Introduction
알칼리 혜성 분석은 단일 세포 수준에서 DNA 가닥 나누기를 측정한다. 단일 세포 현탁액은 현미경 슬라이드에 아가에 매립하고 세포의 DNA를 포함하는 수퍼 코일 루프 nucleoids을 형성 용해. 양극으로 마이그레이션하는 DNA의 해제 가닥으로 가닥 나누기를 포함하는 DNA 루프에서 수퍼 코일의 손실 산도> (13) 결과에서 전기 영동, 형광 현미경으로 관찰 할 수 혜성 같은 구조를 생성. 단편화 된 DNA는 DNA 파괴 하나를 정량화하는데 사용될 수있는 단편의 크기 및 총 강도 (머리와 꼬리)에 비해 혜성 꼬리의 상대적 형광에 기초하여 "꼬리"에 혜성의 "헤드"에서 마이그레이션 2. 분석은 단순 구분, 다양한, 빠른, 1 상대적으로 저렴하다. DNA를 손상 에이전트에 의한 단편화 된 DNA의 검출은 세포의 DNA 손상을 정량화하기위한 분석을 사용 또는에서 핵을 격리 INDIVI잠재적 유전 독성 물질 (들)로 처리 동물의 이중 조직. 장점으로 인해 생체 내 혜성의 분석은 현재의 가늠자 조정에 국제 회의 (ICH) (3)과 유럽 식품 안전청에서 제품의 안전성 평가를 수행하기위한 (생체 내 소핵 분석과 쌍) 두 번째 생체 내 유전 독성 분석 (EFSA로 추천 ) 4 규제 지침. 우리가 실험실에서, 우리는 음식 재료, 의약품, 나노 물질 5-10에 의한 생체 내 DNA 손상을 평가하기위한 분석을 사용했다. 쥐 간 이러한 프로토콜의 예로서 사용되지만, 혜성 분석은 실험 동물의 다른 조직 / 기관만큼 조직으로부터 단리 할 수있다 그대로 단셀로 수행 될 수있다.
DNA 손상의 특정 타입은 염기성 알칼리 혜성 시험을 수정하지 않고 DNA 가닥 나누기로 검출하기 어렵다. 산화성 DNA 손상의 경우에, 스트랜드 Breaks은 같은 8 oxoguanine (8 oxoGua) 및 메틸 fapy - 구아닌 (11)에서 휴식을 만들어 인간의 8-oxoguanine-DNA-N-글리코 1 (hOGG1, 같은 수리 효소로 소화에 의해 DNA의 산화 적 병변에서 만들 수 있습니다. 또한, 효소 III (엔도 III)의 산화 피리 미딘 1 주로 휴식을 생성한다. 따라서, 효소 분해 단계의 추가가 분석을 생체 (12)의 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 구체적이고 민감한 방법을한다. 이러한 분석을 활용, 우리는 증명하고있다 쥐와 생쥐 6-8의 간에서 쥐 (10)의 중심부에 독성 물질에 의한 산화 적 DNA 손상.
시험관 내에서 민감한에 의해 식별 genotoxins에 대한 생체 분석에서 후속는 3,13 테스트로 1), 2) 여러 조직에서 생체 이물에 의한 DNA 손상의 메커니즘을 평가하기 : 알칼리 혜성 분석은 유전 독성과 인간 생체 모니터링에 많은 응용 프로그램이 있습니다 14 3)하면 조사발암 물질, 4), 5) 사람의 질병 직업적 노출 (16)을 조사하고 DNA 손상을 복구 (15)을 평가하기 위해 유전자 독성 또는 동작의 비 유전 독성 모드 (MOA) (7)를 사용하여 동작 6)에 대한 잠재적 인 높은 처리량 스크리닝 검사로서 기관 고유의 유전 독성 17.
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Protocol
윤리 문 : 동물과 관련된 절차 독성 연구를위한 미국 FDA / 국립 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고 : 여기에 설명 된 연구 설계가 생체 내 설치류 알칼리 혜성 분석 (18)의 타당성에 대한 대체 방법의 유효성 검사를위한 일본 센터 (JaCVAM)에 의해 개발 된 프로토콜을 기반으로하고, 또한 OECD 가이드 라인의 권장 사항에 따라 수정 된 TG489 19 .
