Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران

Published: May 4, 2016 doi: 10.3791/53833
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

Introduction

يقيس فحص القلوية المذنب فواصل حبلا الحمض النووي على مستوى خلية واحدة. هي جزء لا يتجزأ تعليق من الخلايا وحيدة في الاغاروز على شريحة المجهر والخلايا هي lysed لتشكيل nucleoids، والتي تحتوي على حلقات supercoiled من الحمض النووي. الكهربائي في الرقم الهيدروجيني> 13 النتائج في فقدان supercoiling في الحلقات الحمض النووي التي تحتوي على فواصل حبلا، مع فروع سراح من الحمض النووي الهجرة نحو القطب الموجب، وخلق هياكل تشبه المذنب التي يمكن ملاحظتها بواسطة المجهر مضان. الحمض النووي مجزأة يهاجر من "الرأس" من المذنب في "ذيل" على أساس حجم جزء، ومضان النسبي للذيل المذنب بالمقارنة مع كثافة الإجمالية (الرأس والذيل) يمكن استخدامها لتحديد الحمض النووي الكسر 1 ، 2. فحص بسيط، حساسة، وتنوعا، سريع، وغير مكلفة نسبيا 1. ويستخدم للكشف عن الحمض النووي مجزأة الناجمة عن عوامل ضارة الحمض النووي للفحص لتحديد كمية الحمض النووي من التلف في الخلايا أو عزل نواة من indiviالأنسجة المزدوج من الحيوانات تعامل مع المواد السامة للجينات يحتمل أن تكون (الصورة). نظرا لمزاياها، وأوصى في الجسم الحي المذنب مقايسة كما في الجسم الحي السمية الوراثية الفحص الثاني (يقترن في الجسم الحي للفئران الاختبار) لإجراء تقييم سلامة المنتجات في المؤتمر الدولي الحالي على مواءمة (ICH) (3) وهيئة سلامة الأغذية الأوروبية (EFSA ) 4 المبادئ التوجيهية التنظيمية. في المختبر، ونحن قد استخدمت فحص لتقييم في الحمض النووي من التلف الجسم الحي الناجم عن المكونات الغذائية والأدوية والمواد النانوية 5-10. وسيتم استخدام كبد الفئران كمثال في هذا البروتوكول، ولكن مقايسة المذنب لا يمكن أن يؤديها مع الأنسجة الأخرى / أجهزة حيوانات التجارب، طالما الخلايا واحدة سليمة يمكن عزلها عن الأنسجة.

أنواع معينة من الحمض النووي من التلف صعبة للكشف عن فواصل حبلا الحمض النووي من دون تعديل فحص القلوية المذنب الأساسي. في حالة الحمض النووي من التلف التأكسدي، حبلا بيمكن إنشاء reaks في الآفات التأكسدي في الحمض النووي عن طريق هضم مع الانزيمات إصلاح مثل الإنسان 8 oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 (hOGG1، مما يخلق فواصل في 8 oxoguanine (8 oxoGua) وميثيل fapy-جوانين 11. أيضا، نوكلياز داخلية الثالث (إندو الثالث) يخلق فواصل أساسا في البريميدينات أكسدة 1. وهكذا، إضافة خطوة انزيم الهضم يجعل فحص طريقة محددة وحساسة لقياس الحمض النووي من التلف التأكسدي في الجسم الحي (12). وباستخدام هذه المقايسات، لقد أثبتنا التي يسببها التسمم الحمض النووي من التلف التأكسدي في كبد الجرذان والفئران 6-8 وفي قلب الفئران 10.

فحص القلوية المذنب العديد من التطبيقات في علم السموم وراثية والرصد الحيوي الإنسان: 1)، ومتابعة في فحص الجسم الحي لgenotoxins التي حددها حساسة في المختبر اختبارات 3،13، 2) لتقييم آليات الحمض النووي من التلف الناجم عن أجنبي بيولوجيا في أنسجة متعددة 14، 3) للتحقيق في ما إذا كانمادة مسرطنة تعمل باستخدام السمية الوراثية أو وضع غير السمية العمل (وزارة الزراعة) 7، 4) لتقييم إصلاح الحمض النووي الضرر 15، 5) للتحقيق في الأمراض التي تصيب الإنسان والتعرض المهني 16، و 6)، ومحتمل الإنتاجية العالية فحص الكشف عن جهاز معين السمية الوراثية 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على إجراءات تنطوي على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في / مركز الولايات المتحدة FDA الوطني للبحوث السمية: الأخلاقيات بيان.

ملاحظة: تصميم الدراسة وصفه هنا على أساس بروتوكول الذي وضعه المركز الياباني للالتحقق من الطرق البديلة (JaCVAM) لصلاحيتها للمقايسة في الجسم الحي القوارض القلوية المذنب 18، ومواصلة تعديله بناء على توصيات في منظمة التعاون والتنمية التوجيهي TG489 19 .

