorax.
- Arrêtez tous les équipements. Casser ici si nécessaire avant de procéder à l'analyse.
6. Analyse de sensibilité spectrale
- Avec le logiciel utilisé pour enregistrer les réponses brutes, calculer l'amplitude moyenne des réponses individuelles 10 de réponse pour chaque filtre de la série ND et pour chaque filtre d'interférence.
- Créer une intensité fonction de réponse-log (VlogI) de la série de filtres ND enregistrés dans les étapes de 5,12 à 5,13 (figure 7). Pour ce faire, en traçant unités log d'intensité (DO) sur l'axe X, et la réponse à l'intensité sur l'axe y.
- Pour calculer la sensibilité spectrale de la cellule à différentes longueurs d'onde, ajuster généralement l'équation Naka-Rushton aux données de l'étape 6.2, et d'utiliser cette équation pour relier les réponses spectrales obtenues expérimentalement de différentes longueurs d'onde to photons relatifs nécessaires pour obtenir cette réponse sous une longueur d'onde constante (dans cette lumière blanche de cas).
Remarque: L'équation Naka-Rushton est la suivante : V / V max = I n / (I n + K n), où I est l'intensité du stimulus, V est l'amplitude de la réponse, V max est l'amplitude de réponse maximale, K est le stimulus donnant l' intensité ½ Vmax et n est la pente exponentielle. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour adapter cette équation aux données VlogI, y compris la courbe logiciel d'adaptation, ou progiciels statistiques à base de code. - Pour adapter l'équation Naka-Rushton utilisant des calculs simples et un programme de tableur, de transformer les données de réponse VlogI pour chaque intensité du stimulus: log [(V max / V) - 1]. Effectuez ensuite une régression linéaire sur les données transformées pour obtenir l'équation de la droite de meilleur ajustement.
Note: V max doit être supérieure à toutes les réponses mesurées; de garder cette constante, cette méthode estime V max 1% greater que la réponse mesurée la plus élevée. - De l'équation de la droite de régression, estimer l'exposant (n) en prenant la pente négative, et log (K) = ordonnée à l'origine / n.
- Pour calculer la sensibilité spectrale de la cellule à différentes longueurs d'onde, ajuster généralement l'équation Naka-Rushton aux données de l'étape 6.2, et d'utiliser cette équation pour relier les réponses spectrales obtenues expérimentalement de différentes longueurs d'onde to photons relatifs nécessaires pour obtenir cette réponse sous une longueur d'onde constante (dans cette lumière blanche de cas).
- Une fois que les paramètres de V max, n et K ont été estimés, déterminer le nombre relatif de photons requis pour obtenir la réponse spectrale de la cellule à chaque longueur d' onde en branchant la réponse spectrale mesurée à une longueur d' onde donnée en (V) et la résolution pour I.
- Multiplier l'intensité du stimulus calculé (I) de l'étape 6.3 par le facteur de correction pour chaque filtre d'interférence (étape 2.4.3), à chaque longueur d'onde.
- Pour obtenir la sensibilité, toutes les intensités doivent être liées à la courbe de V log-I afin qu'ils puissent être comparés. Faites ceci en reliant chaque intensité de longueur d'onde à ½ V max ou K, calculé à l' étape 6.2.3.
- Soustraire chaque intensité de longueur d'onde corrigée (étape 6.4) de K.
- Ensuite, pour chaque intensité de longueur d'onde, ajoutez cette "distance de la valeur K "à K, et multiplier par (-1).
- apporter Suivant tous les points positifs en ajoutant la valeur absolue du point de données le plus bas de la série à chaque longueur d'onde de données.
- Trouver la sensibilité à chaque longueur d'onde en prenant l'inverse de toutes les intensités nouvellement calculées à partir de l'étape 6.5.1. Transformer les données de manière à ce que le spectre de sensibilité se situe entre 0 et 1.
- Après l' enregistrement de plus d'une cellule de la même moyenne de type les réponses finales et l' intrigue avec des barres d'erreur standard ou des intervalles de confiance à 95% (figure 8).