1. 준비
- 슬라이드 준비
- 1 %에서 일반 용융 아가로 오스를 용해 (W / V) 인산 버퍼 (칼슘, 마그네슘 2+ 무료 페놀 레드 무료) 전자 레인지에 가열.
- 55 ° C의 물을 욕조에 용융 1 % 표준 아가로 오스 솔루션을 놓고 욕실 온도를 평형. 딥 유리 현미경은 exces을 배출, 아가로 오스 용액에 슬라이드아가로 오스 S와 깨끗한 슬라이드의 뒷면을 닦아냅니다. 실온에서 건조 슬라이드를 평평한 표면에 수직 슬라이드를 놓고 수 있습니다; 건조한 장소에 슬라이드를 저장합니다.
- 혜성 시험 용액의 제조
- 0.5 % 저 융점 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 인산 버퍼에 아가로 오스 (칼슘, 마그네슘을 2 +, 페놀 레드 무료) 저 융점을 용해 전자 레인지에 가열. 혜성 슬라이드 준비하는 동안 37-45 ℃에서 솔루션을 유지; 이후에 남아있는 아가로 오스 솔루션을 폐기합니다.
- 용해 버퍼를 준비합니다. 디 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (디 소듐 EDTA 씨 372.24 g / mol)을 2.5 M 염화 나트륨 (NaCl을 씨 58.44 g / 몰) 및 10 mM 트리스 히드 록시 메틸 아미노 메탄 (트리스베이스 씨 121.14 g / 몰) 100 mM의 용액을 정제수, 10 N 수산화 나트륨 수용액 (NaOH로 씨 40g / mol)을 사용하여 pH 10로 조정한다. 사용 당일 최종 정광을 달성하기 위해 용액에 트리톤 X100 및 디메틸 설폭 사이드 (DMSO 씨 78.13 g / 몰) 부가각각 1 %, 10 %, 이온, 및 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 4-9 ℃에서 교반 하였다.
- 사용 당일에 신선한 효소 버퍼를 확인합니다. 40 mM의 2- [4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 일] - 에탄 설 폰산 (HEPES 씨 238.3 g / 몰) 100 mM의 염화칼륨 (KCl을 씨 74.55 g / mol)를 0.5 mm로 함유하는 용액을 준비 디 소디움 EDTA, 정제수를 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA, 씨 66,463g / 몰). 10 N 수산화 칼륨 용액 (KOH, 56.1 g / mol)을 8.0의 pH를 조정한다. 실온에서 교반하고, 사용하기 전에 완전히 용해를 확인합니다.
- 300 mM의 수산화 나트륨 정제수 1 mM의 EDTA이 나트륨을 함유하는 알칼리 완충액을 준비한다. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 4-9 ℃에서 교반 하였다. 사용하고, pH가> 13 인 확인하기 전에 용액의 pH를 측정한다.
- 정제 된 물에 0.4 M 트리스 자료의 용액을 제조하고, 염산 (HCl을, 미스터 36.46)으로 pH 7.5로 조정한다. 4-10 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 이 버퍼를 중화한다.
- F 만들기resh 사용 당일에 버퍼를 닦지. 행크의 균형 소금 용액에 20 mM의 디 소듐 EDTA, 10 % DMSO를 함유 용액 (HBSS, 칼슘, 마그네슘 2+, 페놀 레드 무료)을 준비합니다. 얼음에 사용할 때까지 보관합니다.
- 염색 용액을 제조하려면 1에서 트리스 - 보레이트-EDTA (TBE 버퍼)와 핵산 형광 얼룩 원액을 희석 : 10,000 (v / v)로. 알루미늄 호일을 사용하여 빛의 솔루션을 보호합니다. 2-8 ° C에서 보관하고 24 시간으로 사용합니다.
쥐의 간에서 단일 세포 현탁액 2. 준비
- 동물의 안락사에 대한 미국 수의학 의료 가이드 라인에서 권장하는 CO 2 가스를 다음과 같은 방법으로 쥐를 안락사 : 2013 판 20.