1. إعداد

  1. إعداد الشرائح
    1. حل الاغاروز ذوبان العادية بنسبة 1٪ (ث / ت) في العازلة الفوسفات (كا 2+، والمغنيسيوم 2+ مجانا والفينول الأحمر الحرة) عن طريق التسخين في فرن الميكروويف.
    2. وضع حل المنصهر 1٪ معيار الاغاروز في 55 ° C حمام الماء وتوازن درجة الحرارة مع الحمام. تراجع الزجاج المجهر الشرائح في حل الاغاروز، تصريف أي excesق الاغاروز ويمسح الجزء الخلفي من الشرائح نظيفة. ضع الشرائح في وضع مستقيم على سطح مستو، والسماح للشرائح حتى يجف في RT. تخزين الشرائح في مكان جاف.
  2. تحضير محاليل فحص المذنب
    1. تحضير 0.5٪ منخفضة ذوبان الحل الاغاروز. حل منخفضة ذوبان الاغاروز في العازلة الفوسفات (كا 2+، والمغنيسيوم 2+، والفينول مجانا الأحمر) عن طريق التسخين في فرن الميكروويف. إبقاء الحل في 37-45 درجة مئوية خلال إعداد الشرائح المذنب. تجاهل أي حل الاغاروز المتبقية بعد ذلك.
    2. إعداد تحلل العازلة. جعل حل 100 ملم من الصوديوم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (ثنائي الصوديوم EDTA، السيد 372.24 غ / مول)، و 2.5 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم، والسيد 58.44 جم / مول)، و 10 ملي تريس hydroxymethyl aminomethane (تريس قاعدة، السيد 121.14 غ / مول) في الماء النقي، وضبط درجة الحموضة إلى 10 مع 10 N محلول هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم، السيد 40 جم / مول). في يوم من الاستخدام، إضافة تريتون X100 وسلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس، السيد 78.13 غرام / مول) إلى حل لتحقيق ويركز النهائيالأيونات من 1٪ و 10٪ على التوالي، ويقلب في 4-10 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    3. جعل عازلة إنزيم جديد في يوم من الاستخدام. تحضير محلول يحتوي على 40 ملي 2- [4- (2-هيدروكسي) piperazin-1-YL] ethanesulfonic حمض (HEPES، السيد 238.3 غرام / مول)، و 100 ملي كلوريد البوتاسيوم (بوكل، السيد 74.55 جم / مول)، و 0.5 ملم EDTA ثنائي الصوديوم، و 0.2٪ زلال المصل البقري (BSA، السيد 66463 جم / مول) في الماء النقي. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع 10 حل N هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH، 56.1 غرام / مول). إثارة في RT وتحقق حل كامل قبل استخدامها.
    4. يعد حل العازلة القلوية التي تحتوي على 300 ملي هيدروكسيد الصوديوم و 1 ملي EDTA ثنائي الصوديوم في الماء النقي. إثارة في 4-10 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. قياس درجة الحموضة من الحل قبل استخدامها والتأكد من درجة الحموضة> 13.
    5. إعداد محلول 0.4 M قاعدة تريس في الماء النقي، وضبط لدرجة الحموضة 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك، والسيد 36.46). تخزين الحل في 4-10 درجة مئوية. هذا هو تحييد العازلة.
    6. جعل وresh تنميق عازلة في يوم من الاستخدام. تحضير محلول يحتوي على 20 ملي ثنائي الصوديوم EDTA و 10٪ DMSO في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS، كاليفورنيا 2+، والمغنيسيوم 2+، والفينول الأحمر الحرة). تخزين على الجليد حتى الاستخدام.
    7. لإعداد حل تلطيخ، وتمييع النووي حمض فلوري حل الأسهم وصمة عار مع تريس، بورات-EDTA (عازلة TBE) في 1: 10000 (ت / ت). حماية حل من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. متجر في 2-8 درجة مئوية، وتستخدم مع 24 ساعة.

