Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

علم الأحياء نظم تنظيم التمثيل الغذائي عن طريق مستقبلات الاستروجين في اشارة الى سرطان الثدي

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

مع قدوم -omics النهج فهمنا للأمراض المزمنة مثل السرطان ومتلازمة التمثيل الغذائي قد تحسن. ومع ذلك، التعدين الفعال للمعلومات في قواعد البيانات واسعة النطاق التي يتم الحصول عليها من ميكروأرس التعبير الجيني، والتجارب تسلسل عميقة أو التنميط التمثيل الغذائي أمر ضروري لكشف ومن ثم تستهدف على نحو فعال المنظمين تنتقد الظواهر الخلايا المريضة. مستقبلات الاستروجين α (ERα) هي واحدة من عوامل النسخ سيد تنظيم برامج الجينات التي تعتبر مهمة لهرمون الاستروجين سرطان الثدي استجابة. من أجل فهم لدور ERα يشير في التمثيل الغذائي سرطان الثدي نحن تستخدم البيانات transcriptomic، cistromic وmetabolomic من MCF-7 الخلايا تعامل مع استراديول. في هذا التقرير وصفنا جيل من العينات لRNA تسلسل، رقاقة تسلسل والتجارب الايض والتحليل الحسابي التكاملي للبيانات التي تم الحصول عليها. هذه الطريقة مفيدة في تحديد الخلد روايةآليات دائرية ودوائر الجينات التنظيمية التي تنظم من قبل عامل النسخ معين مما يؤثر التمثيل الغذائي للخلايا العادية أو المريضة.

Introduction

هرمون الاستروجين هي منظمات هامة لكثير من العمليات الفسيولوجية في كل من الإناث والذكور بما في ذلك الأنسجة التناسلية، الأنسجة التمثيل الغذائي والدماغ والعظام 1. بالإضافة إلى آثار مفيدة في هذه الأنسجة، هرمون الاستروجين أيضا دفع السرطانات التي تنشأ من الثدي والأنسجة التناسلية. هرمون الاستروجين يعمل أساسا من خلال المتطلبات البيئية للحث على نوع من الخلايا آثار محددة. أثبت تسلسل عميق من النصوص التي تنظمها ERα باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي وعلى نطاق الجينوم ERα تحليل الحمض النووي مواقع الربط باستخدام رقاقة تسلسل لتكون مفيدة لفهم كيفية عمل ERα في الأنسجة وأمراض السرطان المختلفة التي تنجم عنها. نحن وغيرنا قد نشرت الجينات ملامح التعبير يرتبط مع مستقبلات مختلفة (ERα مقابل ERβ) 2،3، بروابط مختلفة 3-5 وcoregulators مختلفة 2،4،6،7.

RNA تسلسل هو الأسلوب الرئيسي لدراسة Transcriptome على، وتقديم أعلى دقة وكفاءة مقارنة با ميكروأريتحليل التعبير الجيني (سيد) 8. وتسلسل الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا 2-4،7 أو الأنسجة أو عينات الورم، وتعيينها إلى المجالس الجينومية المتاحة ويتم تحديد الجينات ينظم بشكل مختلف. ويعمل لونين مناعي (رقاقة) لتشريح عامل النسخ وcoregulator الكروماتين ملزمة لمواقع الربط التنظيمية المعروفة. رقاقة تسلسل (رقاقة تليها عالية التسلسل الإنتاجية) على الكشف غير متحيز للمواقع الربط العالمية. الايض هو نهج آخر تستخدم بشكل متزايد البيولوجيا النظام الذي كميا التدابير، استجابة multiparametric ديناميكية من الأنظمة الحية لمختلف المنبهات بما في ذلك المواد الكيميائية والاضطرابات الوراثية.

عن طريق أداء التنميط التمثيل الغذائي العالمي، ويمكن الحصول على قراءات وظيفية من الخلايا والأنسجة والدم. وبالإضافة إلى ذلك، معلومات من تجارب Transcriptome على لا تعكس دائما التغيرات الفعلية في مستوى الانزيمات التي تساهم في المسارات البيوكيميائية. الجمع بينتحليل البيانات Transcriptome على وmetabolome تمكننا من تحديد وربط التغيرات في التعبير الجيني مع التغييرات الأيض الفعلية. تسخير المعلومات من جميع وتوفر هذه المجموعات على نطاق واسع في تفاصيل الآلية لفهم دور عوامل النسخ التي تنظم النظم البيولوجية المعقدة، وخاصة تلك التي تتعلق بالتنمية البشرية والأمراض مثل السرطان والسكري.