- 2.75에서 CO 2 유량을 설정합니다. 안락사 챔버에서 쥐를 착용 할 것 (예를 들어, 데시 케이 터 항아리, 배출 뚜껑 쥐 케이지)와 탱크 밸브를 개방하여 CO 2를 켭니다. 까지 1.5 ~ 2.5 분 동안 기다립니다쥐 의식이된다. 최대 설정으로 CO 2 흐름을 증가시킵니다. 호흡의 중단 후 안락사를 위해 약 1 분 동안 챔버에서 래트를 떠난다. 쥐가 더 하트 비트가 없음을 확인 palpating하고 쥐가 다리를 철회하지 않는 것을 결정하기 위해 발가락을 곤란하게하여 안락사를 확인합니다.
- 70 % 에탄올로 머리 피부를 소독. 복강을 열고 수술 가위 그대로 간을 제거합니다. 간을 제거한 후, 수술 가위로 남아있는 간에서 왼쪽 측면 로브를 제거합니다. 커팅 보드에 왼쪽 측면 로브를 놓고 일회용 단일 양날 면도날을 사용하여 두 개의 인접한 3-4mm 두께의 횡단면을 잘라.
- (섹션의 컬링을 방지하기 위해) 필터 종이에 하나의 횡단면을 배치, 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)에 섹션을 배치합니다. 1 이상 : 조직 10 % NBF의 비율이 10 있는지 확인하십시오. 적어도 72 시간, 시저의 고정 시간 후조직 병리학 (아래 7 항 참조) 간을 ESS.
- 6cm 페트리 접시에 5 ml의 얼음처럼 차가운 닦지 버퍼 (섹션 1.2.6)에 두 번째 횡단 간 부분을 놓고 잔류 혈액을 제거하기 위해 3 번 씻어.
- 1 ml의 얼음처럼 차가운 닦지 버퍼를 포함하는 새로운 2 ML의 원심 분리기 튜브에 간 섹션을 전송합니다. 세포를 분리하는 미세 가위로 잘 세정 간 부 말하다. 모든 조직 덩어리를 제거하기 위해 40 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액 스트레인.
- 얼음에 단일 세포 현탁액을 놓고 1 시간 내에 슬라이드를 만들기 위해 사용합니다. 농도가 약 2 X10 106 세포 / ml 인 것을 확인하기 위해 (또는 전자 혈구 세포 계수기 예) 계수하여 세포의 농도를 확인한다.
혜성 슬라이드 3. 준비
- 열 용융의 권, 37 ° C, 0.5 % 저 융점 아가로 오스 용액 (섹션 1.2.1)를 단일 세포 현탁액 하나의 볼륨을 섞는다.즉시 일반 융점 아가로 오스 (섹션 1.1)로 코팅 된 슬라이드에 100 μl를 피펫. 즉시 세포 아가로 오스 혼합물을 통해 커버 슬립을 배치합니다. 각 샘플에 대한 최소 8 슬라이드를 확인합니다.
참고 : 모든 슬라이드는 숫자 또는 이와 유사한 코드로 식별되어야하고 슬라이드가 눈을 멀게 방식으로 획득 할 수 있도록 자신의 정체성 (아래, 6.2.2 참조), 기록했다. - 30 분 동안 4 ° C에 슬라이드가 평평하고 멋진 놓습니다.
- 젤이 응고 후, 부드럽게 커버 전표를 제거하고 미리 냉각 용해 버퍼 (섹션 1.2.2)에 슬라이드를 담가. 빛으로부터 슬라이드를 보호하고 O에 1 시간 (최소)에서 4 ° C에서 용해 버퍼에 슬라이드를 유지 / N (최대).
혜성 슬라이드 4. 효소 처리
- 용해 버퍼에서 각 조직 샘플로부터 제조 된 8 슬라이드 6을 제거하고 그들을 실온에서 효소 버퍼 (섹션 1.2.3) 5 분마다 3 배 씻어. 알칼리 혜성 분석 w에 대한 나머지 두 슬라이드를 사용하여ithout 효소 처리 (아래 5.1 참조). 세척 한 후, 배수 및 조직과 슬라이드를 모래 바닥으로 물기를 제거합니다.
- 1 효소 버퍼 hOGG1 및 엔도 III 효소 주식을 희석 : 1,000 (v / v)로. 얼음에 사용할 때까지 놓습니다.
- 혼자 효소 버퍼 (참고 슬라이드로 사용이 슬라이드), 200 μl를 hOGG1 용액 (2 슬라이드) 또는 200 ㎕의 엔도 III 솔루션 (2 슬라이드) 200 ㎕를 각 치료 그룹에서 제조 된 슬라이드에 다음과 같은 솔루션을 200 μl를 적용합니다.
- , 젖은 종이 타월로 줄 지어 페트리 접시에 슬라이드를 넣어 파라 필름과 슬라이드를 포함하고, 엔도 III-처리 및 참조 슬라이드와 hOGG1 처리 슬라이드에 30 분 동안 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 배양 후, 증류수로 슬라이드를 씻어 이하, 5.2에 설명 된대로 처리를 계속합니다.
5. 풀기 및 전기 영동
- 슬라이드가 효소로 처리하지 않은 경우, 용해 완충액에서 슬라이드를 삭제상기 슬라이드를 드레인과 잔여 세제 염을 제거하기 위해 5 분 동안 차가운 중화 완충액 (섹션 1.2.5) 회 헹군다.
- 공백을 피하고 단계 4.5 수평 겔 전기 영동 탱크에 무작위 5.1에서 장소 슬라이드. 액면 그냥 슬라이드를 커버 할 때까지 갓 만든 산도> (13) 전기 영동 버퍼 (섹션 1.2.4)와 탱크를 채우십시오 (아가로 오스를 통해 거품을 방지하고 있는지 탱크 레벨 확인). DNA의 풀림의 시작에서 버퍼 pH와 온도를 기록한다.
- 20 분 알칼리 책임 손상의 DNA와 표현의 풀림을 허용하는 슬라이드는 알칼리 버퍼에 남아 보자.
- 푸는 동안 프로그램 전원은 전기 조 (양극과 음극 사이 cm의 거리로 나눈 값 V / cm = 볼트)에서 0.7 V / cm를 생성한다.
- 풀림 후, 전원 공급 장치의 실행 버튼을 누릅니다. 필요한 경우, 상승 또는 버퍼 레벨을 낮춤으로써 300mA의 전류를 조정한다. 제 유지그냥 슬라이드의 표면 위의 전자 버퍼 수준입니다. 20 분 동안 4 ° C에서 전기 영동을 수행합니다. 시작과 끝에서의 전기 슬라이드 위치 버퍼의 온도와 전류 (A)를 기록한다.
참고 : 너무 많은 버퍼가 DNA의 이동을 방해 할 수 있습니다 낮은 전압 발생합니다. - 전기 영동 후, 5 분 동안 부드럽게 (섹션 1.2.5)을 탱크에서 슬라이드를 해제하고, 중화 완충액에 침지시켜 과량의 알칼리를 중화. 슬라이드를 배출하고 두 번 더 반복한다.
- 5 분 동안 차가운 100 % 에탄올에 침지하여 슬라이드를 고정한다. 저장을위한 건조 지역에서 자연 건조와 장소에 슬라이드를 허용합니다.
6. DNA 염색, 혜성 시각화 및 분석
- DNA 염색
- 판지 또는 금속 트레이에 슬라이드를 놓고 각 슬라이드에 핵산 형광 염색 가공 솔루션 (섹션 1.2.7)의 200 μl를 추가하고 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 에서 슬라이드를 보호광은 슬라이드 채점 전에 적어도 30 분 동안 염색 용액과 접촉을 유지하도록 허용한다. 한 번에 20의 배치에 슬라이드를 얼룩.
- 각 슬라이드를 읽기 전에, 부드럽게 커버 유리를 방해하지 않도록주의, 과잉 염색 액을 멀리시킨다.
- 혜성 시각화 및 채점
- 컴퓨터 모니터에 혜성 슬라이드의 라이브 영상을보기 위해 형광 현미경에 장착 된 비디오 카메라를 사용한다.
- 무작위로 세포를 포함 현미경 필드를 선택합니다. 마우스를 사용하여 셀을 선택합니다. 마우스 왼쪽 클릭으로 "혜성의 머리"의 중심을 클릭합니다.
주 : 컴퓨터 소프트웨어는 모든 셀에 대한 측정 파라미터를 계산하고, 데이터 파일에 데이터를 추가한다. - 현재 필드 (단계 6.2.4 참조)에있는 모든 세포 점수, 다음 세포의 또 다른 세트를 찾기 위해 현미경의 스테이지를 제어하고 화면의 영상을 사용합니다. 6.2.2에 설명 된대로이 세포 점수.
- 슬라이드 F 점수롬 오른쪽 왼쪽 위로 아래로합니다. 약 10 필드 랜덤을 선택합니다. 이 과정에서보기 필드에 나타납니다 적당한 혜성 셀은 편견없이 득점해야합니다.
참고 : 다음 중 하나에 해당하는 경우 혜성 점수하지 마십시오 : 1)는 슬라이드의 가장자리 중 하나에 있습니다; 2) 두 개 이상의 혜성은 중복; 3) 꼬리에 파편이있다; 4) 소프트웨어는 머리와 꼬리를 구분할 수 없다; 5) 핵 및 / 또는 꼬리의 염색 슬라이드에 다른 혜성 크게 다르다.
참고 : 꼬리 거의 모든 DNA 형광와 혜성은 종종 '고슴도치'혜성이라고합니다. 고슴도치 혜성은 득점하지 않아야하지만, 슬라이드 득점 중에 감지 고슴도치의 수를 기록, 총 혜성의 백분율로보고되어야한다. - 적어도 150 혜성 세포 / 총 샘플을 얻기 위해 장기 / 조직 당 두 개의 슬라이드를 읽고 슬라이드 당 최소 75 혜성을 분석합니다. 슬라이드에서 세포의 필요한 수의 후 수 있습니다실내는 결과는 나중에 데이터 분석을위한 스프레드 시트 파일로 저장됩니다 얻었습니다.
7. 조직 병리학 분석
- 조직 (21)을 트리밍 한 다음 10 % NBF에서 72 시간 고정 최소, 이후 정기적으로 처리하고 22 배지 계 파라핀 왁스 시료의 왼쪽 측면 간 로브를 포함. 제 샘플에서 약 5 미크론 유리 슬라이드에 수집합니다.
- 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 섹션을 얼룩 :
- 염색 과정에 앞서 2 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 파라핀 조직 절편과 슬라이드를 가열한다.
- 측면을 deparaffinize하는 자일 렌을 사용합니다. 실행중인 수돗물 린스에 등급 에탄올 (EtOH로)와 슬라이드를 재수.
- 2 분 40 초 동안 헤 마톡 실린 450 ml의에서 슬라이드를 놓습니다. 4 초 동안 산 린스 슬라이드 (450 ml의 탈 이온수 2 ml의 빙초산는) 5 분 실행 수돗물 린스 다음과 같습니다.
- 미끄러 배치2 분 30 초, 1 분 동안 70 %의 EtOH 린스 수돗물 린스를 실행하여 다음 2 분 동안 1 ㎖의 수산화 암모늄을 함유하는 450 ㎖의 70 % EtOH 중 에스.
- 3 분 동안 4 ml의 빙초산을 함유하는 450 ml의 에오신 Y 용액 슬라이드 부화.
- 등급 EtOH로 슬라이드 탈수. 자일 렌과 슬라이드 (세 번 각각 1 분)을 취소 한 커버 슬립이 슬라이드에 배치 될 때까지 크실렌에 슬라이드를 개최합니다.
- 1 (최소), 2 (가벼운), 3 (보통), 4로 심각도에 대한 광학 현미경, 기록 결과, 학년이 아닌 양성 병변에 의해 슬라이드를 검사 (표시).
참고 :; 가벼운 = 16~35%가 보통 = 36-60%, 특정 병변에 적용 심각도 등급이 병변에 간 상대적 비율 (최소 = <1-15%에 기초하고 표시 = 61 100 %).
8. 데이터 분석
- 동물은 통계적 평가를위한 실험 장치로 간주됩니다. DNA 손상은 %로 표현된다 DN꼬리에.
- 다음 산화성 DNA 손상을 계산한다 : 레퍼런스 슬라이드 (NO 효소 처리)는 백그라운드 DNA 가닥 나누기 (SB)의 추정치를 제공한다.
참고 : 효소 처리 된 슬라이드 가닥 나누기의 측정 및 산화 기지 (SB + OX)를 제공합니다. DNA 손상의 함수로 꼬리 %의 DNA에 대한 선형 용량 반응을 가정하면, SB + OX에서 SB의 감산은 산화 피리 미딘 / 변경 퓨린 (23)로부터 DNA 가닥 나누기의 추정치를 제공합니다. - 차량 제어에 처리 된 동물에서의 답변 페어의 비교에 대한 던넷 시험 다음 편도 ANOVA에 의해 투여 량의 함수로 꼬리 %의 DNA를 분석합니다.
참고 : 모든 테스트는 하나의 꼬리하고 0.05의 p- 값이 통계적 유의성의 기준으로 설정됩니다.
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Representative Results
생체 내 알칼리성 혜성 분석은 사이 프로 테론 아세테이트 (CPA) (5)로 처리 된 래트의 간에서 직접 및 산화성 DNA 손상을 모두 측정하는 효소 변성 혜성 분석과 함께 수행 하였다. CPA와 함께, 섹스 특정 방식으로 쥐의 간 종양을 유도하는 합성 호르몬 약물 여성 (24)에 비해 남성 쥐에서 간 종양을 유도하는 데 필요한 높은 용량을 5 배. 우리 수컷 및 암컷 쥐의 간에서 CPA 제조 직접적인 DNA 손상이 hepatotumorigenicity 같은 성별 특정 패턴을 가지고 있음을 발견 CPA의 5 배 - 고용량이있는 DNA 손상의 상당한 증가를 유도하는 데 필요한 여성에 비해 남성의 간 (그림 1).
우리는 섹스 관련 혜성 분석 결과가 15 배 높은 하이드 록시 sulfotransferase (들) (HST)의 활동에 기인한다는 가설성인 남성에 비해 성인 여성 쥐입니다. HST 대사는 DNA 결합 대사 산물 (들) 25 CPA의 활성화에 속도 제한 단계이다. 반면, CPA에 의한 산화 적 DNA 손상은 여성 쥐의 간보다 남성에서 일반적으로 더 큰 및 속도 제한 종양 형성의 단계 (그림 2)가 될 따라서 덜했다. CPA - 처리 된 쥐 간 병리 평가 포지티브 혜성 분석 결과는 세포 독성 (5)의 이차 적용되지 않았 음을 나타내는 제 - 유도 된 세포 사멸 또는 괴사 (표 1 및 2)의 증거는 없었다. 1도 및 2, 표 1 2 엘제 비어 (참고 5)의 허가 재판된다.
CPA 처리 된 남성과 여성의 쥐 날의 간 그림 1. DNA 손상생체 내 알칼리성 혜성 분석으로 asured. 5 ~ 7 주 된 남성과 여성의 F344 쥐의 그룹은 올리브 오일 또는 처리 하였다 (10), 올리브 오일에 25, 50, 100 ㎎ / ㎏ / 일 CPA. 트리트먼트 0 24에서 실시하고, 45 시간에서, 래트를 48 시간에 희생시키고, DNA 손상은 알칼리 혜성 분석법을 이용하여 % 테일 DNA 간 등의 단위로 측정 하였다. CPA 처리는 상당한 증가가 50 만 내지 100 ㎎ / ㎏ / 일의 투여 량으로 검출되는 임계 형상으로 수컷 쥐의 간에서 % 테일 DNA의 증가를 유도. CPA 처리는 모든 CPA 그룹에서 검출 % 테일 DNA 크게 증가와 더불어, 선형에 가까운 용량 의존적으로 암컷 쥐의 간에서 DNA 가닥 나누기를 유도. 여성과 남성 쥐의 간에서 CPA에 의한 DNA 손상에 대한 최저 관찰 된 유전 독성 효과 레벨 (LOGELs)는 각각 10 및 50 ㎎ / ㎏ / 일 것으로 추정했다. * 차량 콘에 p≤0.05 상대에 중요한트롤; 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CPA 처리 된 남성의 간과 여성의 쥐 그림 2. 산화 DNA 손상은 효소 변성 생체 내에서 알칼리 혜성 분석법으로 측정. 5 ~ 7 주 된 남성과 여성의 F344 쥐의 그룹은 올리브 오일 또는 10 처리 하였다, 올리브 오일에 25, 50, 100 ㎎ / ㎏ / 일 CPA. 트리트먼트 0 24에서 실시하고, 45 시간에서, 동물은 48 시간에 희생시키고, 효소 변성 혜성 분석은 DNA 손상 메트릭으로서 % 테일 DNA를 사용 하였다. 모든 CPA의 용량은 CPA 처리 된 수컷 쥐의 간에서 엔도 III에 민감한 DNA 손상에 유의 한 증가를 생산; 엔도 III에 민감한 DNA d를하는 동안amage은 25, 50 및 100 ㎎ / ㎏ / 일의 CPA (A)로 처리 암컷 쥐에서 검출되었다. 모든 CPA 투여 량은 남성 쥐의 간에서 hOGG1에 민감한 산화 DNA 손상이 크게 증가의 결과; hOGG1에 민감한 DNA 손상의 증가는 50 ~ 100 ㎎ / ㎏ / 일 CPA (B)로 처리 암컷 쥐에서 발견되었다. * 차량 제어 p≤0.05 상대적으로 크게; 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 & 2. 세포 독성은 세포 사멸 및 / 또는 괴사 세포 위양성 혜성 분석 결과, 조직 병리학 적 평가를 생성 할 수 있기 때문에 조직 병리학 분석 결과는. 혜성 양성 조직을 실시한다. 현재 연구에서, 더 CPA 유도 아폽토시스 간세포 괴사가 관찰되지 않았다가양 혜성 분석 반응의 가능성을 배제 남녀 모두 쥐의 간이다.
| 장애 | 데이터 | 용량 CPA | ||||
| 0 mg을 / kg | 10 mg의 / kg | 25 mg을 / kg | 50 mg을 / kg | 100 mg을 / kg | ||
| 간세포의 세포질 공포 화 | 병변의 개수 | 1 | 1 | (5) | (5) | 6 |
| # 심사 | 6 | (5) | (5) | (5) | 6 | |
| 장애% | 17 % </ TD> | 20 % | 100 % | 100 % | 100 % | |
| 평균 심각도 | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| 간세포의 유사 분열 | 병변의 개수 | 0 | 0 | (5) | (5) | 6 |
| # 심사 | 6 | (5) | (5) | (5) | 6 | |
| 장애% | 0 | 0 | 100 % | 100 % | 100 % | |
| 평균 심각도 | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
비히클 및 CPA 처리 된 남성 F344 쥐의 간에서 비 종양 병변 표 1. 부각.
| 장애 | 데이터 | 용량 CPA | ||||
| 0 mg을 / kg | 10 mg의 / kg | 25 mg을 / kg | 50 mg을 / kg | 100 mg을 / kg | ||
| 간세포의 세포질 공포 화 | 병변의 개수 | 1 | 삼 | (5) | (5) | (5) |
| # 심사 | (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | |
| 장애% | 20 % | 60 % | 100 % | 100 % | 100 % | |
| 평균 심각도 | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| 간세포의 유사 분열 | 병변의 개수 | 0 | (5) | (5) | (5) | (5) |
| # 심사 | (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | |
| 장애% | 0 | 100 % | 100 % | 100 % | 100 % | |
| 평균 심각도 | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| 간세포 Karyomegaly | 병변의 개수 | 0 | 0 | (5) | (5) | (5) |
| # 심사 | (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | |
| 장애% | <TD> 00 | 100 % | 100 % | 100 % | ||
| 평균 심각도 | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
차량 및 CPA 처리 여성 F344 쥐의 간에서 비 종양 병변의 표 2. 부각.
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Discussion
이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 쥐의 간에서 모두 직접 산화 DNA 손상의 동시 측정을 설명합니다. 일반적인 프로토콜 (즉, DNA 손상되지 테스트 에이전트하지만 동물 조직의 취급 및 가공에 의해 유도 된) 단일 세포 또는 핵 최소 처리 유도 된 DNA 손상과 분리 될 수있는 모든 조직에 적용 할 수있다. 우리의 연구에서는 골수 7,9, 위 (6), 신장 (9), 방광 (9), 폐 (9), 심장 (10), 유선 (5), 자궁 (5), 고환 5, 혈액 5 세포에 알칼리 혜성 분석을 실시했다. 이러한 분석은 다수의 기관 및 실험 동물의 조직에서 생체이 인한 DNA 손상을 연구하는데 빠르고 간단하고 저렴한 방법을 제공 할 수있다. 또한,이 방법은, 말초 혈에, 예를 들면, 전도성 분석하여 인간 생체 모니터링 연구에 사용될 수있다 박리요로의 세포 또는 임상 적 또는 직업적으로 노출 된 개인에서 얻은 구강이나 비강 상피. 기본적인 방법은 시험 관내에서 배양 된 세포의 DNA 손상을 평가하기 위해 사용될 수있다.
혜성 세이 즉 급성 또는 아 만성 독성 시험, 샘플링 시간에 통합되는 경우, 마지막 치료 및 조직 수집 사이의 시간은 종종 다른 독성 자료의 수집과 함께 조정되어야하는 중요한 변수이다. 가능하면, 샘플링 시간은 시간 경과에 혜성 데이터 피크 혈장 및 조직 농도 (Cmax는)를 달성 또는 정상 상태는 시험품 (19)의 다중 투여 다음 달성되면되는 시간에 기초한다. 경우에 속도 데이타 또는 조직 농도는 단일 치료 경우 OECD TG489은 두 개 이상의 치료를 실시하고 마지막 투여 후 조직을 2-6 시간 수집 권장 또는 사용할 수없는 한치료 19 일 후 모두 2-6과 16-26 시간에서 조직을 샘플링 실시했다.
혜성 슬라이드 제조에 안락사에서 시간의 길이는 가능한 한 짧게하는 것이 중요하다. 이 실험 역량을 분석하는 조직에서 신속하게 고품질의 단일 세포 현탁액을 획득 능력을 보여주는 설립하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 혜성 슬라이드는 하나의 셀 준비 한 시간의 최대 복용, 가능한 한 빨리 동물 희생 후 준비를해야합니다. 범위와 음 (차량) 컨트롤의 분포를 확립하는 역사적 데이터베이스의 구축은 매우 분석은 적절한 통제하에 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 다음이 발생할 때 DNA 손상의 과도한 수준은 차량 / 음성 대조군 동물에서 관찰 할 수있다 : 조직의 1) 부적절한 취급; 안락사와 혜성 슬라이드 준비 사이 2) 너무 오래 시간; UV-containin에 단일 세포 현탁액 또는 3) 노출g 빛. 범위 및 양성 대조군의 분포에 대한 역사적 데이터베이스의 구축은 매우 분석 알려진 genotoxins에 적합한 감도를 표시하도록 보장하는 것이 좋습니다. 메틸 메탄 설포 네이트 (MMS)는 본 연구에서 양성 대조군으로 사용 하였다; 에틸 메탄 설포 네이트 (EMS)는 생체 혜성 분석 (18)에 대한 양성 대조군으로 JaCVAM에 의해 권장합니다.
혜성 분석 프로토콜에 병변 특정 엔도 뉴 클레아와 digestions을 통합하는 DNA의 특정 유형의 인식을 통해 분석의 민감도와 특이도 증가 병변을-의 예, 여기에 산화 된 DNA 기지를 발표했다. 그러나, 일부 엔도 뉴 클레아가 인식하고 DNA 병변의 다양한 클래스로 절단 할 수 있음을 알아야한다; 엔도 III의 경우, 이는 산화 적 DNA 손상과 관련이없는 병변을 포함한다. 포지티브 엔도 III 변성 혜성 분석 결과 혼합 MOA를 나타낼 수있다. 비y를 비교, hOGG1는 산화 DNA 손상 (11)를 포함하는 MOA을 설정하는 더 유용 할 수있는 hOOG1 수정 분석에서 산화 병변 및 데이터에 대한보다 구체적인이다.
세포 독성 (세포 사멸 및 괴사) DNA 가닥 나누기 및 거짓 긍정적 인 혜성 분석 결과가 발생할 수 있습니다 : 그 자체로 긍정적 인 혜성 분석 결과는 유전 독성으로 해석 할 수 없습니다. 세포 독성에 관한 정보는 양 혜성 분석 결과의 생물학적 관련성을 확립 할 필요가있다. 혜성 양성 조직의 조직 병리학 적 분석은 조직의 독성 (19)의 관련 조치로 OECD TG489에 의해 권장합니다. 조직 독성 (세포 사멸이나 괴사)의 명백한 증거와 긍정적 인 혜성 분석 데이터는 신중하게 해석되어야한다.
생체 내 알칼리성 혜성 분석 및 엔도 III- 및 hOGG1 변성 알칼리 혜성 분석법의 유전 독성에 대한 결정을하기 위해 정량적 방식으로 사용될 수있다생체이 노출. 또한 여러 동물 조직에서 DNA 손상 및 수리 기초 연구를 수행하는데 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
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