2. إعداد تعليق خلية واحدة من كبد الفئران

  1. الموت ببطء الفئران مع CO الطرق التالية غاز 2 الموصى به في المبادئ التوجيهية الطبية البيطرية الأمريكية للالقتل الرحيم للحيوانات: 2013 الطبعة 20.
    1. ضبط معدل تدفق CO 2 في 2.75. وضع فأر في غرفة القتل الرحيم (على سبيل المثال، جرة مجفف، قفص الفئران مع غطاء تنفيس) وتشغيل CO 2 عن طريق فتح صمام خزان. انتظر 1،5-2،5 دقيقة حتىالفئران يصبح فاقدا للوعي. زيادة تدفق CO 2 إلى وضع الحد الأقصى لها. بعد التوقف عن التنفس، وترك الفئران في الغرفة لحوالي 1 دقيقة لضمان القتل الرحيم. تحقق من القتل الرحيم والتلمس للتأكد من أن الفئران لا يوجد لديه ضربات القلب، ومعسر أصابع القدم لتحديد أن الفئران لا تنسحب أطرافهم لها.
  2. تطهير الجلد الشعر مع 70٪ من الإيثانول. فتح تجويف البطن وإزالة الكبد سليمة مع مقص جراحي. بعد إزالة الكبد، وإزالة الفص الجانبي الأيسر من الكبد المتبقية مع مقص جراحي. وضع الفص الجانبي الأيسر على لوح التقطيع، وقطع قطعتي 3-4 ملم المقاطع العرضية سميكة باستخدام المتاح واحدة للفوز شفرة حلاقة.
  3. وضع المقطع العرضي واحدة على ورق الترشيح (لمنع الشباك من القسم)، ووضع القسم في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة (NBF). تأكد من أن نسبة 10٪ بنك الفجيرة الوطني النسيج هو 10: 1 أو أكثر. بعد وقت التثبيت من لا يقل عن 72 ساعة، بروكوفاق سطيف الكبد عن التشريح المرضي (انظر القسم 7 أدناه).
  4. وضع قسم الكبد عرضية الثاني إلى 5 مل الجليد الباردة تنميق عازلة (القسم 1.2.6) في طبق بيتري 6 سم وشطف 3 مرات لإزالة بقايا الدم.
  5. نقل قسم الكبد لأنبوب الطرد المركزي 2 مل جديدة تحتوي على 1 مل العازلة تنميق الجليد الباردة. تخطر على قسم الكبد تشطف جيدا مع زوج من مقص غرامة للافراج عن الخلايا. توتر تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون لإزالة أي كتل الأنسجة.
  6. ضع تعليق خلية واحدة على الجليد واستخدامه لإجراء الشرائح داخل 1 ساعة. تحقق من تركيز الخلايا عن طريق عد (على سبيل المثال، مع عدادة الكريات أو مكافحة الخلايا الالكترونية) لضمان أن تركيزه حوالي 2 X10 6 خلية / مل.

3. إعداد المذنب الشرائح

  1. مزيج حجم واحد من تعليق خلية واحدة مع 10 مجلدات من المنصهر، 37 درجة مئوية، و 0.5٪ منخفضة ذوبان الحل الاغاروز (القسم 1.2.1).على الفور ماصة 100 ميكرولتر على شريحة المغلفة مع منتظم الاغاروز نقطة انصهار (القسم 1.1). المكان على الفور زلة غطاء فوق مزيج خلايا الأغاروس. جعل لا يقل عن 8 شرائح لكل عينة.
    ملاحظة: يجب تحديد كافة الشرائح برقم أو رمز مشابهة وسجلت هويتهم، بحيث الشرائح يمكن وسجل بطريقة أعمى (انظر 6.2.2 أدناه).
  2. وضع الشرائح شقة وباردة إلى 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. بعد أن عزز الجل، وإزالة بلطف زلات غطاء وتزج الشرائح في تحلل العازلة قبل المبردة (القسم 1.2.2). حماية الشرائح من الضوء والحفاظ على الشرائح في تحلل العازلة عند 4 درجات مئوية من 1 ساعة (الحد الأدنى) إلى O / N (كحد أقصى).

4. العلاج الإنزيم من المذنب الشرائح

  1. إزالة 6 من 8 الشرائح المحضرة من كل عينة من نسيج العازلة تحلل وشطف لهم 3X لمدة 5 دقائق كل العازلة مع انزيم (القسم 1.2.3) في RT. استخدام الشرائح المتبقيتين لفحص القلوية المذنب ثithout انزيم العلاج (انظر 5.1 أدناه). بعد الشطف، وإزالة السائل الزائد عن طريق تجفيف والنشاف الشرائح مع الأنسجة.
  2. تمييع hOGG1 وإندو الثالث الأسهم الانزيم مع العازلة انزيم في 1: 1000 (ت / ت). ضع على الجليد حتى الاستخدام.
  3. تطبيق 200 ميكرولتر من الحلول التالية على الشرائح المحضرة من كل مجموعة العلاج: 200 ميكرولتر من العازلة انزيم وحدها (2 الشرائح تستخدم الشرائح المرجعية)، 200 حل ميكرولتر hOGG1 (2 شرائح) أو 200 ميكرولتر إندو الثالث حل (2 الشرائح).
  4. وضع الشرائح في لوحات بيتري اصطف مع المناشف الورقية مبلل، تغطية الشرائح مع بارافيلم، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لاندو الثالث المعاملة والشرائح إشارة و 30 دقيقة للشرائح المعالجة hOGG1.
  5. بعد الحضانة، وشطف الشرائح مع الماء المقطر ومتابعة المعالجة كما هو موضح في 5.2 أدناه.