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Representative Results
Pour de nombreux éléments de la configuration de l' enregistrement, une description écrite ne fournit pas assez de détails. Figure 1 est un schéma des composants impliqués dans la configuration d'enregistrement complet. Dans la figure 2, les spectres sont tracés pour la lumière blanche et chaque filtre d'interférence pour donner une idée de la raison pour laquelle un facteur de correction est nécessaire et ce qui est nécessaire pour calculer cette correction. La figure 3 montre des photos et un diagramme du bras Cardan qui est utilisé pour ces les expériences. la figure 4 est une image composite montrant l'étape d'enregistrement et micromanipulateur. la figure 5 montre plusieurs étapes dans la préparation d'un papillon pour l'expérience.
Une fois qu'un enregistrement commence, une variation négative de la tension en réponse à un éclair de lumière signifie que l'électrode est à l' extérieur d'une cellule, comme dans la Figure 6a. La force de la réponse dépend de la proximité de l'électrodepointe vers une cellule de photorécepteur, et l'angle d'incidence de la lumière du flash. La réponse doit être grande (> 30 mV) avant la pointe est assez proche pour une cellule pour empaler. Figure 6b montre une réponse de dépolarisation clairement à un stimulus lumineux, ce qui signifie l' entrée dans une cellule de photorécepteur. Le potentiel de repos doit être stable et l'amplitude de la réponse doit être grande (au moins 40 mV), bien que l'amplitude absolue peut varier considérablement. Nous mesurons la réponse relative, il est donc plus important que le rapport signal sur bruit est élevé. Si le potentiel de repos des changements considérablement, la forme d'onde de réponse semble anormale, ou si la réponse maximale est trop faible, alors la comparaison des réponses par rapport à travers tous les filtres d'interférence devient impossible. Des exemples d'enregistrements inutilisables sont représentés sur la figure 6c, 6d.
Après avoir terminé un enregistrement réussi, les réponses de ND doivent être relevées et l'équation Naka-Rushton doivent être montés sur les données 33, shown à la figure 7. Cette figure est tracée en utilisant la série de filtre ND sans filtres d'interférence. Si l'enregistrement est stable, les données de la série de filtres ND devraient être similaires avant et après l'expérience. Sensibilité spectrale est déterminée par ajustement de l'équation Naka-Rushton à l'intrigue VlogI à la figure 7, puis résoudre pour (I) pour chaque réponse (V) à une longueur d' onde donnée, comme expliqué dans les calculs de la section 6 du protocole.
Un exemple représentatif de la sensibilité spectrale dérivée d'un enregistrement unique est tracée sur la figure 8a (s'il vous plaît noter que cet exemple montre des données réelles calculées, mais le pic a été déplacé que ce résultat est inédit). Les types de cellules peuvent être classés en fonction de sensibilité maximale à une longueur d'onde similaire et la forme globale du spectre de sensibilité. Types cellulaires similaires sont alors en moyenne et la sensibilité moyenne est tracée avec des barres d'erreur standard à chaque longueur d' onde dans Figure 8b. Les sensibilités spectrales des trois types cellulaires typiques , dans un insecte sont présentées dans la figure 8c (amplitude et les barres d' erreur sont calculées à partir des données réelles, mais les sommets sont décalés).
Figure 1:. Schématique des composants d' enregistrement des composants de la trajectoire de la lumière, spécimen configuration et matériel d' enregistrement sont indiqués. Piste optique est assis sur le banc de bois en dehors de la cage de Faraday. Xe, lampe à arc xénon, Cd, assemblage de condenseur, Lx, lentille convexe, ND, neutre roue de filtre de densité, Cf, filtre d'interférence, S, volet, Lc, lentille concave, Co sonde de faisceau de collimation, Fo, le câble à fibre optique. La cage de Faraday est situé sur l'banc en bois autour de l'échantillon. Le banc de bois se trouve au-dessus, mais ne touche pas la table de marbre vibrationally isolé dessous. Enregistrement (Rc) et référence (Rf) électrodes sont attachés à la headstage (Hs). Rc est introduit dans l'oeil (E) et Rf est introduit dans une autre partie du corps. Le headstage fait partie de la configuration préamplificateur (Pa) en dehors de la cage de Faraday. Le signal est transmis du préamplificateur à travers le réducteur de bruit Humbug (Hb), et dans l'oscilloscope (Os). A partir de l'oscilloscope le signal est passé à travers le matériel PowerLab (PLB) et dans l'ordinateur portable (uc) où il est lu par le logiciel LabChart. L'obturateur est commandé par un générateur de fonction (FG) qui est passé à travers un deuxième canal sur l'oscilloscope, et peut également être passé à travers un second canal sur le matériel Powerlab si ce signal va être enregistrée aussi.
Figure 2:. White Light et Interférences Filtre Spectra utilisées pour calculer les facteurs de correction Les spectres mesurés à l' étape 2.5 du protocole sont présentés 300-700 nm, pour la lumière blanche, ainsi que chacun des filtres d'interférence 41. Chaque spectre du filtre d'interférence est mesuré à l'aide seulement que le filtre dans le trajet lumineux. T 520 correspond à la zone située sous le spectre du filtre avec un pic à 520 nm et de 520 correspond à l'intensité de la lumière blanche à la longueur d' onde maximale du filtre, 520 nm. Ces valeurs sont utilisées dans le calcul des facteurs de correction pour chaque filtre (dans ce cas 520 nm), comme décrit à l'étape 2.6 dans le protocole.
Figure 3:. Description de l'Arm Perimeter Cardan utilisé dans les expériences Le bras Cardan maintient le câble à fibre optique et permet une rotation sphérique pleine et réglage angulaire de telle sorte que la lumière peut être livré à l'angle approprié d'incidence à la cellule en cours d' enregistrement. (A) haut en bas vue. (B) Vue du côté à un angle. Les numéros correspondent à la même partie dans tous les panneaux. (1) La plaque de fond permet une rotation complète circulaire dans le plan horizontal. (2) La plaque verticale permet une rotation circulaire complète du bras dans un plan vertical. (3) Ce cylindre maintient le bras en métal avec le câble à fibres optiques à la fin, et il permet à un second plan vertical de rotation circulaire perpendiculaire (2). (4) Le câble à fibre optique est maintenue in lieu à la fin du bras, et la lumière est dirigée vers l'emplacement de l'échantillon dans le dispositif expérimental.
Figure 4:. Des composants du programme d' installation d'enregistrement (A) Tube en plastique utilisé pour contenir l'échantillon. (B) Vue aérienne de la plate - forme sur laquelle l'échantillon et le tube sont montés. (C) Vue latérale de la plate - forme de boule et joint à base magnétique (1). L'électrode de référence maintenu immobile avec de la colle et la cire sur le côté de la plate-forme (2). L'électrode de référence enroulé autour de pince crocodile et soudé en place, fournissant une zone de fixation où l'électrode de référence headstage peut couper (3). (D) Electrode pointe sous un grossissement de 20x. Barre d'échelle, 25 um. (E) étape, porte-électrode, et la configuration de micromanipulateur. Le headstage (1) est fixé au-dessus de l'appareil avec lefil d'enregistrement d'argent (2), et l'électrode de référence avec pince crocodile (3) attachés. Le porte-électrode (4) est fixée à un micromanipulateur manuelle (5) avec un montant inférieur à celui peut être ajustée avec un bouton pour un mouvement vertical, ou peut être poussé ou tiré par un déplacement horizontal du porte-électrode. La plate-forme magnétique avec l'échantillon se trouve sur la