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Medicine

Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

Con l'avvento dei -omica si avvicina la nostra comprensione delle malattie croniche come il cancro e la sindrome metabolica è migliorata. Tuttavia, efficace estrazione di informazioni contenute nei set di dati di grandi dimensioni che si ottengono da microarray di espressione genica, esperimenti di sequenziamento profonde o profili metabolici è essenziale per scoprire e quindi efficacemente indirizzare i regolatori critici del fenotipo delle cellule malate. Estrogen Receptor α (ERα) è uno dei fattori di trascrizione maestro che regolano i programmi genetici che sono importanti per i tumori al seno estrogeno sensibili. Al fine di comprendere il ruolo di ERα segnalazione in seno metabolismo del cancro abbiamo utilizzato i dati trascrittomica, cistromic e metabolomica da MCF-7 cellule trattate con estradiolo. In questa relazione abbiamo descritto la generazione di campioni per l'RNA-Seq, Chip-Seq e gli esperimenti di metabolomica e l'analisi computazionale integrativa dei dati ottenuti. Questo approccio è utile nel delineare romanzo talpameccanismi colari e circuiti gene regolatore che sono regolati da un particolare fattore di trascrizione che impatti il ​​metabolismo delle cellule normali o malati.

Introduction

Gli estrogeni sono importanti regolatori di molti processi fisiologici in entrambi i maschi e femmine, tra cui tessuti riproduttivi, tessuti metabolici, cervello e ossa 1. Oltre ai benefici effetti in questi tessuti, estrogeni guidare anche i tumori che derivano da mammaria e tessuti riproduttivi. Estrogeni lavorano principalmente attraverso ER per indurre effetti specifici tipo di cellula. sequenziamento profondo delle trascrizioni regolate da ERα utilizzando RNA-Seq e genome-wide ERα DNA analisi siti di legame con ChIP-Seq ha dimostrato di essere utile per capire come funziona ERα in diversi tessuti e tumori che ne derivano. Noi e altri abbiamo pubblicato profili di espressione genica associati a recettori diversi (ERα vs ERβ) 2,3, differenti ligandi 3-5 e diverse coregulators 2,4,6,7.

RNA-Seq è il metodo principale per esaminare il trascrittoma, offrendo una maggiore precisione ed efficienza rispetto a ba microarraygene sed analisi di espressione 8. RNA ottenuto da linee cellulari 2-4,7, tessuti o campioni di tumore sono in sequenza, mappato alle assemblee genomiche disponibili e geni differenzialmente regolati sono identificati. Immunoprecipitazione della cromatina (chip) è impiegato per sezionare il fattore di trascrizione e coregulator legame con noti siti di normative vincolanti cromatina. ChIP-Seq (ChIP seguita da alta sequenziamento rendimento) fornisce il rilevamento imparziale dei siti di legame a livello mondiale. Metabolomica è un altro approccio di sistema biologico sempre più utilizzato, che quantitativamente misure, risposta multiparametrica dinamica dei sistemi viventi a vari stimoli, tra cui i prodotti chimici e le perturbazioni genetiche.

Eseguendo profilo metabolico globale, una lettura funzionale può essere ottenuta da cellule, tessuti, e sangue. Inoltre, le informazioni da esperimenti trascrittoma non riflettono sempre i cambiamenti reali nel livello di enzimi che contribuiscono alla vie biochimiche. Combinatoanalisi dei dati trascrittoma e metaboloma ci permette di identificare e correlare i cambiamenti nell'espressione genica con i cambiamenti dei metaboliti attuali. Sfruttando le informazioni provenienti da tutti questi gruppi di dati su larga scala forniscono i dettagli meccanicistici per comprendere il ruolo dei fattori di trascrizione che regolano i sistemi biologici complessi, in particolare quelli che riguardano lo sviluppo e malattie come il cancro e il diabete umano.

La natura complessa del genoma dei mammiferi rende difficile integrare e interpretare i dati ottenuti dagli esperimenti trascrittoma, cistrome e metaboloma completamente. Identificare gli eventi di legame funzionali che avrebbe portato a cambiamenti nell'espressione dei geni bersaglio è importante perché una volta che i siti di legame funzionali sono identificati; conseguente analisi, tra cui vincolante di trascrizione (TF) analisi motivo, potrebbero essere eseguite con maggiore accuratezza. Questo porta alla identificazione di cascate TF biologicamente significativi e meccanismi. Comparis anche direttisu esperimenti RNA-Seq e Chip-Seq non sempre possibile in quanto i dati di ciascun esperimento sono diverse scale e rumori e in alcuni casi segnali significativi vengono oscurati dal rumore popolazione. Non siamo a conoscenza di alcun studio che integra le informazioni da questi tre approcci indipendenti ma collegati per capire la regolazione metabolica diretta da ERα nel cancro al seno. Pertanto, il nostro obiettivo generale di questo lavoro è di mettere in relazione gli eventi produttivi vincolanti alle espressione genica e le modifiche dei metaboliti. Al fine di raggiungere questo obiettivo, abbiamo integrato i dati da RNA-Seq, Chip-Seq esperimenti e metabolomica e individuato i estrogeni indotti ERα eventi che avrebbero portato a cambiamenti di espressione genica in vie metaboliche vincolante. Per la prima volta, mettiamo a disposizione un set completo di protocolli (Figura 1) per la generazione di ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolomica profiling e l'esecuzione di analisi integrativa dei dati per scoprire circuiti genici romanzo che regolano il metabolismo del senolinee cellulari di cancro.