5. الفك والكهربائي

  1. لالشرائح لا تعامل مع الإنزيمات، وإزالة الشرائح من تحلل العازلة، واستنزاف الشرائح وشطف مرة واحدة مع العازلة تحييد الباردة (القسم 1.2.5) لمدة 5 دقائق لإزالة المنظفات المتبقية والأملاح.
  2. مكان الشرائح من خطوات 4.5 و 5.1 عشوائيا في أفقي خزان الكهربائي للهلام، وتجنب أي مسافات. ملء الخزان مع تقدم طازجة الرقم الهيدروجيني> 13 العازلة الكهربائي (القسم 1.2.4) حتى يغطي مستوى السائل فقط الشرائح (تجنب فقاعات على الاغاروز وتأكد من أن خزان مستوى). تسجيل درجة الحموضة العازلة ودرجة الحرارة في بداية تفكيك الحمض النووي.
  3. دعونا لا تزال الشرائح في المخزن المؤقت القلوية لمدة 20 دقيقة للسماح للاسترخاء من الحمض النووي والتعبير عن الضرر القلويات مسؤولا.
  4. أثناء الفك، برنامج امدادات الطاقة لإنتاج 0.7 V / سم في الخزان الكهربائي (V / سم = فولت مقسوما على المسافة بالسنتيمتر بين الأقطاب الموجبة والسالبة).
  5. بعد الفك، اضغط على زر التشغيل على امدادات الطاقة. إذا لزم الأمر، وضبط الحالي إلى 300 مللي أمبير من خلال رفع أو خفض مستوى العازلة. تبقي عشرمستوى عازلة البريد فقط فوق سطح الشرائح. أداء الكهربائي في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تسجيل وضع الشرائح، ودرجة حرارة المخزن المؤقت والحالية (الامبير) في بداية ونهاية الكهربائي.
    ملاحظة: الكثير من العازلة يؤدي إلى انخفاض الفولتية التي يمكن أن تتداخل مع الحمض النووي للهجرة.
  6. بعد الكهربائي، وتحييد القلوية الزائدة عن طريق رفع بلطف الشرائح من دبابات وتخبط في المخزن تحييد (القسم 1.2.5) لمدة 5 دقائق. استنزاف الشرائح وكرر مرتين أخريين.
  7. إصلاح الشرائح عن طريق غمر في البرد الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. السماح للشرائح في الهواء الجاف ومكان في منطقة جافة للتخزين.

6. الحمض النووي تلطيخ، المذنب التصور والتحليل

  1. تلطيخ DNA
    1. ضع الشرائح على صينية من الورق المقوى أو المعدن وإضافة 200 ميكرولتر من الحل وصمة عار العمل النووي حمض الفلورسنت (القسم 1.2.7) على كل شريحة، وتغطي مع انزلاق الغطاء الزجاجي. حماية الشرائح منضوء تسمح الشرائح للبقاء على اتصال مع حل تلطيخ لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التهديف. وصمة عار على الشرائح في دفعات من 20 في وقت واحد.
    2. قبل قراءة كل شريحة، وصمة عار بلطف بعيدا حل تلطيخ الزائد، والحرص على عدم تعكير صفو غطاء زجاجي.
  2. التصور المذنب وتسجيل النقاط
    1. استخدام كاميرا فيديو مثبتة في مضان المجهر لمشاهدة الصور الحية من الشريحة المذنب على شاشة الكمبيوتر.
    2. عشوائيا اختيار مجال المجهر تحتوي على خلايا. باستخدام الماوس، حدد خلية. انقر على مركز "رأس المذنب" مع ضغطة والأيسر للفأرة.
      ملاحظة: برامج الكمبيوتر بحساب جميع المعلمات قياس للخلية ويضيف البيانات إلى ملف البيانات.
    3. يسجل كل الخلايا في الحقل الحالي (راجع الخطوة 6.2.4)، ومن ثم استخدام عناصر التحكم مرحلة المجهر والفيديو التي تظهر على الشاشة للعثور على مجموعة أخرى من الخلايا. يسجل هذه الخلايا كما هو موضح في 6.2.2.
    4. يسجل و الشرائحمدمج اليمين إلى اليسار وأسفل إلى أعلى. اختيار حوالي 10 حقول عشوائيا. وخلال هذه العملية، أي خلية المذنب المناسبة التي تظهر في مجال الرأي يجب أن يكون سجل دون تحيز.
      ملاحظة: لا يسجل المذنب إذا كان أي من التالية صحيحا: 1) يقع على أي من حواف الشريحة. 2) اثنين أو أكثر من المذنبات تتداخل. 3) هناك الحطام في الذيل. 4) والبرنامج لا يمكن التفريق بين الرأس والذيل. أو 5) تلطيخ للنواة و / أو ذيل يختلف كثيرا عن المذنبات الأخرى على الشريحة.
      ملاحظة: المذنبات مع ما يقرب من جميع مضان الحمض النووي في ذيل غالبا ما يشار إليها باسم المذنبات "القنفذ". لا ينبغي أن يكون سجل المذنبات القنفذ، ولكن يجب أن يتم تسجيل عدد من القنافذ الكشف خلال تسجيل الشرائح وذكرت كنسبة مئوية من إجمالي المذنبات.
    5. تحليل لا يقل عن 75 المذنبات لكل شريحة، قراءة شريحتين في الجهاز / الأنسجة للحصول على ما لا يقل عن 150 خلايا المذنب / عينة في المجموع. بعد العدد المطلوب من الخلايا من شريحة لها أن تكونسجل داخلي ويتم حفظ النتيجة كملف جدول بيانات لتحليل البيانات في وقت لاحق.