الطبيعة المعقدة للجينوم الثدييات يجعل صعوبة في الاندماج وتفسير البيانات التي تم الحصول عليها من Transcriptome على، cistrome وmetabolome التجارب بشكل كامل. تحديد الأحداث ملزمة الوظيفية التي من شأنها أن تؤدي إلى تغييرات في التعبير عن الجينات المستهدفة مهم جدا لأنه يتم تحديد مواقع الربط مرة واحدة الوظيفية؛ تلت ذلك التحليل، بما في ذلك النسخ ملزمة (TF) تحليل عزر، يمكن أن يؤديها مع أعلى قدر من الدقة. وهذا يؤدي إلى التعرف على شلالات TF ذات مغزى من الناحية البيولوجية والآليات. comparis المباشرة أيضاعلى التجارب يليها-RNA والشذرة يليها ليست دائما ممكنة لأن البيانات من كل تجربة لها اختلاف المقاييس والضوضاء، وفي بعض الحالات يتم حجب إشارات ذات مغزى من الضوضاء السكان. نحن لسنا على علم بأي دراسة تلك المعلومات من هذه المناهج مستقلة ولكنها ذات صلة ثلاث لفهم تنظيم التمثيل الغذائي المباشر من قبل ERα في سرطان الثدي المتكاملة. لذلك، لدينا الهدف العام في هذه الورقة هو لربط الأحداث ملزمة الإنتاجية إلى التعبير الجيني والتغيرات الأيض. من أجل تحقيق هذا الهدف، ونحن دمج بيانات من RNA تسلسل، رقاقة تسلسل والايض التجارب وتحديد تلك التي يسببها هرمون الاستروجين ERα الأحداث التي من شأنها أن تؤدي إلى تغيرات التعبير الجيني في المسارات الأيضية ملزمة. للمرة الأولى، ونحن نقدم مجموعة كاملة من البروتوكولات (الشكل 1) لتوليد رقاقة تسلسل، RNA تسلسل والايض التنميط وإجراء تحليل متكامل من البيانات للكشف عن الدوائر الجينات الجديدة التي تنظم عملية التمثيل الغذائي للالثديخطوط الخلايا السرطانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد عينات الحمض النووي الريبي يليها

  1. ثقافة الخلية والعلاج
    1. ثقافة الخلايا MCF7 في MEM تحسين (IMEM) زائد الفينول الحمراء المتوسطة مع 10٪ الحرارة غير نشط FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
      ملاحظة: يستخدم خط الخلية نفسها، وحالة زراعة الخلايا طوال فترة الدراسة.
    2. البذور 100،000 خلايا MCF7 لكل بئر في 6 لوحات جيدا. هل لديك يثلث لكل معاملة. في يوم 3، وإزالة المتوسطة وإضافة 2 مل متوسطة جديدة مع أو بدون 10 -8 M E2 إلى كل بئر. احتضان لوحات لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
    3. لحصاد الخلايا، إضافة 1 مل RNA العزلة كاشف (حمض guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم) في كل بئر واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم جمع كاشف خلية المحللة من قبل pipetting والودائع إلى 1.5 مل أنابيب
  2. عزل الحمض النووي الريبي
    1. إضافة 200 ميكرولتر chlorofoجمهورية مقدونيا إلى 1 مل خلية المحللة كاشف (1.1.3) ودوامة لمدة 10 ثانية. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. عينات الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، ونقل المرحلة المائية (أعلى) إلى أنبوب جديد دون إزعاج المراحل الأخرى.
    2. إضافة 500 ميكرولتر 100٪ الأيزوبروبانول إلى أنبوب جديد مع مرحلة نقل المائيه، وتخلط بواسطة قلب. احتضان عند -20 درجة مئوية خلال الليل. الطرد المركزي العينات في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. مراقبة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 750 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من الايثانول 70٪ من دوامة وجيزة.
    3. عينات الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف، وأجهزة الطرد المركزي في العينة 16000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع كل الإيثانول المتبقية. إزالة الإيثانول المتبقية قبل pipetting مع طرف جل التحميل وتعيين أنابيب يصل الجانب السلبي إلى الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة. حل بيليه في 20-50 المياه DEPC معاملة ميكرولتر depenدينغ على حجم الكريات.
  3. تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي عدة التنظيف بعد بروتوكول 4. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام التألق على أساس عدة الفحص بعد بروتوكول 9.
    ملاحظة: OD في 260 نانومتر التي اتخذت لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي ونسبة OD في 260 نانومتر، وتستخدم 280 نانومتر لتحديد نقاء العينة. فمن المستحسن فحص جودة الحمض النووي الريبي باستخدام الحيوية محلل فحص.
  4. يستغرق حوالي 0،5-1 ميكروغرام RNA لتنقية التسلسل.
    ملاحظة: مركز التكنولوجيا الحيوية تعد المكتبات التسلسل ويؤدي الاقتران نهاية قراءة تسلسل باستخدام أساليب مفصل سابقا (2).