platine (6) juste au-dessous du support d'électrode. (F) La cage de Faraday entoure la configuration de l' enregistrement avec un écran qui peut être tiré vers le haut ou vers le bas à l'avant. La feuille d'aluminium est placé sous tous les équipements avec des tampons en caoutchouc sur le dessus. Le câble à fibres optiques (1) conduit dans la cage de la voie optique à l'extérieur, et est dirigé par le bras de cardan (2) vers l'étape (3). L'appareil d'étage d'enregistrement et manipulateur est placé dans un bac à sable (4) reposant sur une table en marbre au-dessous de la configuration. Tout autre équipement repose sur le banc plateau en bois qui ne touche pas la table de marbre. Le bac à sable se trouve sur le dessus de la table de marbre dans un troucouper sur la table en bois, de sorte que l'échantillon est complètement vibrationally isolé de l'équipement sur la table en bois. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Papillon Prep (A) Le papillon est inséré dans le tube et la tête, les ailes et les antennes sont immobilisés avec de la cire chaude. L'électrode indifférente est insérée dans les pièces buccales (1), un morceau de cire sèche est utilisée pour maintenir le ventre (2), et un tissu humide est placé derrière l'échantillon. (B) Close-up de la tête vers le bas ciré. L'œil à enregistrer à partir de (1) est maintenu clairement la cire ou de débris, et l'électrode de référence (2) est inséré dans les pièces buccales et la cire chaude est rapidement fondu au-dessus pour le maintenir en place.(C) Un trou découpé dans l'œil où la couche rose-blanc cellulaire photorécepteur peut être vu. pigment noir et jaune hémolymphe sont absents. (D) Vue latérale de l'échantillon avec une électrode d'enregistrement de verre (1) placé dans l'oeil, et l'électrode indifférente (2) fixée à l'étape de la tête, qui devrait compléter un circuit comme on le voit sur l'oscilloscope. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:. Réponses premières à partir d' enregistrements d' exemples Chaque réponse correspond à un seul flash de lumière de 50 msec (barres noires). (A) Un exemple de la grande variation de tension négative qui doit être considéré simplementavant d'entrer dans une cellule. (B) d'enregistrement propre devrait avoir peu de bruit de fond et une grande réponse de dépolarisation, typiquement d'au moins 40 mV. (C) Un exemple d'un enregistrement de mauvaise qualité en raison du changement potentiel négatif après le pic principal (têtes de flèches). (D) Un autre exemple d'un mauvais enregistrement. Le potentiel de repos subit de fortes fluctuations (barre rouge) et la grande quantité de bruit de fond peut obscurcir l'amplitude de la réponse (flèche).
Figure 7:. Réponse intensité Fonction log-linéaire Les cercles pleins montrent les réponses mesurées d'une cellule de 3,5 à 0 OD, pour cette configuration expérimentale. L'intensité lumineuse est sur une échelle logarithmique. Aux très hautes intensités la réponse est saturé, et à de très faibles intensités une petite réponse persiste au lieu de tomber à zéro le long de la ligne. Tl' équation qu'il Naka-Rushton 33 est monté sur cette forme non-linéaire (ligne pointillée).
Figure 8:. Exemples sensibilité spectrale (A) les réponses d' une cellule unique représentant ont été enregistrées et la sensibilité spectrale relative a été calculée. Le pic de cette cellule est à 440 nm, ce qui signifie qu'il répond le mieux à la lumière bleue. les données simples cellulaires peuvent sembler bruyant (pic à 380 nm). (B) Les cellules avec le même pic relatif et la forme sont en moyenne ensemble et les barres d'erreur standard sont ajoutés. Ici, sept cellules bleues de sept individus ont été en moyenne fournissant des preuves solides qu'un type cellulaire existe dans cette espèce au maximum sensibles à la lumière à 440 nm. (C) Ce procédé peut être répété pour tous les types cellulaires trouvés et tracées ensemble. les yeux d'insectes varient considérablement dans leurs sensibilités spectrales, mais une ins typiquesect peut avoir des pics présentés ici, à 370 nm, 440 nm et 510 nm. Remarque, ces sensibilités spectrales sont toutes calculées à partir de données réelles, mais les pics ont été décalés, car les données ne sont pas encore publié pour cette espèce.
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Discussion
l'enregistrement intracellulaire peut être une technique difficile à maîtriser en raison des nombreuses étapes techniques impliquées. Pour les expériences réussies de plusieurs points importants doivent être pris en considération. Tout d'abord, il est important d'avoir une table bien vibrationally isolé sur lequel l'expérience est réalisée. De nombreux chercheurs utilisent des tables d'air, qui séparent complètement le dessus de table de la base, ce qui donne l'isolation des vibrations de qualité supérieure. Notre configuration implique une table de marbre d'épaisseur avec un bac à sable sur le dessus, dans lequel est placé l'appareil de stade micromanipulateur / porte-électrode / échantillon. Ceci est une alternative efficace et plus abordable pour une table d'air, surtout si l'accès au gaz à l'interne ou l'air comprimé est une limitation. Mesures d'absorption des vibrations supplémentaires peuvent être prises telles que la suspension de l' air passif, ou l'ajout d'éléments d'amortissement pour les pieds de table (par exemple, a ouvert des balles de tennis, des tubes de vélo, coussinets de gel épais). En outre, il est essentiel que le dispositif expérimental soit à l'intérieur d'unCage de Faraday avec tout la terre. La cage de Faraday doit avoir un tamis métallique à l'avant qui peut être retiré lorsque l'on travaille à l'intérieur de la cage et remplacé facilement lors de l'enregistrement. Même une petite quantité de bruit électrique ambiant (en particulier 50 de bruit Hz de la principale source d'alimentation en courant alternatif) peut faire un autre bon enregistrement inutilisable.
Lors de la préparation des couches de spécimens, hémolymphe et pigmentaires entourant le ommatidia peut empêcher de bons enregistrements. Si le trou de la cornée est découpée trop importante, le pompage normal de l'hémolymphe dans le corps provoque la surface du liquide à se déplacer vers le haut et vers le bas au niveau du site de coupure, ce qui entraîne un enregistrement instable. Une fois que le trou est coupé, hémolymphe et de surface des couches de pigment se coaguler rapidement en une croûte impénétrable, même lorsque scellé avec de la gelée de pétrole, il est donc important d'obtenir l'électrode dans l'œil le plus tôt possible. la solution de Ringer peut également être utilisé au lieu de la vaseline. L'électrode de masse peut être introduite dans lebuccales ou dans le moignon d'une antenne de coupe.
En outre, il est souvent utile de garder l'animal adapté à l'obscurité possible. Pour cette méthode, les étapes comprennent garder la chambre d'enregistrement très sombre, le blocage de la lumière parasite de la lampe au xénon de pénétrer dans la cage de Faraday, les bouffées de stimulation de courte durée (30-50 ms), et une fréquence suffisamment faible entre les éclats (0,5 ou plus). Lorsqu'un pigment visuel absorbe un photon, le chromophore dans la rhodopsine passe de 11- cis - 3-hydroxyretinal à tous - trans -retinal, ce qui induit le changement de conformation de la protéine opsine, et l' activation de l'ensemble du complexe métarhodopsine, qui initie la protéine G Cascade. Photo-blanchissement se produit lorsque la lumière de haute intensité provoque le chromophore de séparer physiquement de la protéine opsine. Le temps est un facteur limitant dans cette expérience parce que l'électrode ne stablement enregistrer les réponses de l'intérieur de la cellule pendant une certaine période de temps avant qu'il ne tombeou bien la membrane est endommagée. Pour cette raison, nous ne rompons pas permettre à la cellule de récupérer, mais nous utilisons une durée de flash et de la fréquence que nous avons trouvé ne dégrade pas la réponse de la cellule au fil du temps. Il est important de diminuer la fréquence et l'intensité de la lumière si la photo-blanchiment se produit.
Pendant l'enregistrement, une pointe d'électrode grand ou grand mouvement par l'électrode peuvent endommager la cellule lors de la pénétration de la membrane. Seuls les pointes fines (au moins ~ 100 MQ) et de petits mouvements doivent être utilisés à l'approche d'une cellule pour l'enregistrement. Si l'enregistrement intracellulaire est appliqué à d'autres applications, telles que les enregistrements du cerveau, extrêmement fines, des électrodes solides peuvent être retirés en utilisant le verre de quartz, mais un extracteur spécialisé doivent être utilisées pour ces électrodes. Lors de la première fabrication d'une électrode programme de traction, nous avons vérifié la résistance de pointe par remblayage l'électrode, en le fixant sur le porte-électrode dans une configuration simulée, et en plaçant la pointe et l'électrode de masse dans une solution saline. Nposte, nous avons appliqué un courant pour mesurer le changement de la tension sur l'oscilloscope. Pour déplacer la pointe de l'électrode, nous utilisons un micromanipulateur manuel qui se déplace le long de deux axes. D'autres manipulateurs existent, y compris ceux numériques qui permettent le mouvement le long des trois axes et ceux-ci peuvent être utilisés pour ce ou plus complexes applications. Il y a plusieurs façons de construire un stade pour l'enregistrement, et il y a beaucoup de différents types de matériels et logiciels utilisés dans l'enregistrement et l'analyse des données observées. Notre configuration représente une configuration simple, facile et abordable de la plate-forme d'enregistrement.
Dans la construction de la courbe VlogI, les fonctions développées par Naka et 33 Rushton et d' autres 34,35 compte pour les parties non linéaires des réponses tracés. Diverses méthodes sont utilisées pour adapter la courbe aux données, et nous avons tracé les résultats d'un tel procédé qui ne nécessite pas un logiciel d'ajustement de courbe, bien que d' autres procédés sont également appropriés 36,37 (
Une limitation de cette méthode est que, si l'organisme d'étude exprime plus d'une opsine génétiquement similaires dans l'oeil, il peut être difficile d'identifier les ARNm opsine correspond probablement à quelle classe spectrale des cellules photoréceptrices. Pour surmonter ce problème, cette méthode a été combinée avec des injections de colorant et l' hybridation in situ ou une immunohistochimie pour identifier avec succès les opsines dans exprimées dans des cellules enregistrées 10.
Notre méthode est simple et accessible pour les chercheurs peu familiers avec électrophysiologie visuelle. Cette technique est courante dans les neurosciences, mais spécifique et des méthodes claires sont absents dans la littérature, ce qui rend cette méthode difficile à reproduire. Bien qu'il existe de nombreuses variantes de cette technique, nous offrons un moyen simple de mesurer la sensibilité spectrale dans l'œil composé. Les données physiologiques est un élément de preuve important dans les histoires de l' écologie et de l' évolution visuelle 41. variation de séquence Opsin est étroitement liée à la sensibilité d'une cellule de photorécepteur, ce qui rend cette méthode idéale pour les études portant sur la base génétique pour le changement phénotypique. Mesure de la sensibilité des cellules photoréceptrices peut également être couplé avec le comportement des tests de discrimination de couleur, montrant la base physiologique de seuils de discrimination importants dans la vision des couleurs 42-46. Dans les manipulations génétiques ou thérapeutiques chez la drosophile , par exemple, le technique peut être une bonne façon de mesurer la fonction physiologique correcte de l'œil ou du cerveau ainsi 47,48. Bien que la nôtre est pas la première ou la méthode la plus complexe de l'enregistrement intracellulaire dans les yeux, notre espoir est que nous pouvons rendre cette méthode plus facilement disponible pour la reproduction et l'intégration dans les programmes de recherche en dehors des neurosciences formelle.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions la fin Rudy Limburg pour fabriquer le périmètre de bras articulés, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, et Raju Metherate pour nous prêter le matériel, et Almut Kelber et Kentaro Arikawa, pour l'encouragement. Ce travail a été soutenu par une Fondation (NSF) Graduate Research Fellowship National Science à KJM et subvention NSF IOS-1257627 à la BAD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
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