7. تحليل التشريح المرضي

  1. بعد ما لا يقل عن تثبيت 72 ساعة في 10٪ بنك الفجيرة الوطني، تليها الأنسجة التشذيب 21، معالجة بشكل روتيني وتضمين اليسار الفص الجانبي الكبد من العينات في البارافين الشمع المتوسطة القائمة 22. قسم العينات في حوالي 5 ميكرون، وجمع على الشرائح الزجاجية.
  2. وصمة عار على أقسام مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E):
    1. تسخين الشرائح مع أقسام الأنسجة البارافين في C الفرن 60 درجة لمدة 2 ساعة قبل إجراء تلطيخ.
    2. استخدام زيلين إلى deparaffinize الجانبين. ترطيب الشرائح مع الإيثانول متدرج (ETOH) لتشغيل شطف ماء الصنبور.
    3. ضع الشرائح في 450 مل من الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة و 40 ثانية. الشرائح شطف مع حمض (حمض الخليك الجليدية 2 مل إلى 450 مل من الماء غير المتأينة) لمدة 4 ثانية التالية 5 دقائق تشغيل شطف ماء الصنبور.
    4. وضع انزلقوفاق في 450 مل 70٪ ETOH تحتوي على 1 مل هيدروكسيد الأمونيوم لمدة 2 دقيقة، تليها تشغيل الحنفية شطف المياه لمدة 2 دقيقة و 30 ثانية، و 70٪ شطف ETOH لمدة 1 دقيقة.
    5. احتضان الشرائح مع 450 مل يوزين Y محلول يحتوي على حامض الخليك الجليدي 4 مل لمدة 3 دقائق.
    6. يذوى الشرائح مع ETOH متدرج. مسح الشرائح مع زيلين (ثلاث مرات 1 دقيقة لكل منهما)، وعقد الشرائح في الزيلين حتى يتم وضعها زلات غطاء على الشرائح.
  3. فحص الشرائح بواسطة المجهر الضوئي، نتائج قياسية، والصف آفات غير الورمية لشدة ك 1 (الحد الأدنى)، 2 (معتدل)، 3 (معتدل)، أو 4 (علامة).
    ملاحظة: درجة الخطورة بطلب للحصول على آفة معينة يستند إلى الحصة النسبية من الكبد مع الآفة (الحد الأدنى = <1-15٪، معتدل = 16-35٪، متوسطة = 36-60٪، وتميز = 61- 100٪).

تحليل 8. البيانات

  1. ويعتبر هذا الحيوان وحدة تجريبية لتقييم الإحصائية. وأعرب عن الحمض النووي من التلف كنسبة مئوية DN(أ) في الذيل.
  2. يتم احتساب الحمض النووي من التلف التأكسدي على النحو التالي: الشرائح المرجعية (أي علاج انزيم) تقدم تقديرا للفواصل الحمض النووي خلفية حبلا (SB).
    ملاحظة: الشرائح المعالجة انزيم توفر قدرا من فواصل حبلا وقواعد المؤكسد (SB + OX). وإذا افترضنا أن الاستجابة للجرعة خطية ل٪ الحمض النووي في ذيل بوصفها وظيفة من الحمض النووي من التلف والطرح من SB من SB + OX يعطي تقديرا للفواصل حبلا الحمض النووي من البريميدينات / البيورينات تغيير المؤكسد 23.
  3. تحليل الحمض النووي٪ في ذيل بوصفها وظيفة من الجرعة عن طريق ذات اتجاه واحد أنوفا، تليها اختبار Dunnett للمقارنة، بحث الردود في الحيوانات المعالجة إلى السيطرة على السيارة.
    ملاحظة: يتم الذيل واحد جميع الاختبارات ويتم تعيين القيمة ع أقل من 0.05 كمعيار لدلالة إحصائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد أجريت في الجسم الحي فحص القلوية المذنب بالتزامن مع مقايسة المذنب المعدلة انزيم لقياس كل الأضرار المباشرة والتأكسدي الحمض النووي في كبد الفئران التي عرضت لخلات سيبروتيرون (CPA) 5. اتفاق السلام الشامل هو الدواء الهرمونية الاصطناعية التي يدفع أورام كبد الفئران بطريقة مصنفة حسب الجنس، مع خمسة أضعاف الجرعات العالية اللازمة لإحداث أورام الكبد في الفئران الذكور بالمقارنة مع الإناث 24. وجدنا أن الحمض النووي من التلف المباشر التي تنتجها اتفاق السلام الشامل في الكبد من ذكور وإناث الفئران لديها نفس النمط مصنفة حسب الجنس كما hepatotumorigenicity لها: هناك حاجة إلى جرعة خمسة أضعاف أعلى من سلطة الائتلاف المؤقتة للحث على زيادة كبيرة في الحمض النووي من التلف في كبد الذكور مقارنة مع الإناث (الشكل 1).

