Introduction
碱性彗星试验在单细胞水平测量DNA链断裂。单个细胞的悬浮液被嵌入在琼脂糖上的显微镜载玻片和细胞裂解而形成的类核，其中包含的DNA超螺旋环路。电泳在pH> 13的结果在超螺旋的在含有链断裂，与DNA的朝向阳极迁移释放链DNA环的损失，创建可以通过荧光显微镜观察彗星状结构。片段化DNA从彗星的“头”到基于所述片段的大小，以及相对于总强度（头部和尾部）彗星尾巴的相对荧光的“尾巴”迁移可以用来量化DNA断裂1 ，2。该法简便，灵敏，多功能，快速，相对便宜1。引起的DNA损伤剂片段化DNA的检测中使用的测定法用于定量细胞中的DNA损伤或分离自细胞核INDIVI具有潜在基因毒性材料（多个）处理的动物的双重组织。由于它的优点， 体内彗星试验被推荐为第二体内遗传毒性试验（ 与体内微核试验配对）在当前国际协调会议（ICH）3和欧洲食品安全局进行产品安全评估（EFSA ）4监管指引。在我们的实验室，我们已采用的测定法中通过食品成分，医药品，和纳米材料5-10诱导的体内 DNA损伤评估。大鼠肝将被用作在本协议的例子，但可以用实验动物的其他组织/器官，只要完整的单细胞可从组织中分离地进行彗星测定。
某些类型的DNA损伤的难以检测的DNA断裂，而无需修改基本碱性彗星试验。在氧化性DNA损伤的情况下，股breaks可以在氧化损伤中的DNA通过用修复酶诸如人8-羟基鸟嘌呤-DNA -N-糖基化酶1（hOGG1基因，它在8-羟基鸟嘌呤（8-oxoGua）和甲基fapy鸟嘌呤11创建场所消化来创建。此外，核酸内切酶III（内Ⅲ）主要产生场所在氧化嘧啶1，因此，在加入的酶消化步骤使得该测定用于测定体内 12氧化性DNA损伤的特定和灵敏的方法。利用这些测定中，我们已经证明在大鼠和小鼠6-8的肝脏和大鼠10的心脏毒物诱导的氧化性DNA损伤。
碱性彗星试验在遗传毒理学和人体生物监测许多应用程序：1）作为后续体内试验通过敏感的体外鉴别基因毒素测试3,13，2）评价的多个组织外源性诱导的DNA损伤的机制14，3）进行调查，如果一个致癌物操作使用毒性或动作的一个非基因毒性模式（MOA）7，4）以评价DNA损伤修复15，5）调查人类疾病和职业暴露16，和6），其为潜在的高通量筛选测定法器官特异性基因毒性17。
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Protocol
伦理学声明：涉及动物的程序已经批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在美国FDA /国家毒理学研究中心。
注：这里所描述的研究设计是基于由日本中心的替代方法验证（JaCVAM）为他们的体内啮齿动物碱性彗星试验18验证开发的协议，并进一步修改根据OECD指南建议TG489 19 。
1.准备
- 幻灯片准备
- 在1％溶解定期熔化琼脂糖（重量/体积）在磷酸盐缓冲液（钙离子 ，镁离子的分类和无酚红）通过在微波炉中加热。
- 放置在55℃的水浴中熔化1％标准琼脂糖溶液并平衡同浴的温度。浸显微镜玻片到琼脂糖溶液，流掉任何excesš琼脂糖和擦拭干净的幻灯片的后面。放置幻灯片直立在平坦表面上，并允许滑动在RT干燥;存放在干燥的地方的幻灯片。
- 彗星试验方案的准备
- 制备0.5％的低熔点琼脂糖溶液。琼脂糖溶解低熔点磷酸盐缓冲液（钙离子 ，镁离子 ，和无酚红）通过在微波炉中加热。在保持37-45℃的溶液彗星玻片制备过程中;事后丢弃任何剩余的琼脂糖溶液。
- 准备裂解液。使二钠乙二胺四乙酸（EDTA二钠，先生372.24克/摩尔），2.5M氯化钠（NaCl，先生58.44克/摩尔），和10mM三羟甲基氨基甲烷（Tris碱，先生121.14克/摩尔）的100mM溶液在纯水中，并调节至pH 10用10N氢氧化钠水溶液（NaOH，先生为40g /摩尔）。上使用的当天，添加的Triton X100和二甲基亚砜（DMSO，先生78.13克/摩尔）该溶液中来实现最终concentrat的分别为1％和10％，离子和搅拌在4-10℃下在使用前至少30分钟。
- 就使用当天新鲜的酶缓冲液。制备含40mM的2- [4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES，先生238.3克/摩尔），100毫氯化钾（KCl，先生74.55克/摩尔），0.5毫摩尔的溶液EDTA二钠，和在纯水中的0.2％牛血清白蛋白（BSA，先生66463克/摩尔）。将pH调节至8.0与10氢氧化钾溶液（KOH 56.9克/摩尔）。搅拌在RT，并验证在使用之前完全溶解。
- 制备含有300mM NaOH和在纯水中1毫EDTA二钠的碱性缓冲溶液。搅拌在4-10℃下在使用前至少30分钟。测量使用和确保pH为> 13之前的溶液的pH值。
- 制备的0.4M Tris碱在纯水中的溶液，并调整到与盐酸（HCl议员，36.46），PH值7.5。存储在4-10℃的溶液中。这是中和缓冲区。
- 让˚FRESH上使用的当天切碎缓冲区。制备含有20mM EDTA二钠和10％DMSO中Hank氏平衡盐溶液中的溶液（HBSS，钙离子 ，镁离子 ，和无酚红）。存储在冰上直到使用。
- 以制备染色溶液中，在1稀核酸荧光染色原液用Tris-硼酸盐EDTA（TBE缓冲液）：10,000（体积/体积）。保护使用铝箔的光解决方案。保存在2-8℃，并用24小时使用。
2.从大鼠肝单细胞悬浮液的制备
- 安乐死在动物组织安乐死美国兽医指导建议的 CO 2气体以下方法鼠：2013年版20。
- 在2.75设置的 CO 2流速。把大鼠在安乐死室（ 例如 ，干燥器罐子，大鼠笼排出盖），并通过打开罐阀打开的 CO 2。等待1.5至2.5分钟，直到老鼠变得不省人事。增加的 CO 2流至其最大设置。呼吸停止后，离开大鼠在腔室大约1分钟，以确保安乐死。通过触诊，以确认老鼠已经没有心跳，捏脚趾，以确定老鼠不撤回其肢体验证安乐死。
- 消毒头发皮肤用70％乙醇。打开腹腔并用手术剪去除完整的肝脏。取出肝脏后，从手术剪剩下的肝脏取出左外叶。放置在切割板上的左外叶，并用一次性单刃剃刀片切断两个相邻3-4毫米厚的横截面。
- 放置在滤纸上一个横截面（防止部的卷曲），并将部分成10％的中性缓冲的福尔马林（NBF）。确保10％NBF中对组织的比例为10：1或更大。后至少72小时，PROC的注视时间ESS组织病理学（见第7，下同）的肝脏。
- 放置第二横向肝脏部分到5毫升冰冷切碎缓冲液（部分1.2.6）在6cm培养皿中，并冲洗3次，以除去残留的血液。
- 转移肝脏部分以含有1毫升冰冷的切碎缓冲器新的2ml离心管中。讳言有一对细剪刀以释放细胞的良好的漂洗肝脏部分。通过40微米的细胞滤网过滤细胞悬浮液，以除去任何组织肿块。
- 放置在冰上的单细胞悬浮液，并使用1小时内使滑动。通过计数（ 例如 ，用血细胞计数器或电子细胞计数器），以确保它的浓度是约2×10 6细胞/ ml验证细胞的浓度。
3.彗星幻灯片的制备
- 混合的单细胞悬液中的一个体积与10体积的熔融，37℃，0.5％的低熔点琼脂糖溶液（1.2.1节）。立即吸取100微升到涂有常规低熔点琼脂糖（1.1节）的幻灯片。立即将在细胞琼脂糖混合盖玻片。使至少8玻片每个样品。
注意：所有载玻片应由数字或类似代码被识别及其识别记录，从而使滑动可以以盲方式进行评分（参见6.2.2，下文）。 - 莱幻灯片平，冷却至4℃，30分钟。
- 胶凝固后，轻轻取下盖玻片，沉浸在预冷裂解液（第1.2.2节）的幻灯片。从光保护的幻灯片，并保持在裂解缓冲液的幻灯片在从1小时（最小）4℃至O / N（最大）。
4.幻灯片彗星酶处理
- 除去从裂解缓冲液各组织样品制备的8幻灯片6和冲洗他们3倍与在RT酶缓冲液（部分1.2.3）每次5分钟。用剩下的两个幻灯片碱性彗星试验W¯¯ithout酶治疗（见5.1，下同）。漂洗后，通过排放并用纸巾吸干载玻片除去过量的液体。
- 稀释用酶缓冲液hOGG1基因和远藤酶III股票以1：1000（V / V）。在冰上放置直至使用。
- 应用200微升以下解决方案，从每个治疗组准备的幻灯片：200微升单独酶缓冲液（2张幻灯片作为参考幻灯片），200微升hOGG1基因溶液（2张幻灯片）或200微升远藤III解决方案（2张幻灯片）的。
- 把滑入与湿润的纸巾内衬培养皿，盖用封口膜的幻灯片，并在37°C孵育45分钟的EndoⅢ-处理并参考滑梯和hOGG1基因处理的载玻片30分钟。
- 孵化后，用蒸馏水冲洗幻灯片和低于5.2说明，继续处理。
放料和电泳
- 对于未用酶处理过的载玻片，从裂解缓冲液取出幻灯片，漏的幻灯片，并用冷的中和缓冲液（部分1.2.5）冲洗一次5分钟以去除残留的清洁剂和盐。
- 从步骤4.5和在水平凝胶电泳槽5.1随机发生滑动时，避免了任何空格。装满新鲜的pH值> 13电泳缓冲液（1.2.4节），坦克，直到液面刚好盖住幻灯片（避免在琼脂糖泡沫，并确保坦克水平）。记录在DNA解旋的起始缓冲液的pH和温度。
- 让载玻片保持在碱性缓冲液中20分钟，以允许的碱容易损坏的DNA和表达的退绕。
- 期间展开，程序电源，以在电泳槽（伏/厘米=伏特的正和负电极之间以cm除以距离）0.7伏/厘米。
- 平仓后，按下电源运行按钮。如果需要的话，通过提高或降低的缓冲水平调节电流300毫安。保持日Ë缓冲水平只是幻灯片的表面之上。在4℃下进行电泳20分钟。记录在开始和电泳的端滑动安置，缓冲器的温度和电流（安培）。
注：太多缓冲器将导致较低的电压，可以用DNA迁移干扰。 - 电泳后，通过从罐5分钟轻轻提起的幻灯片，并在中和缓冲液中浸渍（部分1.2.5）中和过量的碱。漏的幻灯片，并重复两次以上。
- 通过在冷100％乙醇中浸渍5分钟，固定在滑动。允许的幻灯片空气干燥并置于贮存干燥的地方。
6. DNA染色，彗星可视化和分析
- DNA染色
- 放置在纸板或金属托盘的幻灯片，并添加200μl的核酸荧光染色工作溶液（部分1.2.7）的对每个幻灯片，用玻璃盖玻片覆盖。保护幻灯片光允许滑动到得分之前与染色溶液保持接触至少30分钟。染色在20批次的幻灯片在一个时间。
- 看完每张幻灯片之前，轻轻吸干多余的染色液，小心不要去打扰玻璃盖。
- 彗星可视化和评分
- 使用连接到荧光显微镜一台摄像机到电脑显示器上显示的彗星幻灯片的实时图像。
- 随机选择含有细胞在显微镜领域。使用鼠标，选择一个单元格。点击“彗头”，用鼠标的左键的中心。
注：计算机软件计算用于小区中的所有测量参数和数据添加到数据文件。 - 分数在当前场中（见步骤6.2.4）中的所有单元格，然后用显微镜的阶段控制和屏幕上的视频，了解另一组细胞。得分这些细胞如6.2.2所述。
- 分数幻灯片˚FROM从右到左，下到上。随机选取约10场。在此过程中，出现在视野的任何合适的彗星细胞应不带偏见进行评分。
注意：不要得分，彗星如有以下情况是真实的：1）它位于任何幻灯片的边缘; 2）两个或更多个彗星重叠; 3）有一个在尾碎片; 4）软件不能在头部和尾部之间区分;或5）的核和/或尾部的染色从幻灯片上其他彗星大不相同。
注：在尾部几乎所有的DNA荧光彗星通常称为“刺猬”彗星。刺猬彗星不应该被打进，但滑动得分期间检测刺猬的数目应记录并报告为总彗星的百分比。 - 分析每张幻灯片至少75颗彗星，每读器官/组织两个幻灯片获得至少150彗星细胞/总样本。从幻灯片所需数量的细胞后有可恩得分，结果被保存为后期数据分析的电子表格文件。
7.组织病理学分析
- 在10％NBF最少72小时的固定，接着组织修整21后，常规处理和嵌入样品的左侧肝叶中基于介质22石蜡蜡。部分样品在大约5微米，并收集在载玻片上。
- 染色用苏木＆曙红（H＆E）的部分：
- 加热与石蜡的组织切片的载玻片在60℃的烘箱中之前染色过程2小时。
- 使用二甲苯deparaffinize两侧。以补充水分梯度乙醇（乙醇）到正在运行的自来水冲洗的幻灯片。
- 放置在450毫升苏木的玻片2分钟和40秒。用酸漂洗载玻片（2毫升冰醋酸至450毫升去离子水），持续4秒通过5分钟流动的自来水冲洗以下。
- 放置下滑ES在含有1ml氢氧化铵进行2分钟，随后流动的自来水冲洗2分钟，30秒和1分钟70％的乙醇漂洗450毫升70％乙醇。
- 孵育含有4毫升冰醋酸3分钟450毫升曙红Y溶液的幻灯片。
- 脱水用梯度乙醇的幻灯片。清除与二甲苯的幻灯片（3次，每次1分钟），并保持在二甲苯滑动，直到盖玻片放置在载玻片上。
- 审查通过光学显微镜，记录的调查结果，并为强度等级非肿瘤性病变的幻灯片为1（最小），2（轻度），3（中度），或4（标记）。
注：施加于一个特定的病变的严重性等级是基于肝脏与病变的相对比例（最小= <1-15％;轻度= 16-35％;中等= 36-60％;及标记= 61- 100％）。
8.数据分析
- 动物被认为是统计评估试点单位。 DNA损伤表示为％的DNA有尾。
- 氧化性DNA损伤的计算方法如下：参考幻灯片（无酶处理）提供背景的DNA链断裂（SB）的估计值。
注：酶处理载玻片提供链断裂的量度和氧化碱（SB + OX）。假设为％的DNA在尾巴DNA损伤的功能的线性剂量反应，从SB + OX SB的减法给出了从氧化嘧啶/改变嘌呤23的DNA链断裂的估计。 - 分析在尾％DNA作为通过单向ANOVA的剂量函数，随后Dunnett检验对治疗动物的车辆控制的响应的成对比较。
注：所有的测试都是单尾和小于0.05的p值被设定为标准进行统计意义。
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Representative Results
结合进行用酶改性的彗星试验在体内碱性彗星试验以测量在用醋酸环丙孕酮（CPA）5处理的大鼠的肝直接和氧化性DNA损伤。 CPA是一种人工合成的激素药物诱导大鼠肝脏肿瘤特定性别的方式，用五倍诱导雄性大鼠肝脏肿瘤相比，女24例需要更高剂量。我们发现，通过单次转换在雄性和雌性大鼠的肝脏中产生的直接的DNA损伤具有相同性别特异性图案作为其hepatotumorigenicity：需要的CPA五倍-较高剂量以诱导在DNA损伤一个显著增加男性肝脏相比女性（ 图1）。
我们推测这种性别特异性彗星试验结果是由于羟基磺（多个）（HST）的活性，它是15倍高成年雌性大鼠比成年男性。 HST代谢是在CPA的活化DNA结合代谢物25的限速步骤。与此相反，CPA诱发氧化性DNA损伤在雄性比雌性大鼠肝脏通常较大，因而不太可能是一个限速在肿瘤形成步骤（ 图2）。从CPA处理的大鼠肝脏的组织病理学评价表明没有剂诱导的细胞凋亡或坏死（ 表1和2）的证据，表明正彗星试验结果不是细胞毒性5的次级效应。 图1和2以及表1和2转载与爱思唯尔BV（参考文献5）的许可。
图1. CPA治疗雄性和雌性大鼠我的肝脏DNA损伤asured 与体内 碱性彗星试验。五七周大的雄性和雌性F344大鼠组分别用橄榄油或处理10，25，50，或100毫克/公斤/天CPA橄榄油。处理在0，24进行，45小时后，大鼠在48小时处死，并使用碱性彗星试验在肝脏为％尾部DNA测定DNA损伤。 CPA处理诱导雄性大鼠的肝脏中的阈值状方式增加％尾部DNA，与被检测仅与50和100毫克/公斤/天的剂量显著增加。 CPA处理诱导雌性大鼠的肝脏中DNA链的断裂的接近线性的剂量依赖性，在所有CPA组检测％尾部DNA显著增加。在雌性和雄性大鼠肝脏CPA引起的DNA损伤的最低可观测遗传毒性影响水平（LOGELs）估计为10和50mg / kg /天，分别。 *在相对于车辆CONP≤0.05重大控制;误差棒代表标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图中CPA治疗男性肝脏和雌性大鼠2 DNA氧化损伤与酶改性 体内 碱性彗星实验检测的五七周龄雄性和雌性F344大鼠组分别用橄榄油或10治疗， 25，50，或100毫克/公斤/天CPA橄榄油。处理在0，24进行，45小时后，将动物在48小时处死，并用％尾巴DNA作为DNA损伤的量度被进行酶修饰彗星试验。所有CPA剂量产生在CPA治疗雄性大鼠的肝脏远藤III敏感的DNA损伤显著增加;而远藤III敏感的DNA序列检测仅与25，50，和100毫克/公斤/天单次转换（A）的处理过的雌性大鼠豪悦。所有CPA剂量导致雄性大鼠的肝脏hOGG1基因敏感DNA氧化损伤显著增加;只有在50和100mg / kg /天CPA（B）的处理过的雌性大鼠中检测到在hOGG1基因敏感DNA损伤增加。 *相对于媒介物对照P≤0.05重大;误差棒代表标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1和2。组织病理分析结果，由于细胞毒性可产生假阳性彗星试验结果，组织病理学评估的凋亡和/或坏死的细胞应该彗星正组织进行。在目前的研究中，没有观察到单次转换诱导肝细胞凋亡或坏死在雄性和雌性大鼠，这排除假阳性彗星试验反应的可能性肝脏。
| 病变 | 数据 | 剂量CPA | ||||
| 0毫克/千克 | 10毫克/千克 | 25毫克/千克 | 50毫克/千克 | 100mg / kg的 | ||
| 肝细胞胞浆空泡 | 皮损数 | 1 | 1 | 五 | 五 | 6 |
| ＃审查 | 6 | 五 | 五 | 五 | 6 | |
| 病变％ | 17％</ TD> | 20％ | 100％ | 100％ | 100％ | |
| 平均严重性 | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| 肝细胞有丝分裂 | 皮损数 | 0 | 0 | 五 | 五 | 6 |
| ＃审查 | 6 | 五 | 五 | 五 | 6 | |
| 病变％ | 0 | 0 | 100％ | 100％ | 100％ | |
| 平均严重性 | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
表1.媒介物和CPA处理雄性F344大鼠肝脏非肿瘤性病变的发生率。
| 病变 | 数据 | 剂量CPA | ||||
| 0毫克/千克 | 10毫克/千克 | 25毫克/千克 | 50毫克/千克 | 100mg / kg的 | ||
| 肝细胞胞浆空泡 | 皮损数 | 1 | 3 | 五 | 五 | 五 |
| ＃审查 | 五 | 五 | 五 | 五 | 五 | |
| 病变％ | 20％ | 60％ | 100％ | 100％ | 100％ | |
| 平均严重性 | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| 肝细胞有丝分裂 | 皮损数 | 0 | 五 | 五 | 五 | 五 |
| ＃审查 | 五 | 五 | 五 | 五 | 五 | |
| 病变％ | 0 | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | |
| 平均严重性 | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| 肝细胞Karyomegaly | 皮损数 | 0 | 0 | 五 | 五 | 五 |
| ＃审查 | 五 | 五 | 五 | 五 | 五 | |
| 病变％ | <TD> 00 | 100％ | 100％ | 100％ | ||
| 平均严重性 | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
表2.在车辆和CPA处理的雌性F344大鼠的肝脏非肿瘤性病变的发生率。
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Discussion
这个协议描述了在单细胞水平在大鼠肝直接和氧化性DNA损伤的同时测量。一般协议，适用于从单个细胞或细胞核可以用最少的处理诱导的DNA损伤被分离的任何组织（ 即 ，诱导不是由测试试剂，而是由动物组织的处理和加工的DNA损伤）。在我们的研究中，我们对细胞从骨髓7,9，胃6，9肾，膀胱9，肺9，10心脏，乳腺5，子宫5，睾丸5，和血5进行碱性彗星试验。这些分析可以为研究在多个器官和实验动物的组织外源性诱导的DNA损伤的快速，简单，廉价的方法。此外，可以通过进行测定中使用这种方法对人类生物监测研究，例如，外周血，剥离尿路细胞，或者从临床或职业暴露个人获得的口腔或鼻腔上皮。基本的方法也可用于评估在体外培养的细胞中的DNA损伤。
当彗星试验被整合到急性或亚慢性毒理学研究，采样时间， 即 ，最后的处理和组织收集之间的时间，是有时必须与其他的毒理学数据的收集调和一个关键的变量。如果可能的话，取样时间应根据时间进程彗星数据，在该峰值血浆或组织浓度（Cmax）实现，或稳定状态下试验制品19的多次施用取得后的时间。在例动力学数据或组织中的浓度不可用，OECD TG489建议进行两个或更多的治疗和在最后一次治疗后收集组织2-6小时，或者，如果一个单一的治疗是进行，治疗后19取样在两个2-6和16-26小时的组织。
至关重要的是，时间从安乐死长度彗星载玻片制备是尽可能短。最好是该实验的能力通过在从被测定组织迅速获得高质量的单细胞悬浮液表现出熟练建立。一般情况下，彗星幻灯片应尽快牲准备后，与单细胞制剂服用最多一个小时。强烈建议的历史数据库，建立范围和负（载体）对照分布建立以确保该测定是适当的控制下。 DNA损伤含量超标可能会在车辆/阴性对照的动物，当出现以下情况可以观察到：1）处理组织不当; 2）太长安乐死和彗星玻片制备之间的时间;或3）单细胞悬液的暴露于UV-containinG光。对于范围和阳性对照的分布的历史数据库的建立也强烈建议，以确保化验显示已知基因毒素适当的灵敏度。甲磺酸甲酯（MMS）用作在目前的研究的阳性对照;甲磺酸乙酯（EMS）由JaCVAM推荐为在体内彗星试验18的阳性对照。
掺入具有特定病变核酸内切酶消化成彗星测定方案增加了测定的通过识别特定类型的DNA的敏感性和特异性病变-在例如这里介绍，氧化DNA碱基。然而，应该认识到，某些核酸内切酶可以是能识别并在各种类别的DNA损伤的切割的;在远藤III的情况下，这包括不与氧化性DNA损伤相关的病变。正远藤III修饰彗星试验结果可能表明混合MOA。乙Ÿ比较，是hOGG1基因对氧化损伤和数据更具体从hOOG1改性试验可能是建立一个涉及DNA氧化损伤11 MOA更加有用。
细胞毒性（细胞凋亡和坏死），可能会导致DNA链断裂和假阳性彗星试验结果：由自己正彗星试验结果不能被解释为基因毒性。对毒性的信息是需要建立一个积极的彗星试验结果的生物相关性。彗星阳性组织病理学分析是OECD TG489推荐为组织毒性19的相关措施。与组织的毒性（细胞凋亡或坏死）的明显证据正面彗星试验数据应仔细解释。
在体内碱性彗星试验和远藤III-和hOGG1基因改性的碱性彗星测定法可以以定量的方式被用于做出有关的遗传毒性决定外源性风险。它们也可以被用来进行在多个动物组织DNA损伤和修复的基础研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
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