2. إعداد نموذج رقاقة وما يليها

  1. ثقافة الخلية والعلاج
    1. البذور 500،000 خلايا MCF7 في 10 سم لوحة في وسط النمو.
      ملاحظة: للحصول على سحب كل أسفل استخدمت 16 لوحات. في يوم 3، وإزالة المتوسطة وإضافة 5 مل متوسطة جديدة مع أو بدون 10 -8 M E2 إلى كلطبق. علاج الخلايا لمدة 45 دقيقة (37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي).
  2. تشعبي وخلية الحصاد
    1. إضافة 250 ميكرولتر 37٪ الفورمالديهايد في 5 مل المتوسطة لتشعبي لونين، يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وقف يشابك عن طريق غسل الخلايا مع 5 مل الجليد الباردة 1X MEM.
    2. حصاد الخلايا في 250 خلية ميكرولتر تحلل العازلة (10 ملي EDTA، 50 ملي ثلاثي حمض الهيدروكلوريك، 1٪ SDS، 0.5٪ N، N-أكسيد dimethyldodecan-1-أمين) لكل لوحة.
  3. تفتيت لونين
    1. يصوتن الخلايا لمدة 30 ثانية × 8 في أمبير من 30 لتصل إلى الأحجام لونين المطلوبة. تبريد كل عينة على الجليد بعد صوتنة من 30 ثانية.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 16، 000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وبعناية ماصة طاف دون الإخلال بيليه في القاع.
    3. اتخاذ قسامة 5 ميكرولتر من طاف، والتحقق من حجم الحمض النووي من قبل الكهربائي من خلال 1.5٪ هلام الاغاروز كما هو موضح سابقا (10). الحجم المثاليمن الحمض النووي يجب أن يكون بين 200-500 نقطة أساس.
  4. مناعي لونين
    1. وفر 25 ميكرولتر من المحللة خلية كإدخال. في أنبوب 50 مل، مزيج 4 مل من المحللة الخلية مع 20 مل العازلة IP (2 ملي EDTA، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 0.5٪ تريتون X)، ERα الأجسام المضادة (F10 500 ميكرولتر و 500 ميكرولتر HC- 20)، و 500 ميكرولتر ProtA وProtG البروتين طلاء حبات مغناطيسية. احتضان الخليط بالتناوب في 4 درجات مئوية خلال الليل للسماح بتشكيل مجمع الأضداد chromatin-.
  5. يغسل وعكس يشابك
    1. استخدام موقفا المغناطيسي لجمع حبات مغناطيسية على الجانب ممغنط لإزالة غسل العازلة.
    2. تغسل حبات مغناطيسية في 25 مل العازلة غسل الأول (2 ملي EDTA، 20 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، 01٪ SDS، 1٪ تريتون X، و 150 مم كلوريد الصوديوم). ليغسل جيدا حبات مغناطيسية دون إزعاج المجمعات الحمض النووي والبروتينات، إضافة 25 مل غسل العازلة ببطء إلى أنبوب على طول الجانب ثم عكس الأنابيب حتى كل حبات مغناطيسية بشكل جيد مختلطة وايث في غسل العازلة دون أن يبدو كما بيليه. وكبديل لذلك، استخدام المدورة إلى عكس الأنبوب. لا دوامة العينات. تغسل حبات مغناطيسية باستخدام نفس الطريقة في الخطوات التالية.
    3. تغسل حبات مغناطيسية في 25 مل غسل عازلة الثاني (2 ملي EDTA، 20 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، 01٪ SDS، 1٪ تريتون X، و 500 مم كلوريد الصوديوم).
    4. تغسل حبات مغناطيسية في 25 مل غسل عازلة الثالث (1.6 ملي EDTA، 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، 1٪ NP-40، 1٪ Dexycholate و 250 ملي LiCl).
    5. تغسل حبات مغناطيسية في 25 مل العازلة 1X TE (1 ملم EDTA، و 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك) مرتين.
    6. أزل الحمض النووي في 500 العازلة شطف ميكرولتر (1٪ SDS، و 10 ملم NaHCO 3) ومن ثم تخصيص شطف 500 DNA ميكرولتر في 4 أنابيب. لالحمض النووي من المدخلات، وأزل الحمض النووي في 125 العازلة شطف ميكرولتر.
    7. احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية خلال الليل على كتلة التدفئة. تغطية الأنابيب على كتلة التدفئة مع رقائق الألومنيوم للحفاظ على الحرارة حتى على جميع الأنابيب. وضع الوزن على الأنابيب لمنعهم من فتح. </ لى>
  6. عزل الحمض النووي
    1. تبريد أنابيب في RT لمدة 5 دقائق. عزل الحمض النووي من عينات هدم باستخدام رقاقة الحمض النووي عدة العزلة. اتبع الإرشادات من الشركة المصنعة.
      1. الاحماء عازلة شطف عند 65 درجة مئوية. إضافة 625 ميكرولتر العازلة ملزمة لكل أنبوب. إذا كانت أشكال راسب، إضافة عازلة آخر ملزم 250 ميكرولتر حتى حل واضح.
      2. تحميل العينة على العمود والطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 30 ثانية. غسل العينة مع 250 ميكرولتر غسل العازلة. تذكر لإضافة الإيثانول إلى غسل العازلة عندما المرة الأولى لاستخدامه. تكرار غسل.
      3. أزل الحمض النووي في 15 العازلة شطف ميكرولتر. الجمع بين الحمض النووي لنفسه هدم من 4 أنابيب لتحقيق حوالي 55 الحمض النووي ميكرولتر.
    2. عزل الحمض النووي الإدخال باستخدام كيت الحمض النووي تنقية.
      1. الاحماء عازلة شطف عند 65 درجة مئوية. إضافة 625 ميكرولتر العازلة ملزمة في كل أنبوب واحتضان لمدة 10 دقيقة. تحميل العينة على عمود في 2 مل collectiعلى الأنبوب.
      2. غسل العينة مع 750 ميكرولتر غسل العازلة، الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة. كرر الطرد المركزي لإزالة أي العازلة المتبقية. أزل الحمض النووي في 30 ميكرولتر من EB.
    3. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام تألقي الفحص التجاري مع تعديل 11.
      1. تمييع العازلة TE 20x وإلى 1X TE باعتبارها منطقة عازلة فحص لتمييع عينات كاشف والحمض النووي. خذ 5 ميكرولتر الحمض النووي معزولة وتمييع إلى 50 ميكرولتر في 1X TE.
      2. من 2 ميكروغرام / مل الحمض النووي المحلول جعل مستوى الحمض النووي بدءا من فارغة إلى 1، 10، 100، 1000 ميكروغرام / مل. في 96 لوحة جيدا، وتخصيص 25 ميكرولتر من كل مستوى، وكذلك تخفيف الحمض النووي في مكررة. (ينصح ثلاث نسخ للمعيار.)
      3. تحضير كاشف العمل عن طريق التخفيف-200 أضعاف من dsDNA كاشف في المخزن 1X TE في أنابيب بلاستيكية. تغطية الحل كاشف العمل مع رقائق الألومنيوم لتجنب ضوء. إضافة 200 ميكرولتر كاشف العمل في كل عينة. فيcubate في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تغطية لوحة بورق الألمنيوم لتجنب ضوء.
      4. قياس تنوير من العينات باستخدام قارئ لوحة مضان (الإثارة في 480 نانومتر، وانبعاث 520 نانومتر). توليد منحنى الحمض النووي القياسي لتنوير مقابل تركيز الحمض النووي. تحديد تركيزات من العينات على أساس منحنى مستوى الحمض النووي التي تم إنشاؤها.
  7. التحقق من تجربة رقاقة عن طريق QPCR
    1. تأخذ 2 ميكرولتر عزل الحمض النووي وتضعف إلى 20 ميكرولتر في الماء. إعداد رد فعل QPCR في ثلاث نسخ عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر تخفيف الحمض النووي، 5 ميكرولتر الخضراء أنا PCR مزيج الرئيسي، 1 ميكرولتر التمهيدي، و 1.5 ميكرولتر المياه nuclease مجانا.
    2. تشغيل QPCR مع النظام في الوقت الحقيقي PCR سريعة باستخدام البرنامج التالي: الخطوة 1: 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، الخطوة 2: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، كرر الخطوة 2 39 مرات.
  8. إرسال 10 نانوغرام عينة الحمض النووي إلى مركز للتكنولوجيا الحيوية في التسلسل.
    ملاحظة: BIOTECمركز ح يستعد رقاقة الحمض النووي في المكتبات وفقا لتعليمات ويؤدي تسلسل واحد القراءة باستخدام أساليب مفصل سابقا (2).