نحن نفترض أن النتيجة المذنب فحص مصنفة حسب الجنس ويرجع ذلك إلى النشاط من ناقلة السلفات هيدروكسي ستيرويد (ق) (HST)، والذي هو 15 أضعاف أعلىفي إناث الفئران البالغات من في الذكور البالغين. HST الأيض هو الحد من معدل خطوة في تفعيل اتفاق السلام الشامل لالمستقلب ملزم الحمض النووي (ق) 25. في المقابل، كان بفعل سلطة التحالف المؤقتة الحمض النووي من التلف التأكسدي أكبر عموما في الذكور من كبد الفئران الإناث، وبالتالي أقل عرضة لتكون خطوة في تشكيل الورم معدل الحد (الشكل 2). وأظهر تقييم التشريح المرضي من أكباد الفئران المعالجة اتفاق السلام الشامل، أي دليل على موت الخلايا المبرمج الناجم عن وكيل أو نخر (الجدولين 1 و 2)، مشيرا إلى أن النتائج الإيجابية فحص المذنب لم تكن لها تأثير ثانوي للخلايا 5. أرقام 1 و 2 و الجداول 1 و وأعيد طبعه 2 بإذن من السيفير BV (المرجع 5).

الشكل 1
الشكل 1. الحمض النووي من التلف في الكبد من الذكور المعالجة اتفاق السلام الشامل وإناث الفئران ليasured مع المجراة القلوية الفحص المذنب. مجموعة خمسة ذكور وإناث الفئران F344 منذ سبعة أسابيع عولجوا مع زيت الزيتون أو مع 10، 25، 50، أو 100 ملغ / كغ / يوم السلام الشامل في زيت الزيتون. أجريت العلاجات في 0، 24، و 45 ساعة، تم التضحية الفئران في 48 ساعة، وتم قياس الحمض النووي من التلف في الكبد كما الحمض النووي٪ ذيل باستخدام فحص القلوية المذنب. العلاج اتفاقية السلام الشامل التي يسببها زيادة في الحمض النووي٪ الذيل في كبد الجرذان الذكور بطريقة تشبه عتبة، مع زيادات كبيرة أن يتم اكتشافها إلا مع جرعة 50 و 100 ملغ / كغ / يوم. العلاج اتفاقية السلام الشامل التي يسببها فواصل حبلا الحمض النووي في كبد الفئران الإناث بطريقة شبه خطية تعتمد على الجرعة، مع زيادات كبيرة في الحمض النووي٪ ذيل الكشف في جميع الفئات اتفاق السلام الشامل. وقدرت أدنى الملاحظة مستويات السمية الوراثية تأثير (LOGELs) لالناجم عن سلطة الائتلاف المؤقتة الحمض النووي من التلف في كبد الفئران الإناث والذكور لتكون 10 و 50 ملغ / كغ / يوم على التوالي. * كبير في p≤0.05 نسبة إلى يخدع السيارةالمحول المتعدد العادي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم الضرر التأكسدي 2. الحمض النووي في كبد الذكور معاملة اتفاق السلام الشامل وإناث الفئران قياس مع مقايسة المذنب القلوية في الجسم الحي تعديل الانزيم. مجموعة خمسة ذكور وإناث الفئران F344 منذ سبعة أسابيع عولجوا مع زيت الزيتون أو مع 10، 25، 50، أو 100 ملغ CPA / كغ / يوم في زيت الزيتون. أجريت العلاجات في 0، 24، و 45 ساعة، تم التضحية الحيوانات في 48 ساعة، وأجريت الفحص المذنب المعدلة الإنزيم باستخدام الحمض النووي٪ ذيل كمقياس الحمض النووي من التلف. جميع الجرعات اتفاق السلام الشامل أنتجت زيادات كبيرة في الحمض النووي من التلف إندو الثالث تراعي في كبد ذكور الجرذان المعاملة اتفاق السلام الشامل؛ في حين إندو الثالث تراعي الحمض النووي دتم الكشف عن amage فقط في إناث الفئران تعامل مع 25، 50، و 100 ملغ / كغ / يوم السلام الشامل (A). أسفرت عن جرعات اتفاق السلام الشامل في زيادات كبيرة في hOGG1 تراعي الضرر التأكسدي الحمض النووي في كبد الجرذان الذكور. تم الكشف عن زيادة في الحمض النووي من التلف hOGG1 تراعي فقط في إناث الفئران تعامل مع 50 و 100 ملغ / كغ / يوم CPA (B). * كبير في p≤0.05 نسبة إلى السيطرة على السيارة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدولين 1 و 2. نتائج تحليل التشريح المرضي. ومنذ السمية الخلوية يمكن أن تولد نتائج الفحص المذنب إيجابية كاذبة، وتقييمات لأمراض أنسجة الجسم للخلايا أفكارك و / أو الميتة وينبغي إجراء لأنسجة مصابة المذنب. في الدراسة الحالية، لم يلاحظ أي الخلايا الكبدية الناجمة عن اتفاقية السلام الشامل أو نخرفي كبد الفئران كلا من الذكور والإناث، والتي تستبعد إمكانية استجابة فحص المذنب إيجابية كاذبة.