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Protocol

1. Preparazione di campioni di RNA-Seq

  1. Colture cellulari e trattamento
    1. Cultura le cellule MCF7 in MEM Improved (IMEM) più medium fenolo-rosso con 10% di calore inattiva FBS, 1% di penicillina / streptomicina a 37 ° C in umidificata 5% CO 2 nell'atmosfera.
      Nota: linea cellulare stesso e condizioni di coltura cellulare viene utilizzato nel corso dello studio.
    2. Seed 100.000 cellule MCF7 per pozzetto in 6 pozzetti. Hanno triplicato per ogni trattamento. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 2 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 in ogni pozzetto. Incubare le piastre per 24 ore a 37 ° C in umidificata 5% CO 2 nell'atmosfera.
    3. Per raccogliere le cellule, aggiungere 1 ml di isolamento dell'RNA reattivo (acido guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio) in ciascun pozzetto e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Poi raccogliere il reagente lisato cellulare pipettando e deposito in provette da 1,5 ml
  2. Isolamento RNA
    1. Aggiungere 200 ml chloroform a 1 ml di lisato cellulare reattivo (1.1.3) e vortex per 10 secondi. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase acquosa (superiore) in una nuova provetta senza disturbare le altre fasi.
    2. Aggiungere 500 microlitri 100% di isopropanolo in un tubo con la fase trasferita-acquosa, e mescolare invertendo. Incubare a -20 ° C per una notte. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C. Osservare una pellet sul fondo della provetta. Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 750 microlitri RNasi-free 70% di etanolo da breve vortice.
    3. Centrifugare i campioni a 6.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e centrifugare il campione a 16.000 xg per 1 min a 4 ° C per raccogliere tutto l'etanolo residuo. Rimuovere l'etanolo residuo pipettando con una punta di gel-carico e impostare i tubi fino rivolto verso il basso per asciugare per 10 minuti. Sciogliere il pellet in 20-50 acqua DEPC trattati ul Depending delle dimensioni del pellet.
  3. Purificare l'RNA utilizzando RNA kit di pulizia seguendo il protocollo 4. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando un kit di test fluorimetria basato seguendo il protocollo 9.
    NOTA: OD a 260 nm è presa per determinare la concentrazione di RNA e il rapporto di OD a 260 nm e 280 nm sono utilizzati per determinare la purezza del campione. Si raccomanda il controllo della qualità RNA utilizzando test Bio-analizzatore.
  4. Prendere circa 0,5 a 1 mg di RNA purificato per il sequenziamento.
    NOTA: il centro Biotech prepara le librerie di sequenziamento ed esegue abbinato-end leggere sequenziamento utilizzando metodi precedentemente descritti 2.

2. Preparazione del campione ChIP-Seq

  1. Colture cellulari e trattamento
    1. Seed 500.000 cellule MCF7 ogni 10 cm Piatto in terreno di crescita.
      NOTA: Per ogni tirare verso il basso sono stati utilizzati 16 tavole. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 a ognipiatto. Trattare le cellule per 45 min (37 ° C in umidificata 5% CO 2 atmosfera).
  2. Reticolazione e Cell Harvest
    1. Aggiungere 250 microlitri 37% di formaldeide in 5 ml di mezzo di reticolare cromatina, incubare a temperatura ambiente per 15 min. Smettere di reticolazione lavando le cellule con 5 ml di ghiaccio freddo 1x MEM.
    2. Raccogliere le cellule in 250 microlitri cellulare Lysis buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-ossido dimethyldodecan-1-ammina) per piastra.
  3. La frammentazione della cromatina
    1. Sonicare le cellule per 30 sec x 8 a amplificatore di 30 per raggiungere dimensioni cromatina richiesti. Raffreddare ogni campione sul ghiaccio dopo una sonicazione di 30 sec.
    2. Centrifugare a 16, 000 xg per 10 min a 4 ° C, e con attenzione a pipetta il sopranatante senza disturbare il pellet sul fondo.
    3. Prendete una un'aliquota 5 ml del surnatante, e controllare la dimensione del DNA mediante elettroforesi attraverso 1,5% gel di agarosio come descritto in precedenza 10. La dimensione idealedi DNA deve essere compreso tra 200-500 bp.
  4. immunoprecipitazione della cromatina
    1. Risparmia il 25 microlitri di lisato cellulare come input. In un tubo da 50 ml, mescolare 4 ml di lisato cellulare con 20 ml di tampone di IP (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, e 0,5% Triton X), anticorpo ERα (500 microlitri F10 e 500 microlitri HC- 20), e 500 microlitri Prota e protg proteine ​​rivestimento sfere magnetiche. Incubare la miscela per rotazione a 4 ° C durante la notte per consentire la formazione di anticorpo chromatin-.
  5. Lavaggi e Reverse-reticolazione
    1. Utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline magnetiche sul lato magnetizzato per rimuovere il tampone di lavaggio.
    2. Lavare le perline magnetiche in 25 ml di tampone di lavaggio I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, e 150 mM NaCl). Per lavare accuratamente le sfere magnetiche senza disturbare complessi DNA-proteina, aggiungere 25 ml di tampone di lavaggio lentamente al tubo lungo il lato poi invertire i tubi fino a quando tutte le sfere magnetiche sono misti ben with il tampone di lavaggio senza apparire come una pallina. In alternativa, utilizzare il rotatore per invertire il tubo. Non vortice dei campioni. Lavare le perline magnetiche con lo stesso metodo nelle seguenti fasi.
    3. Lavare le perline magnetiche in 25 ml di lavaggio-buffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, e 500 mM NaCl).
    4. Lavare le sfere magnetiche in 25 ml di lavaggio-buffer III (1,6 mm EDTA, 10 mM Tris HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate e 250 mm LiCl).
    5. Lavare le perline magnetiche in 25 ml 1x tampone TE (1 mM EDTA e 10 mM Tris HCl) due volte.
    6. Eluire il DNA in 500 microlitri tampone di eluizione (1% SDS, e 10 mm NaHCO 3) e poi assegnare l'eluizione 500 microlitri DNA in 4 tubi. Per il DNA da ingressi, eluire il DNA in 125 microlitri tampone di eluizione.
    7. Incubare le provette a 65 ° C durante la notte su un blocco riscaldante. Coprire le provette sul blocco di riscaldamento con un foglio di alluminio per mantenere il calore anche su tutti i tubi. Mettere un peso sui tubi per impedire loro di apertura. </ Li>
  6. Isolamento del DNA
    1. Raffreddare le provette a temperatura ambiente per 5 min. Isolare il DNA da campioni di tirare verso il basso utilizzando il kit di isolamento DNA chip. Seguire le istruzioni del produttore.
      1. Riscaldare il tampone di eluizione a 65 ° C. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame per ogni provetta. Se le forme precipitato, aggiungere un altro tampone di legame 250 microlitri fino a quando la soluzione è chiara.
      2. Caricare il campione attraverso la colonna e centrifugare a 16.000 xg per 30 sec. Lavare il campione con 250 ml di tampone di lavaggio. Ricordarsi di aggiungere etanolo al tampone di lavaggio quando prima volta usarlo. Ripetere il lavaggio.
      3. Eluire il DNA in 15 microlitri tampone di eluizione. Combina il DNA della stessa tirare giù da 4 tubi per ottenere circa 55 ml di DNA.
    2. Isolare il DNA ingresso utilizzando un kit di purificazione del DNA.
      1. Riscaldare il tampone di eluizione a 65 ° C. Aggiungere 625 microlitri di buffer di legame in ogni provetta e incubare per 10 min. Caricare il campione attraverso la colonna in 2 ml collectisul tubo.
      2. Lavare il campione con 750 microlitri tampone di lavaggio, centrifugare a 16.000 xg per 1 min. Ripetere centrifugazione per eliminare ogni residuo di buffer. Eluire il DNA in 30 ml di EB.
    3. Misurare la concentrazione di DNA Utilizzando un commerciale Fluorocromo Assay con Modifica 11.
      1. Diluire il tampone TE 20x in 1x TE come tampone per diluire i campioni dei reagenti e del DNA. Prendere 5 ml DNA isolato e diluirlo in 50 ml di 1x TE.
      2. Da / DNA ml di soluzione 2 mg fare uno standard di DNA che vanno dal bianco per 1, 10, 100, 1000 mg / ml. In un piatto ben 96, allocare 25 ml di ogni standard così come la diluizione del DNA in duplice copia. (Si consiglia triplicato per standard.)
      3. Preparare il reagente di lavoro facendo una diluizione 200 volte da dsDNA reagente in tampone 1x TE in tubo di plastica. Coprire la soluzione reagente di lavoro con un foglio di alluminio per evitare la luce. Aggiungere 200 ml di reagente di lavoro in ogni campione. Incubate a temperatura ambiente per 5 min. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce.
      4. Misurare la fluorescenza dei campioni utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione a 480 nm, emissione 520 nm). Generare la curva standard del DNA di fluorescenza in funzione della concentrazione di DNA. Determinare le concentrazioni dei campioni in base alla curva standard generata DNA.
  7. Verifica della ChIP esperimento utilizzando qPCR
    1. Take 2 ml isolate DNA e diluito in 20 ml di acqua. Impostare la reazione qPCR in triplice copia mescolando 2,5 ml di diluizione del DNA, 5 ml Green I PCR Master Mix, 1 ml di primer, e 1,5 ml di acqua priva di nucleasi.
    2. Eseguire il qPCR con il sistema rapido Real-Time PCR utilizzando il seguente programma: Fase 1: 95 ° C per 60 sec, Fase 2: 95 ° C per 10 secondi, 60 ° C per 60 secondi, ripetere il punto 2 39 volte.
  8. Invia campione di DNA 10 ng per il centro Biotech per il sequenziamento.
    NOTA: Il Biotech Centro prepara il DNA ChIP in librerie in base alle istruzioni, ed esegue la sequenza singola lettura utilizzando metodi precedentemente descritti 2.

3. Metabolomica Assay Preparazione del campione

  1. Colture cellulari e trattamento
    1. Seed 400.000 cellule MCF7 ogni 10 cm Piatto in terreno di crescita. Per ogni trattamento preparare tre campioni. Utilizzare due piastre in ciascun campione per ricevere abbastanza cellule per la rilevazione. Il giorno 3, rimuovere il supporto e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza 10 -8 M E2 alle cellule. Trattare le cellule per 24 ore (37 ° C in umidificata 5% CO 2 atmosfera).
  2. Raccolta dei campioni
    1. Aggiungere 5 ml ghiacciata PBS 1x alla piastra, aspirare il PBS dopo breve inclinando la piastra più volte. Ripetere due volte, e rimuovere il più PBS possibile dopo l'ultimo lavaggio.
    2. Aggiungere 750 ml di acetone pre-freddo per ciascuna piastra e raschiare le cellule. Combinare le cellule in acetone da due piastre ain una provetta 2 ml su ghiaccio.
    3. conta delle cellule per la normalizzazione
      1. Per ogni trattamento, usare due piastre supplementari per la quantificazione delle cellule. Per de-fissare le cellule dalla piastra, aggiungere 2 ml di SE tampone (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO 3 e 1 mM EDTA) in ogni piatto e incubare per 5 min.
      2. Raccogliere e mescolare bene le cellule pipettando le cellule nel buffer HE. Utilizzare totale di 20 microlitri soluzione cella per contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
  3. Conservare i campioni a -80 ° C prima di inviare al centro Metabolomica di identificare e quantificare i metaboliti mediante gascromatografia spettrometria di massa (GC-MS) analisi.

4. Analisi Integrativa

  1. RNA-Seq Analisi dei dati:
    1. Eseguire il controllo qualità dei file FASTQ utilizzando FastQC: Leggi QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Selezionare FastQC: Leggere sotto lo strumento di NGS: QC e manipolazione. Carica il file di dati grezzi da histor correntey.
        NOTA: Si raccomanda di dare un titolo per il file di output per ricordare ciò che il lavoro è stato per dato che ci potrebbe essere più uscite.
    2. Esegui e apparirà il file di output sotto la Storia. Ripetere la stessa procedura per ogni file di sequenza. adattatori trim mediante clip in NGS: FASTX Toolkit.
    3. Allinea legge per hg19 utilizzando Tophat2 con RefSeq genoma di riferimento annotazione 12 (valori di default).
      1. Selezionare Tophat2 sotto strumento di NGS: analisi di RNA. Indicare libreria di tipo accoppiato (single-end vs abbinato-end).
      2. Carica il file di input FASTQ dalla storia attuale. Selezionare il genoma di riferimento. Scegliere le impostazioni predefinite. Oppure utilizzare l'elenco dei parametri completo da modificare.
      3. Esegui e produrrà due file di output: uno è UCSC LETTO traccia di raccordi; un altro è un elenco di allineamenti di lettura in formato BAM.
    4. Caricare file BAM di strumento di analisi dei dati di sequenziamento. Calcolare i valori di espressione utilizzando QuantStrumento ification.
    5. Identificare geni differenzialmente up-regolati utilizzando Expression Analysis Tool utilizzando i valori predefiniti e ripiegare il cambiamento> 2 e p-value <0.05. Allo stesso modo, identificare i geni differenzialmente down-regolato utilizzando Expression Analysis Tool utilizzando i valori predefiniti e ripiegare il cambiamento <0,5 e p-value <0.05.
  2. ChIP-Seq Analisi dei dati:
    1. Allineare FASTQ Legge di hg19 utilizzando Bowtie2 13 (valori di default) in Galaxy.
      1. Selezionare Bowtie2 sotto lo strumento di NSC: Mapping. Verificare se la libreria è mate-abbinato (single-end vs abbinato-end). Carica il file FASTQ dalla storia attuale.
      2. Selezionare il genoma di riferimento. Utilizzare le impostazioni dei parametri di default. Esegui e produrrà file di output con la sequenza mappata legge come file di BAM. Ripetere la procedura per ogni file di sequenza.
    2. Identificare i picchi che utilizzano MACS 14 un valore p di taglio del 6.0e-7 e FDR di 0,01, come descritto in precedenza 2.
    3. Metabolomica Analisi dei dati:
      1. Convertire nomi chimici dei metaboliti di KEGG_IDs.
      2. Identificare metaboliti differenziale regolamentati confrontando i livelli rilevati nel veicolo vs. E2 trattati campioni (2 volte cut-off è stato utilizzato in questo studio).
    4. Analisi Integrativa:
      1. Identificare i geni che hanno siti di legame ERα utilizzando lo strumento di analisi dei dati di sequenziamento. Tradurre Regioni alla funzione geni utilizzando 20 kb come distanza di cut-off.
      2. Identificare geni differenzialmente l'alto e verso il basso-regolato dalla analisi dei dati di RNA-Seq utilizzando cambiamento fold> 2 e ripiegare il cambiamento <0,5, rispettivamente, con il p-value <0.05 come tagliare. Confrontare l'elenco dei ERα sito di legame che contengono geni che utilizzano Venn confronto diagramma.
      3. Utilizzare questo elenco per identificare E2 vie metaboliche modulati utilizzando il modulo Metscape 15 di Cytoscape.
        1. Selezionando modulo Metscape da applicazioni, scegliere costruire una rete e poi pathway-basopzione ed.
        2. Selezionare l'Organismo (umano). Selezionare file di dati di E2 elenco composto non regolamentata (KEGG ID) e E2 up-regolata lista gene.
        3. Scegli Composto -Reaction -Enzyme-Gene come tipo di rete. Scegli composti / geni come la query.
        4. Costruire una rete. Ripetere con l'E2 down-regolato composto e geni.

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Representative Results

trascrittomica
Per analizzare i geni espressi in modo differenziale di trattamento E2, abbiamo scelto di eseguire un esperimento di RNA-Seq. Oltre a fornire informazioni sui livelli di mRNA, sequenze di Rna-Seq possono anche essere utilizzati per monitorare i cambiamenti (RNA lunghi non codificanti, microRNA) non codificanti RNA e gli eventi di splicing alternativo. Noi non forniamo informazioni sull'analisi dei geni non codificanti RNA o, in alternativa trascritte, in quanto la portata del nostro studio è quello di identificare i geni codificanti proteine ​​che sono importanti per la regolazione del metabolismo. Tuttavia, l'RNA-Seq è un ottimo modo per ottenere informazioni su eventi di espressione genica differenziale.

Per ottenere alta qualità legge, è importante per ottenere elevati RNA purezza. Dopo aver isolato l'RNA si purificò l'RNA utilizzando un kit di pulizia RNA. Purtroppo quasi il 50% del RNA è perso durante questo processo e la quantità di RNA di partenza dovrebbe essere preso in cNell'int ne in considerazione ottenere quantità richiesta (100-500 ng) entro la fine della fase di purificazione.

Abbiamo quantificato le rese di RNA utilizzando fluorimetro saggio RNA HS, che è molto preciso ed è il metodo preferito per la quantificazione di RNA a bassa abbondanza. Successivamente, l'integrità e la qualità complessiva dei campioni di RNA sono stati esaminati usando bioanlayzer, che è una valida alternativa per elettroforesi su gel usando una quantità minima di RNA. L'analisi mostra tutti i campioni hanno bande affilati e puliti di 18S e 28S rRNA indicanti l'integrità e la purezza dei campioni (Figura 2B). RNA Integrity Number (RIN) è stato utilizzato come standard per il controllo qualità dell'RNA. RIN 10 indica RNA intatto, RIN 6 parziale degrado e RIN3 degradati con forza 16.

Si raccomanda che il RIN deve essere di almeno 7 per esperimento sequenziamento. Tutti i nostri campioni di RNA ha ricevuto valore RIN tra 9,6-9,9 <strong> (Figura 2A). Librerie di sequenziamento sono stati costruiti da 500 ng di RNA di alta qualità da ogni campione utilizzando il sistema di sequenziamento ultra-high-throughput, come Illumina 2500. In media sequenziamento 18.000.000 di alta qualità letture sono stati ottenuti per ogni campione (Tabella 1), che era pronto per downstream analisi. Per controllare la qualità complessiva della sequenza di dati grezzi high-throughput, FastQC è stato eseguito per ciascun esempio legge. Un rapporto rappresentante FastQC per i dati di un veicolo RNA-Seq è stato mostrato (Figura 3). La lunghezza della sequenza dei più letture era di circa 100 bp (Figura 3A). Per ogni lettura, il punteggio di qualità è stato 32-34 per la prima 5 bp e 36-38 da 6-100bp (Figura 3B). Tra 17.990.863 letture generato da questo campione, la maggior parte di loro aveva il punteggio di qualità superiore 34 (Figura 3C). Il contenuto di GC per ogni lettura in sequenza anche seguito la distribuzione normale con una media del 48% GC. Nel complesso la qualitàpunteggio della legge era molto alto.

analisi Cistromic di siti di legame ERα
Per raggiungere il sequenziamento profondo efficiente, ottenendo frammenti di DNA con una dimensione desiderabile è uno dei fattori importanti. Approcci di sequenziamento correnti possono avere esigenze diverse sui frammenti di DNA, per esempio 300-600 bp per il sistema di sequenziamento ultra-high-throughput, 100-200 bp per AB / solido 17. In questo esperimento la maggior parte dei frammenti di DNA sono tra 300 bp e 600 bp, come mostrato su gel (Figura 4). In alternativa, i lettori possono scegliere di preparare la loro cromatina utilizzando MNase digestione, ma riteniamo nostro protocollo stabilito fornisce i campioni richiesti con alta qualità e fornisce risultati riproducibili. Dieci ng di DNA da ogni trattamento e il campione di ingresso corrispondente è stato preparato in tampone EB. Il chip DNA era sola lettura sequenziato usando il sistema di sequenziamento ultra-high-throughput. campioni di DNA chip hanno prodotto circa20.000.000 legge mentre il DNA di ingresso prodotto più di 35.000,000 letture (Tabella 1).

metabolomica
Per quantificare i metaboliti nelle cellule di mammifero utilizzando GCMS, almeno 10 mg di massa di cellule sono obbligatori. Abbiamo iniziato con 400.000 cellule MCF7 con gli esperimenti. Con il tempo del raccolto, ci sono stati circa 500.000 cellule in ogni piatto. La panoramica dei metaboliti rappresentata dai picchi sono stati confrontati tra il controllo e il campione Estradiolo trattate (Figura 5). Circa 100 metaboliti sono stati identificati, che contano per il 60% del totale noto nei mammiferi. Qui vi presentiamo una lista dei migliori 10 metaboliti, che mostrano cambiamenti significativi nel trattamento E2 (Tabella 2). Nel complesso, E2 upregulated percorsi tra cui il fruttosio e il metabolismo mannosio, il metabolismo istidina, metabolismo delle purine, biosintesi del colesterolo e il metabolismo della vitamina B3. I percorsi erano diminuito l'butanoato metabolism, de novo grassi biosintesi degli acidi, via dei pentoso fosfati, ciclo dell'urea e il metabolismo di arginina (tabella 3).

Analisi dei dati e l'integrazione
I dati di RNA-Seq, ChIP-Seq e GC-MS sono stati trattati ed analizzati attraverso una serie di passaggi (Figura 6). Dopo il confronto tra geni identificati in RNA-Seq e Chip-Seq, un set di up-regolati e un set di geni down-regolati da Estradiolo sono stati estratti. Dai dati metabolici, abbiamo ottenuto due serie di composti l'alto e verso il basso regolamentati dal trattamento Estradiolo. Avanti abbiamo usato Metscape, un app per Cytoscape, di visualizzare e interpretare l'espressione genica e dei dati metabolici nel contesto del metabolismo umano 15. In primo luogo abbiamo scelto di includere elementi di composto, reazione enzimatica, e gene della rete. Abbiamo selezionato i composti / geni come query e due reti della E2 up-regolazione (figura 7a) e verso il basso-Regolamento (Figura 7B) sono stati mostrati. Il Metscape offre anche la possibilità di costruire reti su percorsi selettivi. Ad esempio, utilizzando lo stesso insieme di dati come la costruzione della rete globale down-regolato, una sottorete di biosintesi e metabolismo pathway androgeno-estrogeno è stato generato passando query dal composto / gene specifico pathway. I geni o composti con cambiamenti significativi sono stati evidenziati in colore più brillante. Oltre a selezionare un percorso specifico dalla finestra a discesa, come descritto, si può anche creare una sottorete applicando la funzione "creare sottorete" per l'area scelta. Come mostrato in Figura 6A e B, ERα attivazione e di legame diretto al gene regioni regolatorie influenzato molti processi metabolici nelle cellule del cancro al seno. La nostra analisi integrative indicato che, ERα lega direttamente e regola l'espressione di FASN gene, che è importante per de novo grassi via di biosintesi dell'acido (FIGURA 7C). Inoltre il trattamento E2 downregulated percorsi di biosintesi degli androgeni-estrogeni reprimendo espressione di CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 e GSTM2 in queste vie.

Figura 1
Figura 1: Flusso di lavoro di preparazione dei campioni di RNA, DNA e lisati cellulari per l'RNA-Seq, Chip-Seq, e l'analisi metabolomica.

figura 2
Figura 2:. Un elettroferogramma rappresentante degli RNA analizzati con Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Integrity Number (RIN), indicatore di qualità dell'RNA, è stato dato dall'analisi come 9.9. (A) In un quadro di gel virtuale del RNA campione entrambe le bande di 26S e 18S sono taglienti. (B) i segnali fluorescenti di traccia individuale in tegli RNA dimostra che l'intensità del 28S picco è superiore a 18S picco e nessuna contaminazione si vede. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Un controllo rappresentativo di qualità sui dati grezzi RNA-Seq Uno dei dati di sequenza del campione veicolo è stato analizzato utilizzando FastQC. (A) La distribuzione lunghezza della sequenza della biblioteca che è 100 bp. (B) Il punteggio di qualità lungo la posizione di lettura. (C) Il punteggio di qualità per ogni sequenza ha mostrato l'alta qualità universale di tutte le sequenze. (D) Il contenuto GC per lettura abbinata la distribuzione teorica. Cliccate qui per vedere a laVersione rger di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Gel elettroforesi dei frammenti cromatina sonicati 5 ml di lisato cellulare di ciascun campione è stato analizzato su un gel di agarosio 1,5% con un bp 1.000 più scala sulla prima corsia.. La maggior parte dei frammenti sono tra 300 e 600 bp. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. La panoramica dei picchi che rappresentano metaboliti dal GC-MS Il pannello superiore mostra i picchi identificati nei campioni trattati E2 mentre il pannello inferiore dal controllo. L'area racchiusa è stato bilocale per mostrare l'esatto metabolita rappresentata da ogni p eak. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: diagramma di flusso del metodo di clustering Integrativa.

Figura 7
Figura 7: La visualizzazione dei dati gene-metabolita integrati in Metscape (A) La rete di percorsi up-regolati da E2.. (B) La rete di percorsi down-regolato da E2. (C) E2 stimolato ERα assunzioni alla regione vicina di FASN, che si trova ad essere regolata in acidi grassi rete biosintesi de novo generato applicando la funzione sottorete.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1: Sintesi delle ultra-high-throughput sequenziamento di RNA-Seq e Chip-Seq.

Tabella 2
Tabella 2: elenco dei primi 10 metaboliti con variazioni significative con trattamento E2.

Tabella 3
Tabella 3: Percorsi monte ea down-regolato dal trattamento E2.

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Discussion

In questo articolo, abbiamo descritto la generazione e l'analisi integrativo di RNA-Seq, Chip-Seq dati e metabolomica da cellule MCF-7 che sono trattati con E2. Abbiamo sviluppato una serie di protocolli strategizing di utilizzare i metodi più efficienti e user-friendly articoli molli che producono scoperta biologicamente rilevanti. A nostra conoscenza, il nostro è il primo studio a integrare omiche dati provenienti da tre diverse analisi e nuove vie metaboliche identificate che ERα regolato direttamente nelle cellule del cancro al seno.

trascrittomica
E 'fondamentale per iniziare con RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica successo. La buona pratica eliminerà la possibilità di degradazione dell'RNA, compresa la creazione di panca RNase-free, cambiare i guanti spesso, memorizzazione in -80 ° C e tenere sul ghiaccio in uso. L'aggiunta di incubazione durante la notte a -20 ° C migliora il recupero dell'RNA. Per evitare il congelamento e lo scongelamento di RNA più volte, si possono assegnare le RNA per immissio a vallees upon l'isolamento e la purificazione. Per l'esistenza di errori di sequenziamento, qRT-PCR utilizzando il cDNA dai campioni è spesso eseguita per verificare i geni differenzialmente espressi identificati nel RNA-Seq. Pertanto, abbastanza RNA dovrebbe essere riservato a questo scopo. Eseguiamo abbinato-end-sequenziamento che ci permette di analizzare varianti di splicing, non codificanti-RNA e miRNA. Per evitare costi alta sequenziamento, sequenziamento single-end può essere eseguita pure. Rispetto ai microarray, RNA-Seq è più sensibile e non è limitata alle sonde fornite sul chip. Otteniamo le informazioni non solo sulle sequenze codificanti, ma anche sui geni non codificanti e trascrizioni differenziale unite ad essa. Attualmente stiamo usando questa tecnica per analizzare trascrittomi di varie linee cellulari dopo trattamenti ligando così come i tessuti ottenuti da esperimenti del mouse.

Cistromics
Il metodo ultra-high-throughput sequencing richiede minimo 5 ng DNA chip per la costruzione della libreria. In serie ChIP-Seq protocollo 18, si consiglia di avere almeno 10 ng. La quantificazione con fluorimetria è critica. In questo protocollo abbiamo usato doppio saggio rilevamento DNA strand per determinare la concentrazione di DNA. Si può anche utilizzare saggio fluorimetro per una precisa quantificazione del DNA. Per le differenze di attrezzature e materiali, è molto importante per ogni laboratorio di stabilire un proprio protocollo sonicazione, che genera desiderabili frammenti di DNA formati. Over-taglio del DNA ChIP potrebbe causare la perdita di arricchimento del DNA bersaglio mentre DNA chip di grandi dimensioni crea problemi per il sequenziamento efficiente. Prima di presentare il DNA per il sequenziamento, è sempre importante verificare l'arricchimento di alcune regioni note per qPCR. La tecnica è ancora limitata dalla efficienza e specificità dell'anticorpo utilizzato per immunoprecipitazione. Per ottenere informazioni sul sito di legame che potrebbe essere utilizzato in modo affidabile in analisi comparative, abbiamo convalidare la nostra reagenti seguenti norme Chip-Seq ENCODE, 19 e uso standarprotocolli dardizzata che ci forniscono con i set di dati coerenti. Accoppiato con il fattore di trascrizione posta sito di legame analisi di arricchimento, Chip-Seq è ancora uno dei migliori metodi per determinare legame diretto di fattori di trascrizione di cromatina. Attualmente stiamo usando questo protocollo per studiare chinasi di reclutamento, coregulators e di altri fattori di trascrizione alla cromatina in altre linee cellulari così come estrogeni tessuti sensibili del mouse.

metabolomica
Per un profilo metabolico di successo in cellule di cancro al seno umano, una preparazione del campione accurata è fondamentale. La quantità di cellule in uso e le condizioni di coltura cellulare in questo protocollo è ottimale per MCF7 cellule. Altre linee cellulari potrebbero richiedere cellule più o meno per la rilevazione di un numero significativo di metaboliti. Otteniamo circa 100 metaboliti in ogni esperimento. Questo metodo è limitato per il rilevamento di metaboliti vissuto brevi o metaboliti che sono presenti a basse concentrazioni. Questo metodo offre la facilità di using una singola preparazione del campione per identificare più metaboliti. Attualmente stiamo usando questa tecnica per identificare estrogeni metaboliti regolamentati nel siero e vari tessuti di topo.

Integrazione dei dati
Numerosi trascrittomica e studi cistromics sono stati fatti per indagare la segnalazione degli estrogeni e regolazione genica in cellule di cancro al seno, comprese le cellule MCF7 2,5-7,20. In questo studio, per la prima volta, abbiamo aggiunto i dati metabolomica e ha cercato di dedurre reti metaboliche che sono direttamente regolate da ERα dopo l'aggiunta ligando. Questo nuovo approccio ci ha permesso di pin punto circuiterie molecolari regolati da estrogeni che hanno un impatto metabolismo cellulare. Nel complesso, i nostri risultati supportano il ruolo di ERα come regolatore maestro di biologia del cancro al seno.

In sintesi, abbiamo fornito un compendio dettagliato dei protocolli per la generazione di RNA-Seq, campioni di chip-Seq e metabolomica da cellule del cancro al seno dopo estrogeno trattamenti e integranalisi ative dei dati ottenuti da questi omiche approcci. Questi protocolli consentiranno ai ricercatori di fare un'analisi simile per altri fattori di trascrizione, ligandi dei recettori nucleari e le condizioni di nutrienti.

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Disclosures

University of Illinois ha ricevuto una sovvenzione di investigatore Iniziato da Pfizer Inc. ZME e YCZ ha ricevuto il sostegno di stipendio da questa concessione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture, premio ILLU-698-909 (ZME) e Pfizer, Inc (ZME). I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

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References

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Medicina RNA-Seq trascrittoma Chip-Seq cistrome metabolomica gli estrogeni il cancro al seno
Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno
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Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

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