3. الايض الفحص تحضير عينة

  1. ثقافة الخلية والعلاج
    1. البذور 400،000 خلايا MCF7 في 10 سم لوحة في وسط النمو. لكل معاملة إعداد ثلاث عينات. استخدام اثنين من لوحات في كل عينة لتلقي ما يكفي من الخلايا للكشف. في يوم 3، وإزالة المتوسطة وإضافة 5 مل متوسطة جديدة مع أو بدون 10 -8 M E2 إلى الخلايا. علاج الخلايا لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي).
  2. جمع العينات
    1. إضافة 5 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X لوحة، ونضح برنامج تلفزيوني بعد إمالة لفترة وجيزة لوحة عدة مرات. كرر مرتين، وإزالة أكبر قدر من برنامج تلفزيوني ممكن بعد غسل الماضي.
    2. إضافة 750 ميكرولتر من الأسيتون قبل الباردة إلى كل لوحة وتتخلص من الخلايا. الجمع بين الخلايا في الأسيتون من صفيحتين فيلأنبوب 2 مل على الجليد.
    3. عدد خلايا للتطبيع
      1. لكل معاملة، استخدم اثنين من لوحات إضافية لتقدير الخلية. لإزالة إرفاق الخلايا من لوحة، إضافة 2 مل من سعادة العازلة (1X HBSS، 10 ملي HEPES، 0.075٪ NaHCO 3، و 1 ملي EDTA) في كل لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق.
      2. جمع وتخلط جيدا الخلايا بواسطة pipetting الخلايا في المخزن المؤقت سعادة. استخدام مجموعه 20 حل الخلية ميكرولتر لحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  3. تخزين العينات في -80 درجة مئوية قبل إرسالها إلى مركز الايض لتحديد وقياس نواتج باستخدام اللوني للغاز مطياف الكتلة (GC-MS) التحليل.

4. تحليل التكاملية

  1. RNA تسلسل تحليل البيانات:
    1. أداء فحص الجودة من الملفات FASTQ باستخدام FastQC: قراءة مراقبة الجودة (http://galaxy.illinois.edu)
      1. اختر FastQC: اقرأ تحت أداة من خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب. تحميل ملف البيانات الخام من التاريخ! الحاليذ.
        ملاحظة: من المستحسن أن يعطي عنوانا لملف الإخراج لتذكيرك ما كانت وظيفة للمنذ قد يكون هناك مخرجات متعددة.
    2. تنفيذ وسيظهر ملف الإخراج تحت التاريخ. كرر نفس الإجراء لكل ملف التسلسل. محولات تقليم باستخدام كليب تحت خ ع: FASTX الأدوات.
    3. محاذاة يقرأ على hg19 باستخدام Tophat2 مع RefSeq الجينوم إشارة الشرح 12 (القيم الافتراضية).
      1. اختر Tophat2 تحت أداة من خ ع: تحليل الحمض النووي الريبي. تشير إلى مكتبة يقترن نوع (نهاية واحدة مقابل إقران النهاية).
      2. تحميل ملف الإدخال FASTQ من التاريخ الحالي. تحديد الجينوم المرجعية. اختيار الإعدادات الافتراضية. أو استخدام قائمة المعلمة الكاملة لتعديل.
      3. تنفيذ، وسوف تنتج ملفين الإخراج: واحد هو UCSC BED مسار تقاطعات. آخر واحد هو قائمة التحالفات قراءة في شكل BAM.
    4. تحميل الملفات BAM إلى التسلسل أداة تحليل البيانات. حساب القيم التعبير عن الرأي كوانتأداة ification.
    5. تحديد الجينات تفاضلي يصل ينظم استخدام أداة تحليل التعبير باستخدام القيم الافتراضية وأمثالها التغيير> 2 والقيمة الاحتمالية <0.05. وبالمثل، تحديد الجينات تفاضلي أسفل ينظم باستخدام أداة تحليل التعبير باستخدام القيم الافتراضية وأمثالها التغيير <0.5 والقيمة الاحتمالية <0.05.
  2. تحليل البيانات الشذرة تسلسل:
    1. محاذاة FASTQ يقرأ لhg19 باستخدام Bowtie2 13 (القيم الافتراضية) في المجرة.
      1. اختر Bowtie2 تحت أداة من مجلس الأمن القومي: رسم الخرائط. التحقق مما إذا كانت المكتبة زميله تقرن (نهاية واحدة مقابل إقران النهاية). تحميل ملف FASTQ من التاريخ الحالي.
      2. تحديد الجينوم المرجعية. استخدام الإعدادات الافتراضية المعلمة. تنفيذ وانها ستنتج الملف الناتج مع يقرأ تسلسل معين في ملف BAM. كرر الإجراء لكل ملف التسلسل.
    2. تحديد القمم باستخدام أجهزة ماكينتوش 14 وقطع ف قيمة 6.0e-7 و روزفلت 0.01، كما هو موضح سابقا (2).
    3. تحليل البيانات الايض:
      1. تحويل أسماء كيميائية من المركبات إلى KEGG_IDs.
      2. تحديد نواتج ينظم بشكل مختلف من خلال مقارنة مستويات الكشف في سيارة مقابل. E2 معاملة عينات (تم استخدام 2 أضعاف قطع في هذه الدراسة).
    4. تحليل تكاملي:
      1. تحديد الجينات التي لديها مواقع الربط ERα باستخدام أداة تحليل البيانات التسلسل. ترجمة المناطق إلى وظيفة الجينات باستخدام 20 كيلو بايت كما المسافة الفاصلة.
      2. تحديد الجينات الصاعدة بشكل مختلف وهبوطا التنظيم من تحليل بيانات الحمض النووي الريبي يليها استخدام تغيير أضعاف> 2 وأمثالها التغيير <0.5، على التوالي مع القيمة ف <0.05 كما قطع. قارن إلى قائمة ERα الموقع ملزمة تحتوي على جينات باستخدام المقارنة الرسم البياني فين.
      3. استخدم هذه القائمة لتحديد E2 التضمين مسارات الأيض باستخدام Metscape 15 وحدة من Cytoscape.
        1. عن طريق اختيار وحدة Metscape من التطبيقات، اختر بناء شبكة وثم مسار-بسالخيار أد.
        2. حدد الكائن الحي (الإنسان). حدد ملف بيانات E2 قائمة مركب غير المنظمة (موسوعة كيوتو للجينات والمجينات ID) وكذلك E2 قائمة الجينات يصل تنظيم.
        3. اختيار مجمع -Reaction -Enzyme الجينات كنوع الشبكة. اختيار مجمع / الجينات كما الاستعلام.
        4. بناء الشبكة. كرر باستخدام E2 المجمع والجينات أسفل التنظيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transcriptomics
لتحليل الجينات وأعرب تفاضلي عن طريق العلاج E2، اخترنا لإجراء تجربة-RNA يليها. بالإضافة إلى توفير المعلومات حول مستويات مرنا، يمكن للبيانات الحمض النووي الريبي يليها أيضا أن تستخدم لرصد التغيرات في (الرنا طويلة غير الترميز، الرنا الميكروية) غير الترميز الحمض النووي الريبي والأحداث الربط البديلة. نحن لم تقدم المعلومات على تحليل الجينات غير الترميز الرنا أو نسخها بدلا من ذلك، لأن نطاق دراستنا هو تحديد الجينات ترميز البروتين التي تعتبر مهمة لتنظيم الأيض. ومع ذلك، RNA تسلسل هو وسيلة ممتازة للحصول على معلومات عن أحداث التعبير الجيني التفاضلية.

من أجل الحصول على جودة عالية يقرأ، فمن المهم الحصول على ارتفاع RNA النقاء. بعد عزل الحمض النووي الريبي نحن تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي تنظيف عدة. للأسف فقدت ما يقرب من 50٪ من الحمض النووي الريبي خلال هذه العملية، وينبغي أن تؤخذ كمية من بدء RNA إلى جonsideration للحصول على الكمية المطلوبة (100-500 نانوغرام) بنهاية خطوة التنقية.

نحن كميا غلة الحمض النووي الريبي باستخدام التألق RNA HS الفحص، التي هي دقيقة جدا وغير الأسلوب المفضل لالكمي من الحمض النووي الريبي وفرة منخفضة. بعد ذلك، تم فحص سلامة والجودة الشاملة للعينات الحمض النووي الريبي باستخدام bioanlayzer، الذي هو بديل قابل للتطبيق لالكهربائي للهلام باستخدام كمية ضئيلة من الحمض النووي الريبي. ويظهر تحليل جميع العينات لها العصابات حادة ونظيفة من 18S و 28S rRNAs مما يدل على سلامة ونقاء العينات (الشكل 2B). RNA النزاهة عدد (رين) كان يستخدم كمعيار لمراقبة الجودة الحمض النووي الريبي. رين 10 يشير RNA سليمة، رين 6 المتدهورة جزئيا وRIN3 تدهورت بشدة 16.

فمن المستحسن أن رين أن يكون لا يقل عن 7 لتجربة التسلسل. كل من عينات الحمض النووي الريبي لدينا تلقى قيمة رين بين 9،6-9،9 <قوي> (الشكل 2A). تم إنشاء مكتبات التسلسل من 500ng من الحمض النووي الريبي عالية الجودة من كل عينة باستخدام نظام التسلسل فائقة الإنتاجية مثل البورشيد 2500. وفي المتوسط ​​التسلسل 18،000،000 عالية الجودة يقرأ تم الحصول عليها لكل عينة (الجدول 1)، والذي كان على استعداد لمجرى النهر تحليل. للتحقق من الجودة الشاملة للالإنتاجية العالية البيانات الخام تسلسل، تم تشغيل FastQC ليقرأ كل العينة. وقد أظهر تقرير FastQC التمثيلي للبيانات واحدة مركبة RNA وما يليها (الشكل 3). كان طول سلسلة من أكثر يقرأ حوالي 100 سنة مضت (الشكل 3A). لكل قراءة، وكانت النتيجة جودة 32-34 لشركة بريتيش بتروليوم 5 الأول و36-38 من 6-100bp (الشكل 3B). بين 17990863 يقرأ المتولدة من هذه العينة، وكان معظمهم من نوعية أعلى درجة من 34 (الشكل 3C). وجاء محتوى GC في قراءة في تسلسل أيضا التوزيع الطبيعي بمتوسط ​​قدره 48٪ GC. العامة للجودةوكانت النتيجة من يقرأ عالية جدا.

تحليل Cistromic من مواقع الربط ERα
لتحقيق تسلسل عميق كفاءة، والحصول على شظايا من الحمض النووي في الحجم المرغوب فيه هو واحد من العوامل الهامة. قد يكون نهج التسلسل الحالية متطلبات مختلفة على شظايا الحمض النووي، وعلى سبيل المثال 300-600 نقطة أساس لنظام التسلسل فائقة الإنتاجية العالية، 100-200 نقطة أساس لAB / الصلبة 17. في هذه التجربة أكثر من شظايا الحمض النووي ما بين 300 و 600 سنة مضت بي بي كما هو موضح على هلام (الشكل 4). وكبديل لذلك، والقراء قد اختار لإعداد لونين وذلك باستخدام MNase الهضم، ولكن نحن نشعر يوفر لدينا بروتوكول المعمول العينات المطلوبة مع ذات جودة عالية، ويوفر نتائج استنساخه. وقد أعد عشر نانوغرام من الحمض النووي من كل معاملة وإدخال عينة المقابلة لها في المخزن EB. كان رقاقة الحمض النووي واحدة للقراءة متسلسلة باستخدام نظام التسلسل فائقة الإنتاجية. أسفرت عينات الحمض النووي رقاقة حول20،000،000 يقرأ في حين حقق الحمض النووي إدخال أكثر من 35.000،000 يقرأ (الجدول 1).

الايض
لقياس نواتج الأيض في خلايا الثدييات باستخدام GCMS، لا يقل عن 10 ميكروغرام من كتلة الخلايا المطلوبة. بدأنا مع 400،000 خلايا MCF7 مع التجارب. قبل وقت الحصاد، كان هناك حوالي 500،000 الخلايا في كل لوحة. وتمت مقارنة محة عامة عن الأيض ممثلة القمم بين وحدة التحكم وعينة استراديول المعالجة (الشكل 5). وقد تم تحديد نحو 100 الأيض، التي تعول على 60٪ من إجمالي المعروفة في mammalians. نحن هنا تقديم قائمة أكبر 10 الأيض، والتي تظهر تغييرات كبيرة في معالجة E2 (الجدول 2). وعموما، upregulated E2 مسارات بما في ذلك سكر الفواكه والتمثيل الغذائي المانوز، والتمثيل الغذائي الحامض الاميني، والتمثيل الغذائي البيورين، والكولسترول الحيوي والتمثيل الغذائي فيتامين B3. وكانت مسارات downregulated butanoate metabolisم، دي نوفو الدهنية الحيوي حامض، سبيل فسفات البنتوز، دورة اليوريا والتمثيل الغذائي للأرجينين (الجدول 3).

تحليل البيانات والتكامل
تم معالجة البيانات من RNA تسلسل، رقاقة تسلسل وGC-MS وتحليلها من خلال سلسلة من الخطوات (الشكل 6). وبعد المقارنة بين الجينات التي تم تحديدها في RNA تسلسل ورقاقة تسلسل، مجموعة واحدة تصل التنظيم و انتزعت مجموعة واحدة من الجينات التنظيم بنسبة استراديول. من البيانات الأيض، حصلنا على مجموعتين من المركبات الأعلى وينظم أسفل من العلاج استراديول. التالي كنا Metscape، التطبيق لCytoscape، لتصور وتفسير التعبير الجيني والبيانات التمثيل الغذائي في سياق عملية التمثيل الغذائي الإنسان 15. أولا اخترنا لتشمل عناصر من المجمع، رد فعل، الانزيم، والجينات في الشبكة. اخترنا المركبات / الجينات كما الاستعلام وشبكتين للE2 يصل التنظيم (الشكل 7A) وهبوطاوقد أظهرت -regulation (7B الشكل). كما يوفر Metscape خيار لبناء شبكات على مسارات انتقائية. على سبيل المثال، باستخدام نفس مجموعة من البيانات وبناء شبكة شاملة التنظيم إلى أسفل، وإنشاء الشبكة الفرعية من الاندروجين استروجين الحيوي والتمثيل الغذائي الطريق عن طريق تحويل الاستعلام من مجمع / الجيني لمسار محدد. وسلط الضوء على الجينات أو مركبات مع تغييرات كبيرة في اللون أكثر إشراقا. وإلى جانب اختيار مسار محدد من النافذة المنسدلة كما هو موضح، يمكن للمرء أيضا إنشاء شبكة فرعية عن طريق تطبيق "إنشاء الشبكة الفرعية" وظيفة إلى المنطقة المختارة. كما هو مبين في الشكل 6A و B، ERα تفعيل وملزم مباشرة إلى مناطق الجينات التنظيمية أثرت على العديد من المسارات الأيضية في خلايا سرطان الثدي. وأشار تحليلنا التكاملي ذلك، ERα يربط مباشرة إلى وينظم التعبير الجيني FASN، وهو أمر مهم لدي نوفو الدهنية حمض الحيوي المسار (Figure 7C). وبالإضافة إلى ذلك العلاج E2 downregulated مسارات الحيوي على الاندروجين استروجين عن طريق قمع التعبير عن CYP4Z1، CYP2E1، CYP4B1، CYP2C8، TPO، GSTA4 وGSTM2 في هذه الممرات.

الشكل 1
الشكل 1: سير العمل إعداد عينات من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ولست] خلية للRNA تسلسل، رقاقة تسلسل، وتحليل Metabolomic.

الشكل 2
الشكل 2: ورحلاني التمثيلي للالرنا تحليلها مع اجيلنت 2100 Bioanalyzer RNA النزاهة عدد (رين)، مؤشر على الحمض النووي الريبي الجودة، والتي قدمها التحليل على النحو 9.9. (A) في صورة هلام افتراضية من الحمض النووي الريبي عينة كل من العصابات من 26S و 18S حادة. (ب) إشارات فلوري من أثر الفرد في تيقال النووي الريبي يدل على أن شدة 28S الذروة هو أكبر من 18S الذروة ويعتبر عدم وجود تلوث. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
تم تحليل وفحص الجودة نموذجي على البيانات الخام RNA بعدها واحدة من تسلسل البيانات العينة المركبة باستخدام FastQC: الرقم 3. (أ) توزيع طول سلسلة من المكتبة وهو 100 نقطة أساس. (ب) درجة جودة على طول الموقف في القراءة. (C) ودرجة الجودة في تسلسل أظهر عالية الجودة العالمية لجميع متواليات. (D) ومحتوى GC في القراءة مطابقة للتوزيع النظري. الرجاء انقر هنا لعرض لانسخة rger من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: جل الكهربائي من شظايا لونين sonicated تم تشغيل 5 ميكرولتر من المحللة خلية من كل عينة على هلام الاغاروز 1.5٪ مع 1000 بي بي زائد سلم على المسار الأول. الغالبية العظمى من شظايا ما بين 300 و 600 نقطة أساس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل (5): إن نظرة عامة على قمم تمثل الأيض من GC-MS تعرض اللوحة العليا القمم التي تم تحديدها في عينات E2 تعامل مع لوحة أقل من عنصر التحكم. المنطقة المغلقة وغرفة نوم في لعرض الأيض المحدد الذي يمثله كل ع EAK. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: مخطط لطريقة تجميع التكاملية.

الرقم 7
الرقم 7: التصور للبيانات متكاملة الجينات الأيض في Metscape (A) وشبكة من الممرات يصل ينظمها E2. (ب) وشبكة من الممرات أسفل ينظم من قبل E2. (C) E2 حفز التوظيف ERα إلى المنطقة القريبة من FASN، التي وجدت أن ينظم في دي نوفو الأحماض الدهنية شبكة الحيوي الناتج عن تطبيق وظيفة الشبكة الفرعية.3832fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: ملخص لتسلسل فائقة الإنتاجية العالية من الحمض النووي الريبي تسلسل ورقاقة تسلسل.

الجدول 2
الجدول 2: قائمة أكبر 10 الأيض مع تغييرات كبيرة مع العلاج E2.

الجدول 3
الجدول 3: مسارات الأعلى وإلى الأسفل ينظمها العلاج E2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة، وصفنا جيل والتحليل التكاملي من الحمض النووي الريبي تسلسل، رقاقة تسلسل والبيانات الايض من MCF-7 الخلايا التي يتم التعامل مع E2. قمنا بتطوير مجموعة من بروتوكولات وضع استراتيجيات للاستفادة من الأساليب الأكثر فعالية وسهولة التركيبات الناعمة الودية التي تنتج اكتشاف بيولوجيا. على حد علمنا، لنا هي أول دراسة لدمج البيانات -omics من ثلاثة تحليل مختلف وتحديد المسارات الأيضية الجديدة التي ERα تنظيم مباشرة في خلايا سرطان الثدي.

Transcriptomics
ومن الأهمية بمكان أن تبدأ مع الرنا ذات جودة عالية لتحليل transcriptomic ناجحة. والممارسات الجيدة القضاء على فرصة للتدهور الحمض النووي الريبي، بما في ذلك إنشاء مقاعد البدلاء ريبونوكلياز خالية، وتغيير القفازات في كثير من الأحيان، وتخزين في -80 درجة مئوية، والحفاظ على الجليد في الاستخدام. إضافة الحضانة بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية تحسن الانتعاش الحمض النووي الريبي. لتجنب التجميد والذوبان RNA مرارا وتكرارا، يمكن للمرء أن تخصيص الرنا عن الاجراء المصبوفاق على عزل وتنقية. لوجود أخطاء التسلسل، QRT-PCR باستخدام كدنا] من العينات غالبا ما يؤديها للتحقق من الجينات وأعرب تفاضلي المحددة في RNA تسلسل. لذلك، يجب أن تكون محفوظة يكفي RNA لهذا الغرض. ونحن أداء إقران نهاية التسلسل التي تمكننا من تحليل المتغيرات لصق، غير الترميز الرنا وmiRNAs. لتجنب ارتفاع تكاليف التسلسل، نهاية واحدة التسلسل لا يمكن أن يؤديها كذلك. مقارنة المجهرية، RNA تسلسل هو أكثر حساسية ولا يقتصر على تحقيقات المقدمة على رقاقة. نحصل على المعلومات ليس فقط على تسلسل الترميز، ولكن أيضا على الجينات غير الترميز والنصوص تقسم بشكل مختلف. ونحن في الوقت الحاضر استخدام هذه التقنية لتحليل ترنسكربيتوم من خطوط الخلايا المختلفة بعد العلاج يجند وكذلك الأنسجة التي تم الحصول عليها من التجارب الماوس.

Cistromics
وتتطلب هذه الطريقة فائقة الإنتاجية العالية التسلسل الحد الأدنى من 5 نانوغرام رقاقة الحمض النووي لبناء مكتبة. في معيار الفصل، فمن المستحسن-IP يليها بروتوكول 18 أن يكون لديها لا يقل عن 10 نانوغرام. الكميات مع التألق أمر بالغ الأهمية. في هذا البروتوكول كنا مزدوج حبلا اكتشاف الحمض النووي فحص لتحديد تركيز الحمض النووي. يمكن للمرء أيضا استخدام التألق فحص الحمض النووي لالكمي الدقيق. للاختلافات في المعدات والمواد، من المهم جدا لكل مختبر لإنشاء بروتوكول بهم صوتنة الخاصة، التي تولد مرغوب فيه الحمض النووي شظايا الأحجام. الإفراط في قص شرائح الحمض النووي قد يسبب فقدان إثراء السلطات الوطنية المعينة الهدف بينما رقاقة الحمض النووي من الأحجام الكبيرة تخلق مشكلة لتسلسل كفاءة. قبل تقديم الحمض النووي لتسلسل، فمن المهم دائما للتحقق من إثراء بعض المناطق المعروفة QPCR. لا تزال هذه التقنية محدودة من كفاءة وخصوصية الأجسام المضادة المستخدمة في immunoprecipitations. للحصول على معلومات الموقع الملزمة التي يمكن استخدامها بشكل صحيح في التحليلات المقارنة، ونحن تحقق من الكواشف لدينا وفقا للمعايير رقاقة يليها ترميز و 19 و استخدام القياسيهبروتوكولات dized التي تقدم لنا مع مجموعات بيانات متسقة. إلى جانب تحليل تخصيب موقع ملزم عامل آخر النسخ، ورقاقة تسلسل لا تزال واحدة من أفضل الطرق لتحديد ملزمة مباشرة من عوامل النسخ إلى لونين. ونحن في الوقت الحاضر استخدام هذا البروتوكول لدراسة تحركات التوظيف، coregulators وعوامل النسخ الأخرى لونين في خطوط الخلايا الأخرى، وكذلك هرمون الاستروجين الأنسجة الماوس استجابة.

الايض
لالتنميط التمثيل الغذائي الناجح في خلايا سرطان الثدي البشرية، وإعداد نموذج دقيق أمر بالغ الأهمية. كمية من الخلايا في استخدام وحالة زراعة الخلايا في هذا البروتوكول هو الأمثل للخلايا MCF7. قد تتطلب خطوط الخلايا الأخرى أكثر أو أقل الخلايا للكشف عن عدد كبير من المركبات. نحصل على حوالي 100 من الأيض في كل تجربة. يقتصر هذا الأسلوب للكشف عن الأيض لم تدم طويلا او نواتج التي تكون موجودة بتركيزات منخفضة. هذا الأسلوب يوفر سهولة باليودنانوغرام عينة الإعدادية واحد لتحديد نواتج متعددة. ونحن في الوقت الحاضر استخدام هذه التقنية لتحديد الاستروجين الأيض ينظم في مصل الدم والأنسجة المختلفة من الماوس.

تكامل البيانات
وقد أجريت العديد من الدراسات transcriptomics وcistromics للتحقيق مما يشير الى هرمون الاستروجين وتنظيم الجينات في خلايا سرطان الثدي، بما في ذلك الخلايا MCF7 2،5-7،20. في هذه الدراسة، وأضاف أننا لأول مرة بيانات الايض وحاول أن نستنتج شبكات الأيضية التي تنظم بشكل مباشر ERα على إضافة يجند. هذا النهج رواية مكنتنا من أجل تحديد circuitries الجزيئية التي ينظمها هرمون الاستروجين التي تؤثر على الأيض الخلوي. وعموما، نتائجنا تدعم دور ERα كمنظم رئيسي للبيولوجيا سرطان الثدي.

وباختصار، قدمنا ​​خلاصة وافية مفصلة من بروتوكولات لجيل من الحمض النووي الريبي تسلسل، يليها رقاقة والايض عينات من خلايا سرطان الثدي بعد الاستروجين العلاجات وintegrتحليل ative من البيانات التي تم الحصول عليها من هذه المناهج -omics. وهذه البروتوكولات تمكين الباحثين للقيام تحليل مماثل لعوامل النسخ الأخرى، بروابط مستقبلات النووية والظروف الغذائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تلقت جامعة إلينوي منحة باحث شرع من شركة فايزر ZME وتلقى YCZ دعم راتب من هذه المنحة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للأغذية والزراعة، وزارة الزراعة، جائزة ILLU-698-909 (ZME) وفايزر، وشركة (ZME). محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية لوزارة الزراعة الأمريكية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Tags

الطب، العدد 109، RNA تسلسل، Transcriptome على، رقاقة تسلسل، cistrome، الايض، هرمون الاستروجين وسرطان الثدي
علم الأحياء نظم تنظيم التمثيل الغذائي عن طريق مستقبلات الاستروجين في اشارة الى سرطان الثدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter