Introduction
De alkalische komeettest meet DNA-breuken in de single-cell niveau. Suspensies van afzonderlijke cellen zijn ingebed in agarose op een microscoopglaasje en de cellen gelyseerd om nucleoiden, die sterk gedraaide lussen van DNA bevatten te vormen. Elektroforese bij pH> 13 resulteert in het verlies van supercoiling van DNA lussen met breuken, met de vrijgekomen DNA strengen migreren naar de anode, waardoor comet-achtige structuren die kunnen worden waargenomen door middel van fluorescentie microscopie. Gefragmenteerde DNA migreert van de "kop" van de komeet in de "staart" gebaseerd op de grootte van het fragment, en de relatieve fluorescentie van de komeetstaart opzichte van de totale intensiteit (kop en staart) kan worden gebruikt om DNA-afbraak 1 kwantificeren , 2. De test is eenvoudig, gevoelig, veelzijdig, snel en relatief goedkoop 1. De detectie van gefragmenteerd DNA door DNA-beschadigende agentia gebruikt een test voor het kwantificeren van DNA schade in cellen of geïsoleerde kernen van inddubbele weefsels van dieren behandeld met potentieel genotoxische materiaal (s). Vanwege de voordelen, is de in vivo komeettest aanbevolen als een tweede in vivo genotoxiciteit assay (in combinatie met de in vivo micronucleus-test) voor het uitvoeren van de productveiligheid beoordeling van de huidige internationale conferentie voor harmonisatie (ICH) 3 en de Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA ) 4 wettelijke richtlijnen. In ons laboratorium hebben we de test gebruikt voor het evalueren van in vivo DNA schade geïnduceerd door voedingsingrediënten, geneesmiddelen en nanomaterialen 5-10. Rattenlever worden als voorbeeld in dit protocol, maar komeettest kan worden uitgevoerd met andere weefsels / organen van proefdieren, zolang intacte enkele cellen kunnen worden geïsoleerd uit het weefsel.
Bepaalde soorten DNA schade moeilijk te detecteren DNA breuken zonder dat de fundamentele alkaline comet assay. Bij oxidatieve DNA schade, onderdeel Breaks kunnen worden gemaakt bij oxidatieve beschadigingen in het DNA door verteren met reparatie-enzymen zoals menselijke 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 (hOGG1, die pauzes op 8-oxoguanine (8-oxoGua) en methyl-Fapy-guanine 11 creëert. ook Endonuclease III (Endo III) maakt pauzes vooral bij geoxideerde pyrimidines 1. de toevoeging van een enzym-digestie stap maakt de bepaling een specifieke en gevoelige werkwijze voor het meten van oxidatieve DNA schade in vivo 12. Gebruik makend van deze assays hebben we aangetoond -giftige stof geïnduceerde oxidatieve DNA schade in de lever van ratten en muizen 6-8 en in het hart van ratten 10.
De alkalische komeettest kent vele toepassingen in de genetische toxicologie en humane biomonitoring: 1) als een follow-up in vivo test voor genotoxinen geïdentificeerd door gevoelig in vitro testen 3,13, 2) mechanismen van lichaamsvreemde-geïnduceerde DNA-schade in meerdere weefsels te evalueren 14, 3) te onderzoeken of eenkankerverwekkende stof werkt met een genotoxische of een niet-genotoxische werkingsmechanisme (MOA) 7, 4) te evalueren DNA schadeherstel 15, 5) naar ziekten bij de mens en beroepsmatige blootstellingen 16 onderzoeken, en 6) als een potentiële high-throughput screening test voor orgaanspecifieke 17 genotoxiciteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: procedures waarbij dieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op de US FDA / Nationale Centrum voor toxicologisch onderzoek.
LET OP: De onderzoeksopzet die hier beschreven is gebaseerd op het protocol ontwikkeld door de Japanse Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (JaCVAM) voor de validering van de in vivo knaagdier alkaline comet assay 18 en verder gewijzigd op basis van aanbevelingen in de OESO-richtsnoer TG489 19 .
1. Voorbereiding
- Slide voorbereiding
- Ontbinden regelmatige smeltende agarose in 1% (w / v) in fosfaatbuffer (Ca2 +, Mg2 + vrij en fenolrood vrij) door verwarmen in een magnetron.
- Plaats het gesmolten 1% agarose standaard oplossing in een 55 ° C waterbad en equilibreren de temperatuur het bad. Dip glas microscoop dia's in de agarose oplossing, aftappen geen excess agarose en veeg de achterkant van de dia's schoon. Plaats de objectglaasjes rechtop op een vlakke ondergrond en laat de dia drogen bij kamertemperatuur; Bewaar de dia's in droge plaats.
- Voorbereiding van de komeet meetoplossingen
- Bereid 0,5% laagsmeltende agarose oplossing. Oplossen laagsmeltende agarose in fosfaatbuffer (Ca2 +, Mg2 +, en fenolrood vrij) door verwarmen in een magnetron. Houd de oplossing bij 37-45 ° C gedurende komeet slide voorbereiding; verwijder daarna resterende agarose oplossing.
- Bereid Lysis buffer. Voeg een 100 mM oplossing van dinatrium-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, heer 372,24 g / mol), 2,5 M natriumchloride (NaCl, Mijnheer 58,44 g / mol) en 10 mM tris hydroxymethyl aminomethaan (Tris Base, heer 121,14 g / mol) in gezuiverd water en op pH 10 met 10 N natriumhydroxideoplossing (NaOH, Mr 40 g / mol). Op de dag van gebruik, voeg Triton X100 en dimethylsulfoxide (DMSO, de heer 78,13 g / mol) aan de oplossing tot de uiteindelijke concentrat bereikenionen van 1% en 10%, respectievelijk, en roer bij 4-10 ° C gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik.
- Voeg vers enzym buffer op de dag van gebruik. Bereid een oplossing die 40 mM 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-yl] ethaansulfonzuur (HEPES, Mr 238,3 g / mol), 100 mM kalium- chloride (KCl, Mijnheer 74,55 g / mol), 0,5 mM dinatrium EDTA en 0,2% runderserumalbumine (BSA, Mr 66.463 g / mol) in gezuiverd water. Breng de pH op 8,0 met 10 N kaliumhydroxide (KOH, 56,1 g / mol). Roer bij kamertemperatuur en verifiëren volledige oplossing voor gebruik.
- Bereid een alkalische bufferoplossing met 300 mM NaOH en 1 mM EDTA in gezuiverd water. Roeren bij 4-10 ° C gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik. Meet de pH van de oplossing vóór gebruik en zorgen dat de pH> 13.
- Bereid een oplossing van 0,4 M Tris Base in gezuiverd water en op pH 7,5 met zoutzuur (HCl, Mr 36,46). Bewaar de oplossing bij 4-10 ° C. Dit wordt neutraliserende buffer.
- maak fresh hakken buffer op de dag van gebruik. Bereid een oplossing bevattende 20 mM EDTA en 10% DMSO in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, Ca2 +, Mg2 +, en fenolrood vrij). Bewaar op ijs tot gebruik.
- Om kleuring te bereiden, verdund nucleïnezuur fluorescerende vlek voorraadoplossing met Tris-boraat-EDTA (TBE buffer) en 1: 10.000 (v / v). Bescherm de oplossing van het licht met behulp van aluminiumfolie. Bewaar bij 2-8 ° C en gebruik met 24 uur.
2. Voorbereiding van de Single Cell Schorsingen van Rat Liver
- Euthanaseren ratten met CO2-gas hieronder genoemde methoden aanbevolen in de American Veterinary Medical Richtsnoeren voor de euthanasie van dieren: 2013 Edition 20.
- Stel de CO 2 stroomsnelheid op 2,75. Zet de rat in de euthanasie kamer (bijv exsiccator jar, rat kooi met geventileerde deksel) en zet de CO 2 door het openen van de tankklep. Wacht tot 1,5 tot 2,5 min tot hetrat raakt bewusteloos. Verhoging van de CO 2 stroom op de maximale waarde. Na stopzetting van de ademhaling, laat de rat in de kamer gedurende ongeveer 1 min tot euthanasie waarborgen. Controleer euthanasie door palpating te bevestigen dat de rat geen hartslag, en knijpen de tenen om te bepalen dat de rat zijn ledematen niet intrekt.
- Ontsmet de haired-huid met 70% ethanol. Open de buikholte en verwijder de intacte lever met chirurgische schaar. Na het verwijderen van de lever, verwijder de linker laterale kwab van de resterende lever met chirurgische schaar. Plaats de linker laterale lob op een snijplank en snijd twee aangrenzende 3-4 mm dikke dwarsdoorsneden met behulp van een disposable single-edged scheermesje.
- Plaats een dwarsdoorsnede op filtreerpapier (tot krullen van de sectie voorkomen), en zet het onderdeel in 10% neutraal gebufferde formaline (NBF). Zorgen dat de verhouding van 10% NBF om weefsel 10: 1 of groter. Na een fixatie van ten minste 72 uur, process de lever voor histopathologie (zie rubriek 7, hieronder).
- Leg de tweede sectie transversale lever in 5 ml ijskoude hakken buffer (paragraaf 1.2.6) in een 6 cm petrischaal en spoel 3 keer om de resterende bloed te verwijderen.
- Breng de sectie lever een nieuwe 2 ml centrifugebuis die 1 ml ijskoude buffer hakken. Gehakt de goed gespoeld gedeelte lever met een paar fijne schaar om de cellen los. Zeef de celsuspensie door een 40 um cel zeef om elk weefsel stukken te verwijderen.
- Plaats de enkele celsuspensie op ijs en te gebruiken voor het maken van dia's binnen 1 uur. Controleer de concentratie van cellen door het tellen (bijvoorbeeld met een hemocytometer of elektronische cel teller) om ervoor te zorgen dat de concentratie van ongeveer 2 x10 6 cellen / ml.
3. Voorbereiding van Comet Slides
- Meng een volume van de enkele celsuspensie met 10 volumes van gesmolten, 37 ° C, 0,5% laagsmeltende agarose-oplossing (paragraaf 1.2.1).Onmiddellijk pipet 100 ul op een dia bekleed met regelmatige smeltpunt agarose (paragraaf 1.1). Onmiddellijk plaats een dekglaasje over de cel-agarose mengsel. Maak ten minste 8 dia's voor elk monster.
Opmerking: Alle objectglaasjes worden geïdentificeerd door een nummer of soortgelijke code en hun identiteit opgenomen, zodat de schuiven kunnen worden gescoord op een blinde manier (zie 6.2.2 hieronder). - Leg de dia vlak en afkoelen tot 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Nadat de gel is gestold, verwijder voorzichtig de dekglaasjes en dompel de dia's in de pre-gekoelde lysisbuffer (paragraaf 1.2.2). Bescherm de dia tegen licht en houden de objectglaasjes in de lysis buffer bij 4 ° C van 1 uur (minimum) O / N (maximum).
4. Enzym Behandeling van Comet Slides
- Verwijderen 6 van de 8 objectglaasjes bereid uit elk weefselmonster van de lysisbuffer en spoelen 3x gedurende 5 minuten elk met enzymbuffer (sectie 1.2.3) bij kamertemperatuur. Met de overige twee dia's voor de alkalische komeettest without enzym-behandeling (zie 5.1 hieronder). Na het spoelen, verwijdert overtollige vloeistof door het laten uitlekken en deppen de dia's met weefsels.
- Verdun hOGG1 en Endo III enzym aandelen met enzym buffer bij 1: 1000 (v / v). Plaats op ijs tot gebruik.
- Toepassen 200 ul van de volgende oplossingen dia's bereid uit elke behandelingsgroep: 200 gl enzym buffer alleen (2 slides gebruikt als referentie dia), 200 gl hOGG1 oplossing (2 slides) of 200 ul Endo III-oplossing (2 glijbanen).
- Plaats de objectglaasjes in Petri-platen bekleed met vochtige papieren handdoeken, bedekken de dia's met Parafilm en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 45 min voor Endo III behandelde en vindplaats glijbanen en 30 min voor hOGG1 behandelde objectglaasjes.
- Na incubatie, spoel de glaasjes met gedestilleerd water en verder verwerkt zoals beschreven in 5.2 hieronder.
5. Het afwikkelen en elektroforese
- Voor dia's niet behandeld met enzymen, verwijdert u de dia's uit de lysisbuffer, Afvoer van de dia's en een keer spoelen met koud neutralisatie buffer (paragraaf 1.2.5) gedurende 5 minuten om achtergebleven wasmiddel en zouten te verwijderen.
- Plaats de glaasjes van stappen 4,5 en 5,1 willekeurig in een horizontale gelelektroforese tank, spaties vermijden. Vul de tank met vers gemaakte pH> 13 elektroforese buffer (paragraaf 1.2.4) totdat het vloeistofniveau enkel betrekking op de dia's (vermijd bellen over de agarose en zorg ervoor dat de tank-niveau). Noteer de pH en temperatuur aan het begin van DNA afwikkelen.
- Laat de dia's blijven in de alkalische buffer gedurende 20 min om afwikkelen van het DNA en expressie van alkalisch aansprakelijk schade.
- Tijdens afwikkelen Programmeer de voeding van 0,7 V / cm in de elektroforese tank (V / cm = Volt gedeeld door de afstand in cm tussen de positieve en negatieve elektroden) te produceren.
- Na rust te komen, drukt u op de run-knop op de voeding. Pas indien nodig de huidige 300 mA door het verhogen of verlagen van de buffer-niveau. Houd the buffer niveau net boven het oppervlak van de glijbanen. Voeren elektroforese bij 4 ° C gedurende 20 min. Noteer de schuif plaatsing, de temperatuur van de buffer en (ampère) aan het begin en einde van elektroforese.
LET OP: Te veel buffer zal resulteren in lagere spanningen die kunnen interfereren met DNA migratie. - Na elektroforese neutraliseren van de overmaat alkali door voorzichtig optillen van de dia's uit de tank en dompelen in neutralisatie buffer (sectie 1.2.5) gedurende 5 min. Giet de dia's en herhaal nog twee keer.
- Bevestig de objectglaasjes door onderdompeling in koude 100% ethanol gedurende 5 minuten. Laat de dia's aan de lucht drogen en in een droge ruimte voor opslag.
6. DNA kleuring, Comet visualisatie en analyse
- DNA-kleuring
- Plaats de dia's op een kartonnen of metalen bak en voeg 200 ul van nucleïnezuur fluorescerende werkende vlek oplossing (paragraaf 1.2.7) naar elke dia en dek af met een glazen afdekplaat slip. Bescherm de dia's uitlicht kan de objectglaasjes in contact te blijven met de kleuroplossing ten minste 30 minuten voor scoring. Vlekken op de schuiven in batches van 20 per keer.
- Voor het lezen van elke dia, zachtjes vlek weg overtollige kleuroplossing, zorg dat u de dekking van glas niet te verstoren.
- Comet Visualisatie en Scoring
- Gebruik een videocamera bevestigd aan een fluorescentiemicroscoop om live beelden van de komeet dia op de computer monitor te bekijken.
- Willekeurig kiezen voor een microscoop veld met cellen. Met behulp van een muis, selecteert u een cel. Klik op het midden van de "komeet head" met de linker klik van de muis.
OPMERKING: De software berekent alle meetparameters voor de cel en voegt de gegevens naar een gegevensbestand. - Scoren alle cellen in het huidige veld (zie stap 6.2.4), en vervolgens het podium controles van de microscoop en de video op het scherm om een andere reeks cellen te vinden. Scoren deze cellen zoals beschreven in 6.2.2.
- Score de dia from rechts naar links en naar boven. Kies rond de 10 velden willekeurig. Tijdens dit proces moet elke geschikte kometen cel die in het beeldveld wordt gescoord zonder vertekening.
LET OP: Wees niet scoren een komeet als een van de volgende is waar: 1) het is gelegen op een van de randen van de dia; 2) twee of meer kometen overlappen; 3) is er puin in de staart; 4) de software geen onderscheid tussen de kop en de staart; of 5) de kleuring van de kern en / of de staart verschilt sterk van andere kometen op de dia.
LET OP: Kometen met bijna al hun DNA fluorescentie in de staart worden vaak aangeduid als 'hedgehog' kometen. Hedgehog kometen niet gescoord, maar het aantal egels gedetecteerd tijdens de slede scoring moeten worden geregistreerd en gerapporteerd als percentage van de totale kometen. - Analyseer ten minste 75 kometen per slide, het lezen van twee dia's per orgaan / weefsel om ten minste 150 komeet cellen / sample in het verkrijgen van totale. Nadat het vereiste aantal cellen van een dia te hebbenen scoorde, het resultaat wordt opgeslagen als een spreadsheet bestand voor latere data-analyse.
7. Histopathologie Analyse
- Na minimaal 72 uur fixatie in 10% NBF, gevolgd door knippen weefsel 21, routinematig verwerken en inbedden van de linker laterale kwab van de lever monsters in paraffine wasbasis medium 22. Sectie de monsters bij ongeveer 5 micron en laat op glasplaatjes.
- Vlekken op de secties met hematoxyline en eosine (H & E):
- Verwarm de dia's met de paraffine coupes in een 60 ° C oven gedurende 2 uur voorafgaand aan de kleuring procedure.
- Xyleen aan de zijkanten deparaffinize. Hydrateren de dia's met gesorteerde ethanol (EtOH) om een stromend leidingwater afspoelen.
- Plaats de objectglaasjes in 450 ml hematoxyline gedurende 2 min en 40 sec. Spoel de dia's met zuur (2 ml ijsazijn tot 450 ml gedemineraliseerd water) voor 4 sec gevolgd door 5 min stromend water afspoelen.
- Plaats de uitgeschovenes in 450 ml 70% EtOH met 1 ml ammoniumhydroxide gedurende 2 minuten, gevolgd door stromend water spoelen gedurende 2 minuten en 30 seconden, en 70% EtOH spoelen gedurende 1 minuut.
- Incubeer de glaasjes met 450 ml Eosine Y oplossing van 4 ml ijsazijn gedurende 3 min.
- Dehydrateer de dia's met gesorteerde EtOH. Wis de dia's met xyleen (drie maal 1 min elk), en houd dia's in xyleen tot dekglaasjes op de dia's worden geplaatst.
- Onderzoek de glaasjes met lichtmicroscopie, opnemen bevindingen en rang non-neoplastische laesies heftigheid 1 (minimaal), 2 (mild), 3 (matig) of 4 (gemarkeerd).
OPMERKING: De ernstgraad aangevraagde specifieke laesie is gebaseerd op de relatieve verhouding van de lever met de laesie (minimale = <1-15%; mild = 16-35%; matig = 36-60%, en gemarkeerd = 61- 100%).
8. Data-analyse
- Het dier wordt beschouwd als de experimentele eenheid voor statistische evaluatie. DNA-schade wordt uitgedrukt als% DNEen in de staart.
- Oxidatieve DNA-schade wordt als volgt berekend: de referentie-slides (geen enzym behandeling) een raming van de achtergrond DNA-breuken (SB).
LET OP: Het enzym behandelde dia's bieden een zekere mate van breuken en geoxideerde basen (SB + OX). Uitgaande van een lineaire respons dosis voor% DNA in de staart als functie DNA-beschadiging, aftrekken van SB van SB + OX geeft een schatting van DNA breuken van geoxideerde pyrimidines / gewijzigde purines 23. - Analyseren% DNA in de staart als functie van de dosis door one-way ANOVA gevolgd door Dunnett voor paarsgewijze vergelijkingen van de reacties bij behandelde dieren het voertuig controle.
Opmerking: Alle tests zijn eenzijdige en een p-waarde van minder dan 0,05 ingesteld als criterium voor statistische significantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in vivo alkaline comet assay werd uitgevoerd samen met de enzymgemodificeerd komeettest zowel directe en oxidatieve schade DNA in de lever van ratten behandeld met cyproteronacetaat (CPA) 5 meten. CPA is een synthetische hormonaal geneesmiddel dat rattenlever tumoren induceert in een sex-specifieke wijze, met vijfvoudig hogere doses nodig levertumoren bij mannelijke ratten dan bij vrouwen 24 induceren. We vonden dat directe DNA-schade door CPA in de lever van mannelijke en vrouwelijke ratten heeft dezelfde sekse-specifiek patroon als hepatotumorigenicity: een vijfvoudige-hogere dosis CPA is nodig om een aanzienlijke toename van DNA schade in het induceren levers van mannetjes dan bij vrouwen (figuur 1).
We veronderstellen dat het geslacht-specifieke komeettest is het gevolg van de activiteit van hydroxysteroid sulfotransferase (s) (HST), die 15-voudig hogerbij volwassen vrouwelijke ratten dan bij volwassen mannen. HST metabolisme is een snelheidsbeperkende stap in de activatie van CPA-DNA bindende metaboliet (en) 25. Daarentegen CPA oxidatieve DNA schade algemeen groter bij mannen dan vrouwen rattenlevers en dus minder gemakkelijk een snelheidsbeperkende stap in tumorvorming (figuur 2) zijn. Histopathologie evaluatie van levers CPA-behandelde ratten toonde geen bewijs van middel geïnduceerde apoptose of necrose (tabellen 1 en 2), wat aangeeft dat de positieve komeettest resultaten waren geen secundair effect van cytotoxiciteit 5. Figuren 1 en 2 en de tabellen 1 & 2 worden herdrukt met toestemming van Elsevier BV (referentie 5).
Figuur 1. schade DNA in levers van CPA behandelde mannelijke en vrouwelijke ratten measured de in vivo alkaline comet assay. Groepen van vijf zeven weken oude mannelijke en vrouwelijke F344 ratten werden behandeld met olijfolie of met 10, 25, 50 of 100 mg / kg / dag CPA in olijfolie. De behandelingen werden uitgevoerd bij 0, 24 en 45 uur werden de ratten 48 uur opgeofferd en DNA schade werd gemeten in lever% staart DNA met de alkaline comet assay. CPA behandeling induceerde een toename% staart DNA in de lever van mannelijke ratten in een drempelwaarde-achtige wijze met aanzienlijke verhogingen gedetecteerd alleen de 50 en 100 mg / kg / dag dosis. CPA behandeling geïnduceerde DNA breuken in de levers van vrouwelijke ratten in een bijna lineaire dosis-afhankelijke wijze, met een aanzienlijke toename in% staart DNA gedetecteerd in alle CPA groepen. De Laagste waargenomen Genotoxiciteit Effect Levels (LOGELs) voor CPA geïnduceerde DNA-schade in de levers van vrouwelijke en mannelijke ratten werden geschat op 10 en 50 mg / kg / dag respectievelijk,. * Significant op p ≤ 0,05 opzichte van het voertuig control; foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Oxidatieve DNA schade in levers CPA-behandelde mannelijke en vrouwelijke ratten gemeten met de gemodificeerde enzym in vivo alkaline comet assay. Groepen van vijf zeven weken oude mannelijke en vrouwelijke F344 ratten werden behandeld met olijfolie of met 10, 25, 50 of 100 mg / kg / dag CPA in olijfolie. De behandelingen werden uitgevoerd bij 0, 24 en 45 uur werden de dieren na 48 uur opgeofferd en de met enzymen gemodificeerde comet assay werd uitgevoerd met behulp% staart DNA als statistiek van DNA-schade. Alle CPA doses veroorzaakte significante toenames in Endo III-gevoelig DNA schade in de levers van CPA-behandelde mannelijke ratten; terwijl Endo III-gevoelige DNA dAmage werd alleen waargenomen bij vrouwelijke ratten behandeld met 25, 50 en 100 mg / kg / dag CPA (A). Alle CPA doses resulteerden in een aanzienlijke stijging van hOGG1-gevoelige oxidatieve DNA-schade in de lever van mannelijke ratten; verhogingen hOGG1-gevoelige DNA schade werden alleen gedetecteerd bij vrouwelijke ratten die met 50 en 100 mg / kg / dag CPA (B). * Significant op p ≤ 0,05 opzichte van de controle voertuig; foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabellen 1 en 2. Histopathologie analyseresultaten. Sinds cytotoxiciteit vals-positieve komeettest resultaten, histopathologische assessments voor apoptotische en / of necrotische cellen kunnen genereren moeten worden uitgevoerd voor de komeet-positieve weefsels. In de huidige studie, no-CPA geïnduceerde hepatocyte apoptose of necrose werd waargenomenin levers van zowel mannelijke als vrouwelijke ratten, die de mogelijkheid van een vals positieve reactie komeettest uitgesloten.
| Laesie | Gegevens | dosis CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocyte cytoplasma vacuolisatie | letsel Count | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # Onderzocht | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Laesie% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| Gem Severity | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocyt mitose | letsel Count | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # Onderzocht | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Laesie% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| Gem Severity | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Tabel 1. Incidentie van non-neoplastische laesies in levers van voertuig- en CPA-behandelde mannelijke F344 ratten.
| Laesie | Gegevens | dosis CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocyte cytoplasma vacuolisatie | letsel Count | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # Onderzocht | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Laesie% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| Gem Severity | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocyt mitose | letsel Count | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # Onderzocht | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Laesie% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| Gem Severity | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocyt Karyomegaly | letsel Count | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # Onderzocht | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Laesie% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| Gem Severity | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Tabel 2. Incidentie van niet-neoplastische laesies in levers van voertuig-en CPA-behandelde vrouwen F344 ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft het gelijktijdig meten van zowel directe als oxidatieve DNA-schade in rat lever bij de single cell niveau. Het algemene protocol is toepasbaar op elk weefsel waarvan enkele cellen of kernen kunnen worden geïsoleerd met minimale procesgeïnduceerde DNA schade (bijv DNA schade geïnduceerd niet door het testmiddel, maar door de behandeling en verwerking van het dierlijk weefsel). In ons onderzoek hebben we alkaline comet tests uitgevoerd op de cellen uit het beenmerg 7,9, maag 6, nieren 9, 9 blaas-, long- 9, hart 10, borstklier 5, baarmoeder 5, testis 5, en bloed 5. Deze testen kunnen een snelle, eenvoudige en goedkope methode voor het bestuderen van lichaamsvreemde-geïnduceerde DNA-schade in meerdere organen en weefsels van proefdieren te bieden. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor menselijke biomonitoringstudies door het uitvoeren van assays, bijvoorbeeld perifere bloed, geëxpandeerdcellen van de urinewegen, of de buccale of nasale epitheel verkregen uit klinisch of beroepsmatig blootgestelde personen. De basisaanpak kan ook worden gebruikt voor het evalueren DNA schade in gekweekte cellen in vitro.
Wanneer de komeettest is geïntegreerd in acute of subchronische toxicologisch onderzoek, de bemonstering tijd, dat wil zeggen, de tijd tussen de laatste behandeling en het weefsel collectie, is een kritische variabele die soms moet worden verzoend met de inning van andere toxicologische gegevens. Indien mogelijk moet de bemonstering tijden zijn gebaseerd op tijdsverloop komeet data, het tijdstip waarop de piek plasma of weefsel concentratie (Cmax) wordt bereikt, of na steady state wordt bereikt na meervoudige toedieningen van de test artikel 19. In gevallen werden kinetische data of weefsel concentraties niet beschikbaar zijn, de OESO TG489 raadt het uitvoeren van twee of meer behandelingen en het verzamelen van weefsels 2-6 uur na de laatste behandeling, of, indien een enkele behandeling isuitgevoerd, bemonsteren weefsel zowel 2-6 en 16-26 uur na de behandeling 19.
Het is cruciaal dat de tijd van euthanasie comet prepareren zo kort mogelijk. Het is raadzaam dat de experimentele competentie worden vastgesteld door aan te tonen vaardigheid in het verkrijgen van hoge kwaliteit single celsuspensies snel van de weefsels die worden getest. In het algemeen moet comet objectglaasjes zo snel mogelijk na dierenoffer worden bereid met één celpreparaat die maximaal één uur. Oprichting van een historische database te bereiken en verdelingen van de negatieve (medium) controles vast te stellen wordt sterk aangeraden om ervoor te zorgen dat de test is onder goede controle. Hoog gehalte aan DNA-schade kan worden waargenomen in de auto / negatieve controle dieren wanneer de volgende gevallen: 1) onjuiste behandeling van het weefsel; 2) een te lange tijd tussen euthanasie en komeet slide voorbereiding; of 3) blootstelling van de enkele celsuspensie UV-met dag licht. Oprichting van een historische database voor de reeksen en verdelingen van positieve controles wordt ook sterk aanbevolen om te verzekeren dat de test toont juiste gevoeligheid voor bekende genotoxinen. Methylmethaansulfonaat (MMS) werd als positieve controle in de huidige studie; ethyl methaan sulfonaat (EMS) wordt aanbevolen door JaCVAM als een positieve controle voor de in vivo komeettest 18.
Integratie van digesties met laesie specifieke endonucleasen in de komeet assay protocol verhoogt de gevoeligheid en specificiteit van de test door de erkenning van bepaalde soorten DNA-laesies in het voorbeeld hier gepresenteerde, geoxideerd DNA-basen. Het zal echter worden erkend dat bepaalde endonucleasen kunnen herkennen en splitsen bij verschillende klassen van DNA-beschadigingen kunnen zijn; bij Endo III valt lesies niet gerelateerd aan oxidatieve DNA schade. Een positieve Endo III-gemodificeerde komeettest resultaat kan een gemengde MOA aan te geven. By vergelijking, hOGG1 is meer specifiek voor oxidatieve letsels en de gegevens van een-hOOG1 gemodificeerde test kan meer nuttig zijn voor de oprichting van een MOA dat oxidatieve DNA schade 11 gaat zijn.
Cytotoxiciteit (cel apoptose en necrose) kan leiden tot DNA-breuken en een vals positief komeettest resultaat: positieve komeettest resultaten zelf kan niet worden geïnterpreteerd als genotoxiciteit. Informatie op cytotoxiciteit moet de biologische relevantie van een positief resultaat comet assay vastgesteld. Histopathologisch analyse van komeet-positieve weefsels wordt aanbevolen door de OESO TG489 als een relevante maatregel van weefsel toxiciteit 19. Positieve komeettest gegevens met duidelijk bewijs van weefsel toxiciteit (apoptose of necrose) moeten zorgvuldig worden geïnterpreteerd.
De in vivo alkaline comet assay en de Endo III- en hOGG1 gemodificeerde alkaline comet assays kunnen worden gebruikt in een kwantitatieve manier om beslissingen te nemen over de genotoxiciteitlichaamsvreemde blootstellingen. Ze kunnen ook worden gebruikt voor fundamenteel onderzoek in DNA schade en herstel in verschillende dierlijke weefsels voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
- Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