آفة البيانات جرعة اتفاق السلام الشامل
0 ملغ / كغ 10 مغ / كغ 25 مغ / كغ 50 مغ / كغ 100 ملغ / كغ
تشكل الفجوات السيتوبلازمية الكبدية عدد الآفة 1 1 5 5 6
# فحص 6 5 5 5 6
آفة٪ 17٪ < / td> 20٪ 100٪ 100٪ 100٪
متوسط ​​الشدة 1.0 1.0 1.2 1.8 2.0
الكبدية الانقسام عدد الآفة 0 0 5 5 6
# فحص 6 5 5 5 6
آفة٪ 0 0 100٪ 100٪ 100٪
متوسط ​​الشدة 0 0 1.0 1.4 1.8

الجدول 1. حدوث الآفات غير الورمية في كبد الجرذان F344 الذكور vehicle- وتعامل اتفاق السلام الشامل.

ز = "0" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> <td> 0
آفة البيانات جرعة اتفاق السلام الشامل
0 ملغ / كغ 10 مغ / كغ 25 مغ / كغ 50 مغ / كغ 100 ملغ / كغ
تشكل الفجوات السيتوبلازمية الكبدية عدد الآفة 1 3 5 5 5
# فحص 5 5 5 5 5
آفة٪ 20٪ 60٪ 100٪ 100٪ 100٪
متوسط ​​الشدة 1.0 1.3 1.8 1.8 2.0
الكبدية الانقسام عدد الآفة 0 5 5 5 5
# فحص 5 5 5 5 5
آفة٪ 0 100٪ 100٪ 100٪ 100٪
متوسط ​​الشدة 0 1.0 1.2 1.8 2.0
الكبدية Karyomegaly عدد الآفة 0 0 5 5 5
# فحص 5 5 5 5 5
آفة٪ 0 100٪ 100٪ 100٪
متوسط ​​الشدة 0 1.0 1.2 1.8 2.0

الجدول 2. حدوث الآفات غير الورمية في كبد السيارة وتعامل سلطة التحالف المؤقتة الجرذان F344 الإناث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول قياس المتزامنة لكل من الحمض النووي من التلف التأكسدي المباشر وفي كبد الفئران على مستوى خلية واحدة. بروتوكول عام ينطبق على أي نوع من الأنسجة التي الخلايا وحيدة النواة أو يمكن أن تكون معزولة مع الحد الأدنى من الحمض النووي من التلف الناجم عن تصنيع (أي الحمض النووي من التلف الناجم ليس عن طريق وكيل الاختبار، ولكن عن طريق التعامل ومعالجة الأنسجة الحيوانية). في بحثنا، أجرينا فحوصات المذنب قلوية على الخلايا من نخاع العظام 7،9، المعدة (6)، الكلى 9، المثانة 9، الرئة 9، القلب 10، الغدة الثديية 5، الرحم 5، الخصية 5، والدم 5. ويمكن لهذه المقايسات توفر طريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة لدراسة الناجم أجنبي بيولوجيا الحمض النووي من التلف في الأجهزة والأنسجة من حيوانات التجارب متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في دراسات الرصد الأحيائي الإنسان عن طريق فحوصات إجراء، على سبيل المثال، في الدم المحيطي، تقشرالخلايا في المسالك البولية، أو ظهائر الشدق أو الأنف تم الحصول عليها من الأفراد المعرضين سريريا أو مهنيا. النهج الأساسي يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم أضرار الحمض النووي في الخلايا المستزرعة في المختبر.

عندما تم دمج الفحص المذنب في دراسات علم السموم الحادة أو شبه المزمنة، وهي المرة أخذ العينات، أي الفترة الزمنية بين العلاج الاخير وجمع الأنسجة، هو المتغير الحاسم أنه في بعض الأحيان يجب أن يتوافق مع جمع بيانات السمية الأخرى. إذا كان ذلك ممكنا، ينبغي أن تستند الأوقات أخذ العينات على البيانات المذنب الوقت بطبيعة الحال، فإن الوقت الذي يتحقق ذروة البلازما أو الأنسجة تركيز (Cmax)، أو بعد تحقق حالة مستقرة التالية إدارات متعددة من مادة الاختبار 19. في الحالات كانت البيانات أو أنسجتها الحركية ليست متاحة، توصي منظمة التعاون والتنمية TG489 إجراء اثنين أو أكثر من العلاجات وجمع الأنسجة 2-6 ساعة بعد العلاج الاخير، أو، إذا كان علاج واحد هوأجريت، وأخذ عينات الأنسجة في كل من 2-6 و16-26 ساعة بعد العلاج 19.

ومن الأهمية بمكان أن طول الفترة الزمنية من القتل الرحيم لإعداد الشرائح المذنب تكون قصيرة قدر الإمكان. فإنه من المستحسن أن الكفاءة التجريبية تنشأ من خلال إظهار الكفاءة في الحصول على جودة عالية تعليق خلية واحدة بسرعة من الأنسجة التي يعاير. عموما، ينبغي إعداد الشرائح المذنب في أقرب وقت ممكن بعد التضحية الحيوانية، مع إعداد خلية واحدة أخذ أقصى ساعة واحدة. ينصح إنشاء قاعدة بيانات تاريخية لإنشاء نطاقات وتوزيع (مركبة) ضوابط السلبية للغاية للتأكد من أن فحص تحت السيطرة المناسبة. يمكن ملاحظة مستويات مفرطة من الحمض النووي من التلف في السيارة / الحيوانات السيطرة السلبية عندما يحدث ما يلي: 1) سوء التعامل مع الأنسجة. 2) فترة طويلة جدا بين القتل الرحيم وإعداد الشرائح المذنب. أو 3) التعرض للتعليق خلية واحدة للأشعة فوق البنفسجية-containinز ضوء. إنشاء قاعدة بيانات تاريخية للنطاقات وتوزيع الضوابط الإيجابية كما ينصح بشدة للتأكد من أن فحص يعرض حساسية المناسبة لgenotoxins المعروفة. تم استخدام الميثيل methanesulfonate (MMS)، ومراقبة إيجابية في الدراسة الحالية. ويوصى سلفونات اثيل الميثان (EMS) من خلال JaCVAM كعنصر تحكم إيجابية لفي الجسم الحي المذنب فحص 18.

دمج الهضم مع نوكلياز داخلي الآفة محددة في بروتوكول مقايسة المذنب يزيد من حساسية وخصوصية الفحص من خلال الاعتراف أنواع معينة من الحمض النووي الآفات في المثال المعروضة هنا، قواعد الحمض النووي المؤكسد. ومع ذلك، ينبغي الاعتراف بأن بعض نوكلياز داخلي قد تكون قادرة على الاعتراف والشق في فئات مختلفة من آفات الحمض النووي. في حالة إندو الثالث، وهذا يشمل الآفات التي لا ترتبط مع الحمض النووي من التلف التأكسدي. قد يشير إلى تعديل III-إندو نتيجة إيجابية الفحص المذنب في وزارة الزراعة المختلطة. بمقارنة ذ، hOGG1 أكثر تحديدا عن الآفات التأكسدي والبيانات من مقايسة المعدلة hOOG1 قد يكون أكثر فائدة لإنشاء وزارة الزراعة التي تنطوي على الضرر التأكسدي الحمض النووي (11).

سمية الخلايا (موت الخلايا المبرمج ونخر) قد يؤدي إلى فواصل حبلا الحمض النووي وإيجابية نتيجة فحص المذنب كاذبة: لا يمكن أن تفسر إيجابية نتائج الفحص المذنب في حد ذاتها كما السمية الوراثية. مطلوب معلومات عن السمية الخلوية لتحديد أهميتها البيولوجية لنتيجة إيجابية الفحص المذنب. ينصح تحليل الأنسجة من الأنسجة المذنب إيجابي من قبل منظمة التعاون والتنمية TG489 كإجراء ذات الصلة من سمية الأنسجة 19. ينبغي أن تفسر إيجابية فحص البيانات المذنب مع دليل واضح على سمية الأنسجة (موت الخلايا المبرمج أو نخر) بعناية.

في الجسم الحي القلوية الفحص المذنب وإندو ثالثا: وhOGG1 تعديل القلوية المقايسات المذنب يمكن استخدامها بطريقة الكمية لاتخاذ قرارات حول السمية الوراثية لالتعرض أجنبي بيولوجيا. كما أنها يمكن أن تستخدم لإجراء البحوث الأساسية في الحمض النووي من التلف وإصلاح في الأنسجة الحيوانية متعددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm)  Fisher 12-544-14
Microscope Slides Fisher 12-550-123
Dimethylsulfoxide (DMSO)  Fisher 67-68-5
EDTA, Disodium Fisher BP120-1
Phosphate buffered saline Fisher ICN1860454
1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) HyClone SH30588.02
HEPES Fisher BP310-1
Low Melting Point Agarose (LMP) Lonza 50081 NuSieve GTG Agarose
Normal Melting Agarose (NMA)  Fisher BP1356-100
pH testing paper strips (pH 7.5-14) Fisher M95873
Potassium Cloride Fisher 7447-40-7
Potassium Hydroxide Fisher 1310-58-3
slide labels (0.94 x 0.5 in.) Fisher NC9822036
Sodium Chloride (NaCl)  Fisher 7647-14-5
Sodium Hydroxide (NaOH)  Fisher 1310-73-2
SYBR™ Gold  Invitrogen S11494
Triton X-100  Fisher 9002-93-1
Trizma Base  Fisher 77-86-1
2.0 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-402-6
Cell strainer (40 µm) Fisher 22363547
Endonuclease III (Nth)  New England Biolabs M0268S Dilution 1:1,000
hOGG1  New England Biolabs M0241S Dilution 1:1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
  4. Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
  5. Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
  6. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
  7. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
  8. Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
  9. Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
  10. Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
  11. Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
  12. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
  13. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  14. Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
  15. Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
  16. Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
  17. Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
  18. International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
  19. Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  21. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
  22. Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
  23. Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
  24. Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
  25. Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 111، وعلم السموم وراثي، الفئران، الكبد،
<em>في فيفو</em> القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook,… More

Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. J. Vis. Exp. (111), e53833, doi:10.3791/53833 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter