Abstract
-omics gelişine kanser ve metabolik sendrom gibi kronik hastalıkların anlayışımız geliştirdi yaklaşır. Ancak, gen ifade mikroarrayler, derin sıralama deneyleri veya metabolik profil elde edilen büyük ölçekli veri kümelerinde bilginin etkin madencilik ortaya çıkarmak önemlidir ve daha sonra etkili bir şekilde hastalıklı hücre fenotipleri kritik düzenleyiciler hedef. Östrojen Reseptör α (ÖRa) östrojen duyarlı meme kanseri için önemli olan gen programları düzenleyen ana transkripsiyon faktörlerinin biri. ÖRa meme kanseri metabolizmasında sinyalleme rolünü anlamak için, biz estradiol ile tedavi edilmiş MCF-7 hücrelerinden, transkriptomik cistromic ve metabolomic verilerini kullanarak. Bu yazıda RNA Sek, ChIP-Sek ve metabolomikler deneyleri ve elde edilen verilerin bütünleştirici hesaplama analizi için numune nesil nitelendirdi. Bu yaklaşım, yeni köstebek ortaya koymaya yararlıdırnormal veya hastalıklı hücrelerin etkileri metabolizması, belirli bir transkripsiyon faktörü ile düzenlenmiştir vasküler mekanizmaları ve gen düzenleyici devre.
Introduction
Östrojenler, üreme organı dokularında metabolik dokular, beyin ve kemik 1 de dahil olmak üzere, her iki kadın ve erkeklerde çok sayıda fizyolojik süreçte önemli regülatörleridir. bu dokularda yararlı etkilerine ek olarak, östrojenler meme ve yeniden üretici dokulara ortaya çıkan kanserlerin sürücü. Östrojenler esas hücre tipi özel etkilere neden Erler ile çalışmak. ChIP-Seq kullanarak RNA Seq ve genom ÖRa DNA bağlayıcı siteleri analizi kullanılarak ÖRa tarafından düzenlenen transkript derin sıralama ÖRa bunlardan kaynaklanan farklı dokularda ve kanserlerde nasıl çalıştığını anlamak için yararlı olduğunu kanıtladı. Biz ve diğerleri gen ifadesi (ÖRP vs ÖRa) farklı reseptörler ile ilişkili profilleri 2,3, farklı ligandlar 3-5 ve farklı koregülatörleri 2,4,6,7 yayınladı.
RNA Seq mikroarray ba göre daha yüksek hassasiyet ve verimlilik sunan transcriptome incelemek için ana yöntemsed gen ekspresyon analizi 8. Hücre hatları 2-4,7, doku veya tümör örneklerinden elde edilen RNA mevcut genomik meclisleri eşleştirilir, dizilir ve ayrı düzenlenmiş genler tanımlanmıştır. Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) bilinen düzenleme bağlanma sitelerinin bağlanma transkripsiyon faktörü ve coregulator kromatin incelemek için kullanılır. ChIP-Seq (yüksek verimlilik sıralaması takip ChIP) Küresel bağlama siteleri tarafsız algılanmasını sağlar. Metabolomik başka giderek kullanılan sistem biyolojisi yaklaşımı, nicel önlemler, kimyasallar ve genetik perturbations dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara canlı sistemlerin dinamik multiparametrik yanıttır.
Genel metabolik profil gerçekleştirilerek etkin bir okuma hücre, doku, kan elde edilebilir. Buna ek olarak, transcriptome deneyler bilgi her zaman biyokimyasal yollar katkı enzim seviyesinde gerçek değişiklikleri yansıtmıyor. kombinetranskriptom ve metabolome verilerinin analizi, tespit ve gerçek metabolit değişikliklerle gen ifadesinde bir değişiklik ilişkili olanak sağlamaktadır. Bu büyük ölçekli veri setleri mekanistik ayrıntıları tüm bilgileri Harnessing kompleks biyolojik sistemler, insan gelişimi ve kanser ve diyabet gibi hastalıklara ilgilendirmeyen özellikle olanları düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin rolünü anlamak için.
memeli genomunun karmaşık doğası zorlu entegre ve tam transcriptome, cistrome ve metabolome deneylerden elde edilen verileri yorumlamak için yapar. bir zamanlar işlevsel bağlanma siteleri tanımlanır çünkü hedef genlerin ifadesi önemlidir değişikliklere yol açacak fonksiyonel bağlayıcı olayları belirlenmesi; transkripsiyon bağlanma (TF) motif analizi de dahil olmak üzere, analiz takip eden, yüksek hassasiyetle gerçekleştirilebilir. Bu biyolojik olarak anlamlı TF basamak ve mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. Ayrıca doğrudan comparisHer bir deneyden alınan veriler terazi ve sesler farklı ve bazı durumlarda anlamlı sinyalleri popülasyon gürültü ile gizlenmiş olan RNA-Seq ve yonga-Seq deneylerin her zaman mümkün değildir. Biz meme kanseri ÖRa doğrudan metabolik düzenleme anlamak için bu üç bağımsız ancak ilgili yaklaşımlardan bilgi entegre herhangi çalışmanın farkında değildir. Bu nedenle, bu yazıda bizim genel amacı gen ifadesi ve metabolit değişikliklere üretken bağlayıcı olayları ilişkilendirmek olduğunu. Bu hedefe ulaşmak için, biz RNA Sek, ChIP-Seq ve metabolomikler deneylerden elde edilen verilerin entegre ve metabolik yollar gen ifadesi değişikliklere yol açacak olayları bağlama ÖRa kaynaklı olanlar östrojen belirledi. İlk kez, biz meme metabolizmasını düzenleyen yeni gen devreleri ortaya çıkarmak için ChIP-Seq, RNA Seq ve metabolomik profil üreten ve veri bütünleştirici analizini gerçekleştirmek için protokoller (Şekil 1) komple bir set sağlamakkanser hücre çizgileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RNA-Seq Örneklerin hazırlanması 1.
- Hücre Kültürü ve İşlem
- Kültür Geliştirilmiş MEM (IMEM) artı% 10 ısıl aktif olmayan FBS,% 1 penisilin / nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de streptomisin ile fenol-kırmızısı bir ortam içinde MCF7 hücreleri.
Not: Aynı hücre dizisi ve hücre kültürü durum çalışma boyunca kullanılır. - 6-delikli plakalardaki oyuk başına tohum 100,000 MCF7 hücreleri. Her tedavi için triplicates var. 3 gün, orta kaldırmak ve ya her kuyuya 10 -8 M E2 olmadan 2 ml taze orta ekleyin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin.
- hücreleri hasat etmek için, her bir 1 ml RNA izolasyonu reaktifi (asit guanidinyum thiosiyanat-fenol-kloroform) ilave edilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) enkübe edilir. Sonra 1.5 ml tüpler içine pipetle ve mevduat hücre lizatı reaktifi toplamak
- Kültür Geliştirilmiş MEM (IMEM) artı% 10 ısıl aktif olmayan FBS,% 1 penisilin / nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de streptomisin ile fenol-kırmızısı bir ortam içinde MCF7 hücreleri.
- RNA izolasyonu
- 200 ul chlorofo ekleme10 saniye boyunca, 1 ml hücre lizatı reaktifi (1.1.3) ve vorteks RM. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüj örnekleri. Santrifüj işleminin ardından, diğer fazlar bozmadan yeni bir tüpe sulu fazın (üst) aktarın.
- transfer sulu faz yeni bir tüpe 500 ul% 100 izopropanol ekleyin ve üst edilerek karıştırılır. -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca inkübe edilir. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri. tüpün alt kısmında bir pelet gözlemleyin. Süpernatantı atın ve kısa girdap tarafından 750 ul RNaz ücretsiz% 70 etanol ile pelet yıkayın.
- Santrifüj örnekler 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 6,000 x g'de. Süpernatantı, ve geriye kalan etanolü toplamak için 4 ° C'de 1 dakika için 16,000 x g'de santrifüjleyin. 10 dakika boyunca kurumaya aşağı yukarı tarafı tüpleri bir jel yükleme ucu ile pipetleme kalan etanol çıkarın ve ayarlayın. bağımlılığındaki 20-50 ul DEPC arıtılmış su pelet çözülürpelet boyutuna ding.
- Protokolü 4 Aşağıdaki RNA temizleme kiti kullanılarak RNA arındırın. 9 protokolü izlenerek fluorometri bazlı analiz kiti kullanılarak RNA konsantrasyonu ölçümü.
Not: 260 nm'de OD, 260 nm'de OD RNA konsantrasyonu ve oranı tayin edilir ve 280 nm Örnek saflığını belirlemek için kullanılır. Bu Biyo-analizör analizi kullanılarak RNA kalitesini kontrol tavsiye edilir. - sekanslama için yaklaşık 0,5-1 ug saflaştırılmış RNA al.
NOT: Biyoteknoloji merkezi sıralama kütüphaneleri hazırlar ve paired-end önceden 2 detaylı yöntemler kullanılarak sıralama okuma gerçekleştirir.
ChIP-Seq Numune 2. Hazırlık
- Hücre Kültürü ve İşlem
- Tohum büyüme ortamında 10 cm plaka başına 500.000 MCF7 hücreleri.
NOT: Her aşağı çekme için 16 tabak kullanıldı. 3 gün, orta kaldırmak ve ya her 10 -8 M E2 olmadan 5 ml taze orta ekleyinplaka. 45 dakika (nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C) için hücreleri tedavi.
- Tohum büyüme ortamında 10 cm plaka başına 500.000 MCF7 hücreleri.
- Çapraz bağ ve Hücre Hasat
- Kromatine çapraz bağlanması, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe 5 ml ortam içine 250 ul% 37 formaldehid ekleyin. 5 ml buz 1x MEM ile hücrelerin yıkayarak çapraz bağlanması durdurun.
- plaka başına 250 ul hücre lisis tamponu (10 mM EDTA, 50 mM Tris HCI,% 1 SDS,% 0.5 N, N-dimethyldodecan-1-amin oksit) hücreleri hasat.
- Kromatin parçalanması
- Gerekli kromatin boyutlarını ulaşmak için 30 amp 30 sn x 8 hücreleri sonikasyon. 30 saniyelik bir Sonikasyon sonrasında, buz üzerinde her bir örnek soğutun.
- Santrifüj 16 °, 000, 4 ° C'de 10 dakika süre ile xg, ve dikkatli bir şekilde alt pelet bozmadan üstte yüzen madde pipet.
- Süpernatan 5 ul tablet alın ve daha önce tarif edildiği gibi 10,% 1.5 agaroz jeli içinden elektroforez ile DNA boyutunu kontrol edin. ideal boyutDNA 200-500 bp arasında olmalıdır.
- kromatin immünopresipitasyon
- giriş olarak hücre lizatı 25 ul kaydedin. 50 ml'lik bir tüp içinde, 20 mi, IP tampon maddesi (2 mM EDTA, 100 mM NaCI, 20 mM Tris-HCl ve% 0.5 Triton X), ÖRa antikoru (500 ul F10 ve 500 ul hücre lisatı 4 ml karıştırın HC- 20) ve 500 ul PROTA ve ProtG proteini manyetik boncuklar kaplanması. chromatin- antikor kompleksinin oluşumuna izin vermek için 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca dönmesi ile inkübe karışımı.
- Yıkar ve Ters çapraz
- yıkama tamponu çıkarmak için manyetize tarafında manyetik boncuk toplamak için manyetik standı kullanın.
- 25 ml yıkama tampon maddesi içinde manyetik boncuklar yıkayın I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI,% 01 SDS,% 1 Triton X ve 150 mM NaCI). iyice 25ml tüm manyetik boncuk karışık kuyu wi kadar sonra tüpler ters tarafı boyunca tüp yavaşça yıkama tamponu ekleyin DNA Protein kompleksleri bozmadan manyetik boncuk yıkamak içinBir pelet olarak görünmeden yıkama tamponu th. Bir alternatif olarak, tüp ters için rotator kullanımı. örnekleri vorteks etmeyin. aşağıdaki adımları aynı yöntem kullanılarak, manyetik boncuk yıkayın.
- 25 ml yıkama tamponu II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI,% 01 SDS,% 1 Triton X, 500 mM NaCİ) içinde manyetik boncuk yıkayın.
- 25 ml yıkama tampon III manyetik boncuk yıkayın (1.6 mM EDTA, 10 mM Tris HCI,% 1 NP-40,% 1 Dexycholate 250 mM LiCİ).
- iki kez 25 mi 1X TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris HCI) manyetik boncuk yıkayın.
- 500 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir (% 1 SDS ve 10 mM NaHCO3) ve daha sonra 4 tüpler içine 500 ul DNA elüsyon tahsis. girişlerden DNA için, 125 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir.
- bir ısıtma bloğu üzerinde gece boyunca 65 ° C'de inkübe edin. hatta tüm tüpleri üzerinde ısı tutmak için alüminyum folyo ile ısıtma bloğu tüpleri örtün. açılış onları tutmak için borular üzerinde bir ağırlık koyun. </ Li>
- DNA izolasyonu
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında tüpler soğutun. ChIP DNA izolasyon kiti kullanılarak aşağı çekme örneklerinden DNA izole. üreticiden yönergeleri izleyin.
- 65 ° C'de elüsyon tamponu ısıtın. Her tüpe bağlayıcı tampon 625 ul ekle. Çözelti berraklaşıncaya kadar çökelti oluşmazsa, başka bir 250 ul bağlayıcı tampon eklemek.
- 30 saniye boyunca 16.000 xg'de sütun ve santrifüj üzerine örnek yükleyin. 250 ul yıkama tamponu ile örnek yıkayın. İlk kez ne zaman kullanılacağını yıkama tamponu etanol eklemeyi unutmayın. yıkama tekrarlayın.
- 15 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir. Aynı DNA yaklaşık 55 ul DNA elde etmek için 4 tüpler aşağı çekme birleştirin.
- DNA izolasyon kiti kullanılarak Girdi DNA izole.
- 65 ° C'de elüsyon tamponu ısıtın. Her bir tüp içinde 625 ul bağlayıcı tampon ilave edin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. 2 ml collecti kolona örnek yükleyintüp.
- 1 dakika boyunca 16,000 xg'de 750 ul yıkama tamponu, santrifüj ile örnek yıkayın. herhangi bir geri kalan tampon çıkarmak için santrifüj tekrarlanır. EB 30 ul içine DNA Zehir.
- Modifikasyon 11 ile Ticari Florokrom Test kullanma DNA Konsantrasyon ölçün.
- reaktif ve DNA örneklerinin seyreltilmesi için tahlil tamponu olarak 1x TE içine 20x TE tampon sulandırmak. 5 ul izole edilen DNA almak ve 1X TE 50 ul içinde seyreltin.
- 2 ug / ml DNA stok solüsyonundan boş 1, 10, 100, 1000 ug / ml arasında değişen bir DNA standart hale. 96 oyuklu bir plaka içerisinde, 25 her bir standart ul olarak kopya DNA seyreltme ayırmaktadır. (Standart Triplicate tavsiye edilir.)
- Plastik tüp içinde 1X TE tamponu içinde dsDNA reaktif bir 200-kat seyreltme yapılarak çalışma reaktifi hazırlayın. ışık önlemek için alüminyum folyo ile çalışan reaktif çözümü örtün. Her numune içine reaktifi çalışan 200 ul ekleyin. İçinde5 dakika boyunca oda sıcaklığında cubate. ışık önlemek için alüminyum folyo ile plaka örtün.
- (480 nm, emisyon 520 nm uyarma), bir floresan plaka okuyucu kullanarak örneklerin floresans ölçün. DNA konsantrasyonuna karşı çiçeklenme DNA standart eğri oluşturmak. oluşturulan DNA, standart eğrisine göre numune konsantrasyonları belirlenir.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında tüpler soğutun. ChIP DNA izolasyon kiti kullanılarak aşağı çekme örneklerinden DNA izole. üreticiden yönergeleri izleyin.
- qPCR kullanarak ChIP Deney doğrulanması
- DNA izole edilmiş ve su içinde 20 ul seyreltilmiş 2 ul alır. 2.5 ul DNA seyreltme, 5 ul Green I PCR master karışımı, 1 ul astar ve 1.5 ul nükleaz ücretsiz su karıştırılarak üç nüsha olarak qPCR reaksiyonu ayarlayın.
- Aşağıdaki programı kullanarak Hızlı Real-Time PCR sistemi ile qPCR çalıştırın: Adım 1: 95 ° C 60 saniye, Adım 2: 60 saniye tekrarlayın Adım 2 39 kez 10 saniye süreyle 95 ° C, 60 ° C.
- sıralama için Biotech merkezine 10 ng DNA örneği gönderin.
NOT: Biotech merkezi talimatına göre kütüphaneler içine ChIP DNA hazırlar ve daha önce 2 detaylı yöntemler kullanılarak tek okunan sıralama yapar.
3. Metabolomik Deneyi Numune Hazırlama
- Hücre Kültürü ve İşlem
- Tohum büyüme ortamında 10 cm plaka başına 400.000 MCF7 hücreleri. Her tedavi için üç numune hazırlamak. tespiti için yeterli hücre almak için her bir örnek iki tabak kullanın. 3 gün, orta kaldırmak ve hücrelere veya 10 -8 M E2 olmadan 5 ml taze orta ekleyin. 24 saat (nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C) için hücreleri tedavi.
- Örnek koleksiyon
- , Plaka PBS 1x 5 ml buz soğuk ekle kısaca plaka birkaç kez devirme sonra PBS aspire. İki kez tekrarlayın ve son yıkamadan sonra mümkün olduğunca PBS kaldırmak.
- Her bir plaka için önceden soğuk aseton 750 ul ilave edin ve hücreleri kazıyın. iki plakalardan aseton hücreleri birleştirmekBuz üzerinde 2 ml tüp.
- normalleşmesi için hücre sayımı
- Her bir muamele için, hücre ölçümü için fazladan iki tabak kullanın. Için, hücreleri plakadan de takmak O, her plaka (1 x HBSS, 10 mM HEPES,% 0.075 NaHCO 3 ve 1 mM EDTA) tampon ve 5 dakika için inkübe 2 ml ekleyin.
- Toplayın ve HE tampon hücreleri pipetleme iyice hücreleri karıştırın. hemasitometre kullanarak hücre sayısını saymak için 20 ul hücre çözüm toplam kullanın.
- belirlemek ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GC-MS) analizi kullanılarak metabolitleri ölçmek için Metabolomik merkezine göndermeden önce -80 ° C'de örnekleri saklayın.
4. Bütünleştirici Analizi
- RNA Dizi veri analizi:
- FastQC kullanarak fastq dosyalarının Kalite kontrolü yapın: Okuma QC (http://galaxy.illinois.edu)
- FastQC seçin: NGS ve aracı altında Oku: QC ve manipülasyon. Geçerli histor gelen ham veri dosyası yükleY.
NOT: Çıktı dosyası işi birden çıkışları olabilir çünkü için ne hatırlatmak için bir başlık vermek için tavsiye edilir.
- FastQC seçin: NGS ve aracı altında Oku: QC ve manipülasyon. Geçerli histor gelen ham veri dosyası yükleY.
- Yürütme ve çıktı dosya Tarih altında görünecektir. Her dizi dosya için aynı işlemi tekrarlayın. FASTX Toolkit: NGS altında Clip kullanarak Trim adaptörler.
- Hizala RefSeq genom referans açıklama 12 (varsayılan değerler) ile Tophat2 kullanarak hg19 için okur.
- NGS bir aracı altında Tophat2 seçin: RNA analizi. kütüphane eşleştirilmiş tipini (eşleştirilmiş sonu vs tek uçlu) belirtiniz.
- Geçerli tarihin giriş fastq dosyasını yükleyin. Referans genomunu seçin. varsayılan ayarları seçin. Ya da değiştirmek için tam parametre listesini kullanın.
- Yürütme ve iki çıkış dosyaları üretecek: Bir kavşak UCSC YATAK pist; Başka bir BAM formatında okuma güzergahlarının bir listesidir.
- dizi veri analizi aracı BAM dosyalarını yükleyin. Quant kullanarak ifade değerlerini hesaplamakification Aracı.
- Varsayılan değerleri kullanarak İfade Analizi Aracı'nı kullanarak farklı şekilde yukarı regüle genleri tanımlamak ve değişim> 2 ve p-değeri <0.05 katlayın. Aynı şekilde, varsayılan değerleri kullanarak İfade Analizi Aracı'nı kullanarak farklı şekilde aşağı regüle genleri tanımlamak ve değişim <0,5 ve p-değeri <0.05 katlayın.
- FastQC kullanarak fastq dosyalarının Kalite kontrolü yapın: Okuma QC (http://galaxy.illinois.edu)
- ChIP-Seq Veri Analizi:
- Align fastq Galaxy Bowtie2 13 (Varsayılan Değerler) kullanarak hg19 okur.
- MGK aracı altında Bowtie2 seçin: Mapping. kütüphane arkadaşı-eşleştirilmiş (eşleştirilmiş sonu vs tek uçlu) ise doğrulayın. Geçerli tarihinin fastq dosyasını yükleyin.
- Referans genomunu seçin. varsayılan parametre ayarları kullanın. Yürütme ve eşlenen dizisi BAM dosya olarak okur ile çıkış dosyası üretecektir. Her dizi dosyası için aynı işlemi tekrarlayın.
- Daha önce 2 açıklandığı gibi, MACS 14 6.0E-7 bir p değeri kesme ve 0.01 FDR kullanarak doruklarına tanımlayın.
- Metabolomik Veri Analizi:
- KEGG_IDs metabolitlerin kimyasal isimleri dönüştürün.
- V. E2 Araç tespit seviyeleri karşılaştırılarak ayrı düzenlenmiş metabolitleri kısmını (2 kat kesme bu çalışmada kullanılmıştır) örnekleri işlemden geçirildi.
- Bütünleştirici analiz:
- dizi veri analizi aracını kullanarak ÖRa bağlama siteleri genleri belirlemek. mesafe cut-off olarak 20 kb kullanarak genler işlev Bölgeler çevirin.
- Kesilmiş sırasıyla p değeri <0.05 olan katlık değişime> 2 kullanılarak RNA Seq veri analizinden farklı olarak yukarı ve aşağı düzenlenen genleri tanımlamak ve değişim <0,5 kat. Venn şeması karşılaştırma kullanılarak ÖRa bağlanma yeri içeren genlerin listesine karşılaştırın.
- Cytoscape ve Metscape 15 modülünü kullanarak E2 modüle metabolik yolları belirlemek için bu listeyi kullanın.
- apps Metscape modülü seçerek, ağ ve ardından yolu-bas oluşturun seçined seçeneği.
- Organizma (Insan) seçin. E2 düzensiz bileşik listesinin seç veri dosyası (KEGG ID) yanı sıra E2 gen listesi up-regüle.
- Ağ türü olarak -Reaction Enzim-Gene Bileşik seçin. sorgu olarak bileşik / genleri seçin.
- ağ kurmak. E2 aşağı regüle bileşik ve genler kullanılarak tekrarlayın.
- Align fastq Galaxy Bowtie2 13 (Varsayılan Değerler) kullanarak hg19 okur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
transkriptomik
E2 tedavisi ile farklı ifade genleri analiz etmek, biz bir RNA-Seq deney gerçekleştirmek için seçti. mRNA seviyeleri ile ilgili bilgilerin yanı sıra, RNA-Seq veriler, kodlayıcı olmayan RNA (uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar, mikroRNAlar) ve alternatif bağlayıcı olayları değişiklikleri izlemek için de kullanılabilir. Çalışmamızın kapsamı metabolik düzenlenmesi için önemli olan protein kodlama genleri tanımlamak için olduğundan biz, RNA kodlama olmayan veya alternatif transkripsiyonu genlerin analizi hakkında bilgi vermedi. Ancak, RNA Seq diferansiyel gen ifadesi olaylar hakkında bilgi edinme mükemmel bir yoldur.
Yüksek kaliteli okuma elde etmek için, yüksek saflıkta RNA almak önemlidir. RNA izole sonra biz bir RNA temizlemek kiti kullanılarak RNA saflaştırılmış. Ne yazık ki RNA yaklaşık% 50 bu işlem sırasında kaybolur ve RNA başlangıç miktarı, c alınmalıdıronsideration saflaştırma adımının sonunda gereken miktar (100-500 ng) elde edilmiştir.
Çok hassas ve düşük yoğunluklu RNA ölçümü için tercih edilen bir yöntemdir florimetre RNA HS deneyi kullanılarak RNA kazançları, ölçülebilir. Daha sonra, RNA numunelerinin bütünlüğünü ve genel kalite RNA çok az bir miktarı kullanılarak jel elektroforezi için uygun bir alternatif bioanlayzer kullanılarak incelenmiştir. Analiz tüm Numuneler (Şekil 2B) bütünlüğünü ve saflığını gösteren 18S ve 28S rRNA keskin ve temiz bantları gösterir. RNA bütünlüğü numarası (RIN) RNA kalite kontrol, bir standart olarak kullanılmıştır. RIN 10 bozulmamış RNA gösterir RIN 6 kısmen bozulmuş ve RIN3 kuvvetle 16 bozulmuş.
RIN dizi deney için en az 7 olduğu önerilir. Bizim RNA örneklerinin tamamı 9.6-9.9 arasında RIN değer aldığımız <strong> (Şekil 2A). Ardışık kütüphaneleri örneğin alt için hazır her bir örnek (Tablo 1), elde edilmiştir okuma ortalama 18.000.000 yüksek kaliteli dizilimi üzerinde Illumina 2500 ultra yüksek verim sıralama sistemi kullanılarak her numune yüksek kaliteli RNA 500ng inşa edildi analiz. yüksek verimli dizisi ham verilerin genel kalitesini kontrol etmek için, FastQC her numune en okur için çalıştırıldı. Bir araç RNA Seq verileri için Örnek FastQC rapor (Şekil 3) gösterilmiştir. En okur dizi uzunluğu yaklaşık 100 bp (Şekil 3A) idi. Her okuma, kalite puanı, ilk 5 bp için 32-34 ve 6-100bp (Şekil 3B) 36-38 oldu. 17990863 Bu örnekten üretilen okur arasında, çoğu kalite daha yüksek 34 (Şekil 3C) puanı vardı. sırayla okuma başına GC içeriği de% 48 GC ortalama ile normal dağılıma izledi. Genel kaliteokur puan çok yüksek oldu.
ÖRa bağlanma sitelerinin Cistromic analizi
istenen boyutta DNA parçalarını elde etmek, etkin derin sıralama elde etmek için önemli faktörlerden biridir. Geçerli sıralama yaklaşımlar, örneğin, ultra-yüksek verim sıralama sistemi için 300-600 bp, katı AB / 17 için 100-200 bp DNA parçalarının farklı gereksinimleri olabilir. Bu deneyde, DNA fragmanlarının en fazla 300 baz çiftlik ve 600 bp jeli üzerinde gösterildiği gibi (Şekil 4) arasında değişmektedir. Alternatif olarak, okuyucuların ancak biz bizim kurulan protokol yüksek kalite ile gerekli örnekleri sağlar ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar hissediyorum, MNase sindirim kullanarak kromatin hazırlamak için tercih olabilir. Her bir tedavi DNA ve karşılık gelen giriş numunenin on ng EB tamponu içinde hazırlanmıştır. Yonga DNA, ultra-yüksek verimli sekanslama sistemi kullanılarak dizilenmiştir tek okundu. Yonga DNA Numuneler vermiştirGiriş DNA 35.000,000 (Tablo 1) okur fazla tespit edilirken 20.000.000 okur.
metabolomik
GCMS kullanılarak memeli hücrelerinde metabolitleri ölçmek için, hücre kütlesinin en az 10 ug gerekmektedir. Biz deneylerle 400.000 MCF7 hücreleri ile başladı. Hasat zamanında, her bir plaka yaklaşık 500,000 hücre vardı. Zirveleri tarafından temsil metabolitlerin genel kontrol ve östradiol tedavi örnek (Şekil 5) arasında karşılaştırıldı. memelilerde bilinen toplam% 60 saymak belirlenmiştir yaklaşık 100 metabolitleri. Burada E2 tedavisi (Tablo 2) önemli değişiklikler gösteren ilk 10 metabolitleri, bir listesini sunuyoruz. Genel olarak, E2 fruktoz ve mannoz metabolizması, histidin metabolizması, pürin metabolizmasının, kolesterol biyosentezi ve B3 vitamini metabolizması dahil yollar regüle. downregüle yollar vardı butanoat metabolism, de novo yağlı asit biyosentezi, pentoz fosfat yolu, üre döngüsü ve arginin metabolizması (Tablo 3).
Veri analizi ve entegrasyon
RNA Sek, ChIP-Sek ve GC-MS verileri, RNA Sek ve ChIP-Sek tanımlanan genler arasında karşılaştırma sonra. Adımlar (Şekil 6) bir dizi işlenmiş ve analiz edilmiştir up-regüle bir dizi ve Estradiol aşağı-düzenlenen genlerin bir set ekstre edildi. Metabolik verilere göre, biz Estradiol tedavisi ile yukarı ve aşağı düzenlenmiş bileşiklerin iki takım aldı. Sonraki biz görselleştirmek ve insan metabolizmasının 15 kapsamında gen ifadesini ve metabolik verileri yorumlama, Metscape, Cytoscape için bir uygulama kullanılır. İlk olarak ağda bileşiğin elemanları, reaksiyon, enzim ve gen dahil etmeyi tercih ettik. Biz bileşikleri / sorgu gibi genleri ve iki E2 up-regülasyonu (Şekil 7A) ağları ve aşağı seçilmişZiraî (Şekil 7B) gösterildi. Metscape da seçici yollar üzerinde ağları kurmak için bir seçenek sunar. Örneğin, aşağı-regüle genel ağ yapı olarak aynı veri seti kullanarak, androjen östrojen biyosentezi ve metabolizma yolunun bir alt ağ belirli yoluna bileşik / genden sorgu geçerek üretilmiştir. önemli değişiklikler ile genler ya da bileşiklerin parlak renkli vurgulanmıştır. açıklandığı gibi açılan pencereden belirli bir yolu seçmenin yanı sıra, bir de seçilen alana "altağı oluşturmak" işlevini uygulayarak bir alt ağ oluşturabilirsiniz. Şekil 6A ve B, ÖRa aktivasyonu ve gen düzenleyici bölümlerin bağlanmada direkt olarak gösterildiği gibi, meme kanseri hücreleri içinde birçok metabolik etki etmektedir. Bizim bütünleştirici analizi, ÖRa doğrudan (F bağlanır ve de novo yağlı asit biyosentez yolunun önemlidir FASN geninin ekspresyonunu düzenleyen olduğunu göstermiştirŞEKIL 7C). Buna ek olarak E2 tedavisi bu yollarda CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 ve GSTM2 ifadesini bastırmak yoluyla androjen-östrojen biyosentez yolları downregüle.
Şekil 1: RNA seq, yonga-Sek ve metabolomic analizi için RNA, DNA numuneleri ve hücre lizatları hazırlanması iş akışı.
Şekil 2:. Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Bütünlük sayısı (RIN), RNA kalitesi göstergesi ile analiz RNA'ların bir temsilci Elektroferogram, 9.9 olarak analiz tarafından verildi. RNA sanal jel resimde (A) 26S ve 18S hem bantlar keskindir örnek. (B) t bireysel iz Floresan sinyalleriO RNA 28S doruk şiddeti daha büyük 18S zirve olduğunu gösterir ve herhangi bir kontaminasyon görülmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. RNA Sıra ham verilere bir temsilci kalite kontrolü, araç numunenin dizi verilerinin biri FastQC kullanılarak analiz edildi. (A) 100 bp kütüphanenin dizi uzunluğu dağılımı. (B) okuma pozisyon boyunca kalite puanı. (C) dizisi başına kalite puanı tüm dizilerin evrensel kaliteli gösterdi. (D) teorik dağılımı eşleşti okuma başına GC içeriği. La görmek için buraya tıklayınızBu rakamın rger sürümü.
Şekil 4: sonike kromatin parçalarının jel elektroforezi her bir örnek hücre lizatının 5 ul birinci şeritli 1000 bp artı merdiven ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde çalıştırıldı.. Fragmanlarının çoğunluğu bp 300 ila 600. Olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. GC-MS metabolitleri temsil tepe genel üst panel kontrolünden alt panel E2 ile muamele edilmiş örneklerde tanımlanan piklerini göstermektedir. konutların edildi kapalı alan her p tarafından temsil kesin metaboliti göstermek için eak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Bütünleştirici kümeleme yöntemi Akış Şeması.
Şekil 7: Metscape entegre gen-metabolit veri görselleştirme (A) E2 tarafından düzenlenen yukarı yollarının ağ.. (B) E2 aşağı-regüle yolların ağı. (C) E2 alt ağ fonksiyonun uygulanması yoluyla üretilmesi de novo yağlı asit biyosentez ağda düzenlenmiş olduğu bulunmuştur FASN yakın bölgesi için ÖRa işe uyarmıştır.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: RNA Sek ve ChIP-Sek ultra-yüksek verimlilik sıralaması Özeti.
Tablo 2: E2 tedavi ile önemli değişiklikler ile ilk 10 metabolitleri listesi.
Tablo 3: Mesleki yukarı ve aşağı regüle E2 tedavisi ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, E2 ile tedavi edilir MCF-7 hücrelerinden üretimini ve RNA-Sek, ChIP-Sek ve metabolomikler verilerinin bütünleştirici analizini nitelendirdi. Biz biyolojik ilgili keşif üretmek en etkin yöntem ve kullanıcı dostu yumuşak mallar kullanmak için strateji protokoller bir dizi geliştirdi. Bildiğimiz kadarıyla, bizim üç farklı analiz ve ÖRa doğrudan meme kanseri hücrelerinde düzenlenmiş belirlenen yeni metabolik yollar dan -omics verileri entegre etmek ilk çalışmadır.
transkriptomik
Başarılı transkriptomik analizi için, yüksek kaliteli RNA'lar ile başlamak için kritik öneme sahiptir. İyi uygulama, RNaz ücretsiz tezgah oluşturarak sık sık eldiven değiştirilmesi, ° C -80 depolama ve kullanımda buz üzerinde tutarak dahil RNA bozulması olasılığını ortadan kaldırmak olacaktır. -20 ºC gecede inkübasyon eklenmesi RNA kurtarma geliştirir. defalarca donma ve çözülme RNA önlemek için, bir aşağı prosedüründe için RNA'lar ayırabilirsinizizolasyon ve saflaştırma sırasında es. dizi hatalarının varlığı için, örneklerden cDNA kullanılarak QRT-PCR genellikle RNA Sek tanımlanan farklı şekilde eksprese edilmiş genlerin doğrulamak için gerçekleştirilir. Bu nedenle, yeterli RNA bu amaç için ayrılmış olmalıdır. Biz splice varyantları, kodlayıcı olmayan RNA'lar ve miRNA'lar analiz etmemizi sağlar paired-end-sıralama yapar. yüksek sıralama maliyetlerinden kaçınmak için, tek-uçlu sıralama da yapılabilir. mikrodizileri karşılaştırıldığında, RNA Seq daha hassas ve çip üzerinde temin problar ile sınırlı değildir. Bu kodlama dizileri üzerinde değil, aynı zamanda non-kodlayan genlerin ve diferansiyel eklenmiş transkript üzerinde sadece bilgi temin edilir. Şu anda, fare deneylerinde elde edilen ligand tedaviler gibi dokularda sonra çeşitli hücre çizgilerinin transcriptomes analiz etmek için bu tekniği kullanmaktadır.
Cistromics
Ultra yüksek verimli sekanslama yöntemi kütüphane yapımı için en az 5 ng yonga DNA gerektirir. Standart ChIP-Seq protokol 18, en az 10 ng olması tavsiye edilir. fluorometri ile miktar tayini çok önemlidir. Bu protokolde, DNA konsantrasyonu belirlemek için çift iplikli DNA tespiti deneyi kullanıldı. Bir de hassas DNA ölçümü için florimetre tahlil kullanabilirsiniz. Her laboratuar arzu DNA fragmanları boyutları üretir kendi sonikasyon protokolünü kurmak için ekipman ve malzeme farklılıkları, bu çok önemlidir. Aşırı makaslama büyük boyutlarda ChIP DNA verimli sıralama için problem oluştururken hedef DNA'ların zenginleştirilmesi kaybına neden olabilir ChIP DNA. sıralama DNA göndermeden önce, qPCR bilinen bazı bölgelerin zenginleştirme doğrulamak için her zaman önemlidir. tekniği hala İmmüno için kullanılan antikor verimi ve özgüllük ile sınırlıdır. Güvenilir karşılaştırmalı analizlerde kullanılabilecek bağlama site bilgilerini elde etmek için, biz ENCODE ChIP-Seq standartları takip eden reaktifler doğrulamak, 19 ve kullanımı standartutarlı veri setleri ile bize dized protokolleri. sonrası transkripsiyon faktörü bağlanma sahası zenginleştirme analizi ile birleştiğinde, ChIP-Seq hala Kromatine transkripsiyon faktörlerinin doğrudan bağlanma belirlemek için en iyi yöntemlerden biridir. Şu anda diğer hücre hatları yanı sıra östrojen duyarlı fare dokularda kromatin için işe kinazlar, koregülatörleri ve diğer transkripsiyon faktörlerini incelemek için bu protokolü kullanıyor.
metabolomik
insan göğüs kanseri hücrelerinin başarılı bir metabolik profil için, dikkatli bir numune hazırlama kritik önem taşır. Bu protokolde kullanılmak üzere, hücre kültürü durumda hücre miktarı, MCF7 hücreleri için en uygunudur. Diğer hücre çizgileri metabolitlerin önemli sayıda saptanması için daha fazla veya daha az hücre gerektirebilir. Her deneyde 100 metabolitleri etrafında edinin. Bu yöntem, düşük konsantrasyonlarda mevcut olduğu kısa ömürlü metabolitleri ve metabolitlerin tespiti için sınırlıdır. Bu yöntem usi kolaylığı sunuyorTek bir örnek hazırlık ng birden metabolitleri tespit etmek bakabilirsiniz. Şu anda serum ve fare çeşitli dokularda östrojen düzenlenmiş metabolitleri tanımlamak için bu tekniği kullanıyor.
veri Entegrasyonu
Çok sayıda transkriptomiks ve cistromics çalışmaları MCF7 hücrelerinde 2,5-7,20 de dahil olmak üzere meme kanseri hücrelerindeki östrojen sinyal ve gen düzenlenişinde araştırmak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, ilk kez, biz metabolomik verileri eklendi ve doğrudan ligand eklenmesi üzerine ÖRa tarafından düzenlenir metabolik ağları anlaması için çalıştı. Bu yeni yaklaşım, hücresel metabolizmayı etkileyen östrojenler tarafından düzenlenen nokta moleküler devreler pin etmemizi sağladı. Genel olarak, bizim bulgularımız meme kanseri biyolojisinin ana düzenleyicisi olarak ÖRa rolünü desteklemektedir.
Özetle, Integr tedavi östrojen ve ardından RNA seq, göğüs kanseri hücreleri, yonga Dizi ve metabolomikler numunelerin üretilmesi için protokoller detaylı özet ResimBu -omics yaklaşımlardan elde edilen verilerin ative analizi. Bu protokoller, diğer transkripsiyon faktörleri, nükleer reseptör ligandları ve besin koşulları için benzer bir analiz yapmak için araştırmacılar sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Illinois Üniversitesi Pfizer Inc. ZME bir Araştırmacı başlatılan hibe aldı ve YCZ bu hibe maaş destek aldı.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, ABD Tarım Bakanlığı, ödül Illu-698-909 (ZME) ve Pfizer, Inc (ZME) hibe tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka ABD Tarım Bakanlığı resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0 ml | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer |
| Qubit Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
- Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
- Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
- Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
- Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
- Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).
