Introduction
Det alkaliska komet Analysen mäter DNA-strängbrott vid enkelcellnivån. Suspensioner av enskilda celler är inbäddade i agaros på ett objektglas och cellerna lyserades för att bilda nucleoids, vilka innehåller supertvinnade slingor av DNA. Elektrofores vid pH> 13 resulterar i förlusten av supercoiling i DNA slingor innehåller strängbrott, med frigjorda DNA-strängarna migrerar mot anoden, skapar kometliknande strukturer som kan observeras genom fluorescensmikroskopi. Fragmenterat DNA vandrar från "huvudet" av komet i "svans" baserat på storleken av fragmentet, och den relativa fluorescensen hos kometsvans jämfört med den totala intensiteten (huvud och svans) kan användas för att kvantifiera DNA-brott 1 , 2. Analysen är enkel, känslig, mångsidig, snabb, och relativt billiga 1. Detektion av fragmenterat DNA orsakad av DNA-skadande medel används en analys för kvantifiering av DNA-skada i celler eller isolerade kärnor från indidubbla vävnader hos djur som behandlats med potentiellt genotoxisk material (s). På grund av dess fördelar, är kometen analysen in vivo rekommenderas som en andra in vivo genotoxiska analys (parad med mikrokärntest in vivo) för att leda produktriskvärderingar i nuvarande International Conference on Harmonisation (ICH) 3 och Europeiska myndigheten för livsmedelssäkerhet (EFSA ) 4 föreskrifter. I vårt labb har vi använt analysen för att utvärdera in vivo DNA-skada inducerad av livsmedelsingredienser, läkemedel och nanomaterial 5-10. Råttlever kommer att användas som ett exempel i detta protokoll, men komet analys kan utföras med andra vävnader / organ hos försöksdjur, så länge som intakta enskilda celler kan isoleras från vävnaden.
Vissa typer av DNA-skador är svåra att upptäcka som DNA-strängbrott utan att modifiera den grundläggande alkaliska kometanalys. I fallet med oxidativ DNA-skada, del Bsidbrytningar kan skapas på oxidativa skador i DNA genom digerering med reparationsenzymer såsom humant 8-oxoguanine-DNA-N-glykosylas 1 (hOGG1, vilket skapar avbrott i 8-oxoguanine (8-oxoGua) och metyl-fapy-guanin 11. också, Endonukleas III (Endo III) skapar raster huvudsakligen vid oxiderade pyrimidiner 1. tillsatsen av ett enzym-digereringssteget gör analysen en specifik och känslig metod för mätning av oxidativ DNA-skada in vivo 12. med hjälp av dessa analyser har vi visat toxikant-inducerad oxidativ DNA-skada i levern hos råttor och möss 6-8 och i hjärtat hos råttor 10.
Den alkaliska komet analysen har många tillämpningar inom genetisk toxikologi och biologisk övervakning: 1) som en uppföljning in vivo-analys för genotoxins identifierats av känsliga in vitro tester 3,13, 2) att utvärdera mekanismerna för xenobiotiska-inducerad DNA-skador i flera vävnader 14, 3) att undersöka om encancerframkallande fungerar med hjälp av en genotoxisk eller en icke-genotoxiska verkningssätt (MOA) 7, 4) för att utvärdera DNA-skador reparation 15, 5) för att undersöka mänskliga sjukdomar och yrkesmässig exponering 16, och 6) som en potentiell high-throughput screening test för organspecifika genotoxicitet 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: som deltar i djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid FDA / National Center for toxikologisk forskning.
OBS: studiedesign som beskrivs här bygger på protokoll som utvecklats av det japanska centret för validering av alternativa metoder (JACVAM) för sin validering av in vivo gnagare alkalisk komet analys 18, och ytterligare modifierad baserat på rekommendationerna i OECD riktlinje TG489 19 .
1. Beredning
- glaspreparering
- Lös upp regelbunden smält agaros vid 1% (vikt / volym) i fosfatbuffert (Ca2 +, Mg2 + fri och fritt från fenolrött) genom upphettning i en mikrovågsugn.
- Placera den smälta 1% standard agaros lösning i en 55 ° C vattenbad och jämvikta temperaturen med badet. Doppa objektglas i agaroslösningen, avrinning excesär agaros och torka baksidan av bilderna ren. Placera glasen upprätt på en plan yta och låta bilderna torka vid RT; lagra bilderna i torrt.
- Beredning av komet analyslösningar
- Bered 0,5% lågsmältande agaros lösning. Upplösa lågsmältande agaros i fosfatbuffert (Ca2 +, Mg2 +, och fritt från fenolrött) genom upphettning i en mikrovågsugn. Förvara lösningen vid 37-45 ° C under komet glaspreparering; kassera eventuella kvarvarande agaroslösningen efteråt.
- Förbereda Lysis-buffert. Gör en 100 mM lösning av dinatrium-etylendiamintetraättiksyra (dinatrium-EDTA, herr 372,24 g / mol), 2,5 M natriumklorid (NaCl, herr 58,44 g / mol) och 10 mM tris hydroximetyl aminometan (Tris-bas, herr 121,14 g / mol) i renat vatten, och justera till pH 10 med 10 N natriumhydroxidlösning (NaOH, Mr 40 g / mol). På dagen för användning, tillsätt Triton X100 och dimetylsulfoxid (DMSO, Herr 78,13 g / mol) till lösningen för att uppnå den slutliga Koncentratjoner av 1% och 10%, respektive, och rör om vid 4-10 ° C under minst 30 min före användning.
- Gör färsk enzymbuffert på användningsdagen. Bered en lösning innehållande 40 mM 2- [4- (2-hydroxietyl) piperazin-1-yl] etansulfonsyra (HEPES, Herr 238,3 g / mol), 100 mM kaliumklorid (KCl, herr 74,55 g / mol), 0,5 mM dinatrium-EDTA, och 0,2% bovint serumalbumin (BSA, Mr 66463 g / mol) i renat vatten. Justera pH till 8,0 med 10 N kaliumhydroxidlösning (KOH, 56,1 g / mol). Rör om vid RT och verifiera fullständig upplösning före användning.
- Förbereda en alkalisk buffertlösning innehållande 300 mM NaOH och 1 mM dinatrium-EDTA i renat vatten. Rör om vid 4-10 ° C under minst 30 minuter före användning. Mäta lösningens pH före användning och se till att pH-värdet är> 13.
- Bered en lösning av 0,4 M Tris Base i renat vatten, och justera till pH 7,5 med saltsyra (HCI, Mr 36,46). Lagra lösningen vid 4-10 ° C. Detta neutraliserande buffert.
- gör fresh mals buffert på användningsdagen. Bered en lösning innehållande 20 mM dinatrium-EDTA och 10% DMSO i Hanks balanserade saltlösning (HBSS, Ca2 +, Mg2 +, och fritt från fenolrött). Förvara på is fram till användning.
- För att framställa färgningslösningen, utspädd nukleinsyra fluorescerande fläcken av utgångslösningen med Tris-borat-EDTA (TBE-buffert) vid 1: 10000 (vol / vol). Skydda lösningen från ljus med hjälp av aluminiumfolie. Förvaras vid 2-8 ° C och använd med 24 tim.
2. Framställning av Enkelcellsuspensioner från råttlever
- Avliva råttor med CO2 gas följande metoder som rekommenderas i American Veterinary Medical riktlinjer för avlivning av djur: 2013 Edition 20.
- Ställ in CO2 flöde på 2,75. Sätt råtta i dödshjälp kammaren (t.ex. torkapparat burk, råtta bur med ventilerat lock) och slå på CO2 genom att öppna ventilen på tanken. Vänta på 1,5 till 2,5 min tillsråtta blir medvetslös. Öka CO2 flöde till dess maximala inställning. Efter upphörande av andning, lämna rat i kammaren under ca 1 min för att säkerställa eutanasi. Verifiera dödshjälp palperas för att bekräfta att råttan har inga hjärtslag, och nyper tårna för att fastställa att råttan inte tillbaka sitt lem.
- Desinficera haired hud med 70% etanol. Öppna bukhålan och ta bort den intakta levern med kirurgisk sax. Efter avlägsnande av levern, avlägsna den vänstra sido lob från kvarvarande lever med kirurgisk sax. Placera den vänstra sido lob på en skärbräda och skär två intilliggande 3-4 mm tjocka tvärsektioner med hjälp av en engångs enda kanter rakblad.
- Placera en transversell sektion på filterpapper (för att förhindra krusning av avsnitt), och placera sektionen in i 10% neutral buffrad formalin (NBF). Se till att förhållandet mellan 10% NBF till vävnad är 10: 1 eller större. Efter en fixering av minst 72 timmar, procESS levern för histopatologi (se avsnitt 7 nedan).
- Placera den andra tvärgående leversektion in i 5 ml iskall hack buffert (avsnitt 1.2.6) i en 6 cm petriskål och skölj 3 gånger för att avlägsna kvarvarande blod.
- Överföra levern sektionen till en ny 2 ml centrifugrör innehållande 1 ml iskall hack buffert. Finhacka väl sköljda leversektion med ett par fina sax för att frigöra cellerna. Sila cellsuspensionen genom en 40 ìm cell sil för att avlägsna eventuella vävnads klumpar.
- Placera enda cellsuspensionen på is och använda för att göra diabilder inom en timme. Kontrollera koncentrationen av celler genom att räkna (t.ex. med en hemocytometer eller elektronisk cellräknare) för att säkerställa att dess koncentration är ca 2 x10 6 celler / ml.
3. Beredning av Comet Slides
- Blanda en volym av enkelcellsuspension med 10 volymer av smält, 37 ° C, 0,5% lågsmältande agaros-lösning (avsnitt 1.2.1).Omedelbart pipett 100 ul på en bild belagd med vanlig smältpunkt agaros (avsnitt 1.1). Omedelbart placera en täckglas över cell agaros blandningen. Göra minst 8 glider för varje prov.
OBS: Alla objektglas bör identifieras genom ett nummer eller liknande kod och deras identitet registreras, så att bilderna kan görs i blint (se 6.2.2 nedan). - Fastställa objektglasen platt och kyl till 4 ° C under 30 min.
- Efter gelen har stelnat, försiktigt bort täckglas och fördjupa glasen i förväg kyld lysbuffert (avsnitt 1.2.2). Skydda bilderna från ljus och hålla bilderna i lys-buffert vid 4 ° C från 1 timme (minimum) till O / N (max).
4. Enzym Behandling av Comet Slides
- Ta bort sex av de 8 glider framställda från varje vävnadsprov från lyseringsbuffert och skölj dem 3x under 5 min vardera med enzymbuffert (avsnitt 1.2.3) vid RT. Använd de återstående två bilder för alkaliska comet assay wtan att enzymbehandling (se 5,1, nedan). Efter sköljning, ta bort överflödig vätska genom dränering och läsk bilderna med vävnaderna.
- Späd hOGG1 och Endo III enzymlager med enzymbuffert vid 1: 1000 (volym / volym). Placera på is fram till användning.
- Applicera 200 l av följande lösningar på bilderna som framställts från varje behandlingsgrupp: 200 pl enzym enbart buffert (2 bilder som används som referensbilder), 200 pl hOGG1 lösning (2 bilder) eller 200 ^ Endo III-lösning (2 bilder).
- Sätta objektglasen i Petri-plattor fodrade med fuktat pappershanddukar, täcker objektglasen med Parafilm, och inkubera vid 37 ° C under 45 min för Endo III-behandlade och referens diabilder och 30 min för hOGG1-behandlade objektglas.
- Efter inkubation, skölj glasen med destillerat vatten och fortsätta bearbetningen som beskrivs i 5.2, nedan.
5. avkoppling och elektrofores
- För diabilder som inte behandlats med enzymer, ta bort bilderna från lysbuffert, Dränera diabilder och skölj en gång med kall neutralisering buffert (avsnitt 1.2.5) under 5 minuter för att avlägsna kvarvarande tvättmedel och salter.
- Placera objektglasen från steg 4,5 och 5,1 slumpmässigt i en horisontell gelelektrofores tank, undvika mellanslag. Fyll tanken med nybakade pH> 13 elektroforesbuffert (avsnitt 1.2.4) tills vätskenivån bara täcker diabilder (undvika bubblor över agarosen och se till att tanken är nivån). Anteckna pH och temperatur i början av DNA avveckling.
- Låt objektglasen vara kvar i alkalisk buffert under 20 min för att möjliggöra avlindning av DNA och uttryck av alkali-ansvarig skada.
- Under avlindningen fortsätter programströmförsörjningen producera 0,7 V / cm i elektroforestanken (V / cm = Volt dividerat med avståndet i cm mellan de positiva och negativa elektroderna).
- Efter avlindning, tryck på knappen kör på strömförsörjningen. Om det behövs, ställa in strömmen till 300 mA genom höjning eller sänkning buffertnivån. hålla the buffert nivå strax ovanför ytan av objektglasen. Utföra elektrofores vid 4 ° C under 20 min. Spela in bildplacering, temperaturen för bufferten och de nuvarande (ampere) i början och slutet av elektrofores.
OBS: För mycket buffert resulterar i lägre spänningar som kan störa DNA migration. - Efter elektrofores, neutralisera överskott av alkali genom att försiktigt lyfta bilderna från tanken och nedsänkning i neutralisering buffert (avsnitt 1.2.5) under 5 min. Töm bilderna och upprepa två gånger.
- Fäst bilderna genom nedsänkning i kallt 100% etanol i 5 minuter. Låt objektglasen lufttorka och placera den i ett torrt utrymme för förvaring.
6. DNA Färgning, Comet visualisering och analys
- DNA-färgning
- Placera glasen på en kartong eller metallbricka och tillsätt 200 pl av nukleinsyra fluorescerande fläck arbetslösning (avsnitt 1.2.7) till varje bild och täck med ett glas täckglas. Skydda bilderna frånljus låta bilderna vara kvar i kontakt med färgningslösningen under minst 30 minuter innan poäng. Stain bilderna i omgångar av 20 åt gången.
- Innan du läser varje bild, försiktigt blot bort överflödigt färgningslösningen och försiktigt så att inte störa skyddsglas.
- Comet Visualisering och Scoring
- Använd en videokamera ansluten till en fluorescensmikroskop för att se live-bilder av kometen glida på datorskärmen.
- Slumpmässigt välja en mikroskopfält som innehåller celler. Med hjälp av en mus, välj en cell. Klicka på mitten av "komet huvudet" med vänster musklick.
OBS! Datorns programvara beräknar alla mätparametrar för cellen och lägger till data till en datafil. - Göra alla celler i det aktuella fältet (se steg 6.2.4), och sedan använda mikroskop scen kontroller och video på skärmen för att hitta en annan uppsättning av celler. Betyg dessa celler som beskrivs i 6.2.2.
- Betyg glid from från höger till vänster och ner upp. Välj cirka 10 fält slumpmässigt. Under denna process bör helst lämplig komet cell som visas i synfältet görs utan förutfattade meningar.
OBS: inte poäng en komet om något av följande är sant: 1) det ligger på någon av kanterna på bilden; 2) två eller flera kometer lappar; 3) det finns skräp i svansen; 4) programvaran kan inte skilja mellan huvudet och svansen; eller 5) färgningen av kärnan och / eller svans skiljer sig mycket från andra kometer på bilden.
OBS: komet med nästan alla deras DNA fluorescens i svansen är ofta kallade "hedgehog" kometer. Hedgehog kometer bör inte görs, men antalet igelkottar upptäckts under bild poäng ska registreras och redovisas som en procentsats av den totala kometer. - Analysera minst 75 kometer per bild, läsa två bilder per organ / vävnad för att erhålla åtminstone 150 komet celler / prov totalt. Efter erforderligt antal celler från en bild har varaen poäng, resultatet sparas som en kalkylbladsfil för senare analys av data.
7. Histopatologi Analys
- Efter minst 72 h fixering i 10% NBF, följt av vävnads trimning 21, rutinmässigt bearbeta och bädda in den vänstra laterala leverlob av proverna i en paraffin-vax baserat medium 22. § proverna vid ca 5 mikron och samla på objektglas.
- Färga sektioner med hematoxylin och eosin (H & E):
- Värma objektglasen med de paraffinvävnadssnitt i en ugn vid 60 ° under 2 h före färgningsproceduren.
- Använd xylen att Avparaffinera sidorna. Rehydrera objektglasen med graderad etanol (EtOH) till en rinnande kranvatten sköljning.
- Placera objektglasen i 450 ml hematoxylin under 2 min och 40 sek. Skölj objektglasen med syra (2 ml isättika till 450 ml avjoniserat vatten) för 4 sek följt av 5 min rinnande kranvatten sköljning.
- Placera gledes i 450 ml 70% EtOH innehållande 1 ml ammoniumhydroxid under 2 min, följt av rinnande kranvatten sköljning under 2 minuter och 30 sekunder, och 70% EtOH sköljning i 1 min.
- Inkubera objektglasen med 450 ml Eosin Y lösning innehållande 4 ml isättika i 3 min.
- Torka glasen med graderade EtOH. Rensa glasen med xylen (tre gånger 1 min vardera), och hålla glasen i xylen tills täckglas placeras på bilderna.
- Undersök bilderna av ljusmikroskop, spela fynd och kvalitet icke-neoplastiska lesioner för svårighetsgrad som en (minimal), 2 (mild), 3 (måttlig), eller 4 (markerad).
OBS! Svårighetsgrad ansökt om en viss skada är baserad på den relativa andelen av levern med skadan (minimala = <1-15%, mild = 16-35%; måttlig = 36-60%; och märkt = 61- 100%).
8. Dataanalys
- Djuret anses experimentella enheten för statistiska utvärderingar. DNA-skada uttrycks som% DNA i svansen.
- Oxidativ DNA-skada beräknas på följande sätt: referens glider (inget enzym behandling) ger en uppskattning av bakgrunds-DNA strängbrott (SB).
OBS! Enzymbehandlade objektglas ger ett mått på strängbrott och oxiderade baser (SB + OX). Under antagande av en linjär dosrespons för% DNA i svansen som en funktion av DNA-skada, subtraktion av SB från SB + OX ger en uppskattning av DNA-strängbrott från oxiderade pyrimidiner / förändrade puriner 23. - Analysera% DNA i svansen som en funktion av dosen med en-vägs ANOVA, följt av Dunnetts test för parvisa jämförelser av svaren i behandlade djur till vehikelkontroll.
OBS: Alla tester är ensidigt och ett p-värde på mindre än 0,05 är inställd som kriterium för statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo alkaliska komet Analysen utfördes i samband med enzymmodifierat komet analys för att mäta både direkt och oxidativ DNA-skada i levern hos råttor som behandlats med cyproteronacetat (CPA) 5. CPA är en syntetisk hormonläkemedel som inducerar tumörer råttlever i en könsspecifikt sätt, med fem-faldigt högre doser krävs för att inducera levertumörer hos hanråttor jämfört med honor 24. Vi fann att den direkta DNA-skador som produceras av CPA i levern hos han- och honråttor har samma könsspecifika mönster som dess hepatotumorigenicity: behövs en femfaldig-högre dos av CPA för att framkalla en betydande ökning av DNA-skada i lever av män jämfört med kvinnor (Figur 1).
Vår hypotes är att den könsspecifika komet analysresultatet beror på aktiviteten hos hydroxisteroid sulfotransferasaktivitet (s) (HST), vilket är 15 gånger högrehos vuxna honråttor än hos vuxna män. HST ämnesomsättning är ett hastighetsbegränsande steg i aktiveringen av CPA till DNA-bindande metabolit (er) 25. I motsats härtill var CPA-inducerad oxidativ DNA-skada i allmänhet större i manliga än kvinnliga råttlevrar, och därmed mindre sannolikt att vara ett hastighetsbegränsande steg i tumörbildning (Figur 2). Histopatologisk utvärdering av levrar från CPA-behandlade råttor visade inga tecken på medel-inducerad apoptos eller nekros (Tabell 1 och 2), vilket indikerar att de positiva komet analys resultaten var inte en sekundär effekt av cytotoxicitet 5. Figurerna 1 & 2 och tabellerna 1 & 2 återges med tillstånd av Elsevier (referens 5).
Figur 1. DNA-skador i levern hos CPA-behandlade han- och honråttor migasured med den alkaliska komet analysen in vivo. Grupper om fem sju veckor gamla manliga och kvinnliga F344 råttor behandlades med olivolja eller med 10, 25, 50, eller 100 mg / kg / dag CPA i olivolja. Behandlingar genomfördes vid 0, 24, och 45 h, avlivades råttorna vid 48 h, och DNA-skador mättes i levern som% svans-DNA med användning av den alkaliska kometanalysen. CPA behandling inducerade en ökning i% svans-DNA i levern hos hanråttor i en tröskel-liknande sätt, med betydande ökningar detekteras endast med mg / kg / dag doser 50 och 100. CPA behandling inducerad DNA-strängbrott i levern hos honråttor i en nära-linjär dosberoende sätt, med betydande ökningar av% svans-DNA detekteras i alla CPA-grupper. Lägsta observerade Genotoxicitet effektnivå (LOGELs) för CPA-inducerad DNA-skador i levern hos kvinnliga och manliga råttor uppskattades vara 10 och 50 mg / kg / dag, respektive. * Signifikant vid p≤0.05 i förhållande till fordons conkontroll; felstaplar representerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Oxidativ DNA-skador i lever av CPA-behandlade han- och honråttor mätt med enzym modifieras in vivo alkalisk kometanalys. Grupper av fem sju veckor gamla manliga och kvinnliga F344 råttor behandlades med olivolja eller med 10, 25, 50, eller 100 mg / kg / dag CPA i olivolja. Behandlingar genomfördes vid 0, 24, och 45 timmar, avlivades djuren vid 48 timmar, och enzymet modifierade komet analys utfördes med användning av% svans-DNA som ett mått på DNA-skada. Alla CPA doser gav signifikanta ökningar av Endo III känslig DNA-skador i levern hos CPA-behandlade hanråttor; medan Endo III-känsliga DNA dAmage detekterades endast i honråttor behandlade med 25, 50, och 100 mg / kg / dag CPA (A). Alla CPA doser resulterade i betydande ökningar i hOGG1 känsliga oxidativa DNA-skador i levern hos hanråttor; ökningar i hOGG1 känslig DNA-skador detekterades endast i honråttor behandlade med 50 och 100 mg / kg / dag CPA (B). * Signifikant vid p≤0.05 förhållande till vehikelkontroll; felstaplar representerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabellerna 1 och 2. Histopatologi analysresultat. Eftersom cytotoxicitet kan generera falskt positiva komet analysresultat, histopatologiska utvärderingar för apoptotiska och / eller nekrotiska celler bör genomföras för komet-positiva vävnader. I den aktuella studien, ingen CPA-inducerad hepatocyte apoptos eller nekros observerasi levern hos både han- och honråttor, som uteslöt möjligheten av ett falskt positivt komet analyssvar.
| lesion | Data | dos CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocyte cytoplasmisk vakuolisering | lesion Count | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # Undersökt | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| lesion% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| avg Severity | 1,0 | 1,0 | 1,2 | 1,8 | 2,0 | |
| hepatocyte mitos | lesion Count | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # Undersökt | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| lesion% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| avg Severity | 0 | 0 | 1,0 | 1,4 | 1,8 | |
Tabell 1. Förekomst av icke-neoplastiska lesioner i lever av fordons- och CPA-behandlade F344 råttor.
| lesion | Data | dos CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocyte cytoplasmisk vakuolisering | lesion Count | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersökt | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lesion% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| avg Severity | 1,0 | 1,3 | 1,8 | 1,8 | 2,0 | |
| hepatocyte mitos | lesion Count | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersökt | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lesion% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| avg Severity | 0 | 1,0 | 1,2 | 1,8 | 2,0 | |
| hepatocyte Karyomegaly | lesion Count | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersökt | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lesion% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| avg Severity | 0 | 1,0 | 1,2 | 1,8 | 2,0 | |
Tabell 2. Förekomst av icke-neoplastiska lesioner i levern hos fordons och CPA-behandlade kvinnliga F344 råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver den samtidiga mätningen av både direkt och oxidativ DNA-skada i råttlever vid den enda cellnivå. Det allmänna protokollet är tillämpbar på varje vävnad från vilken enstaka celler eller kärnor kan isoleras med minimal bearbetning-inducerad DNA-skada (dvs DNA-skada inducerad inte genom testmedlet, utan genom hantering och bearbetning av de djurvävnader). I vår forskning har vi genomfört alkaliska komet analyser på celler från benmärg 7,9, mage 6, njure 9, urinblåsa 9, lunga 9, hjärta 10, bröstkörtel 5, livmoder 5, testiklar 5, och blod 5. Dessa analyser kan ge en snabb, enkel och billig metod för att studera xenobiotiska-inducerad DNA-skada i flera organ och vävnader från försöksdjur. Dessutom kan denna metod användas för mänskliga undersökningar om biologisk övervakning av ledande analyser, till exempel, på perifert blod, exfolieradceller i urinvägarna, eller buckala eller nasala epitel erhållits från kliniskt eller yrkesexponerade individer. Den grundläggande metod också kan användas för att utvärdera DNA-skada i odlade celler in vitro.
När kometen analysen integreras i akuta eller subkronisk toxikologistudier, samplingstiden, det vill säga tiden mellan den sista behandlingen och vävnadsuppsamlings, är en kritisk variabel som ibland måste förenas med insamling av andra toxikologiska uppgifter. Om möjligt bör provtagningstider baseras på tidsförlopps komet uppgifter, den tidpunkt då den maximala plasma eller vävnadskoncentrationen (Cmax) uppnås, eller efter steady state erhålls efter multipla administrationer av testartikeln 19. I fallen kinetiska data eller vävnadskoncentrationer är inte tillgängliga, OECD TG489 rekommenderar att genomföra två eller flera behandlingar och samla vävnader 2-6 timmar efter den sista behandlingen, eller, om en enda behandling ärgenomförts, provtagning vävnader både 2-6 och 16-26 timmar efter behandlingen 19.
Det är viktigt att den tid från dödshjälp till komet glaspreparering vara så kort som möjligt. Det är tillrådligt att experimentell kompetens fastställas genom att visa kunskaper i att få hög kvalitet enda cellsuspensioner snabbt från vävnaderna som analyseras. I allmänhet bör komet glas förberedas så snart som möjligt efter djuroffer, med en enkelcellberedning tar högst en timme. Inrättandet av en historisk databas för att fastställa intervall och distributioner av negativa (vehikel) rekommenderas för att säkerställa att analysen är under lämplig kontroll. Höga halter av DNA-skada kan observeras i fordons / negativa kontrolldjur då följande inträffar: 1) felaktig hantering av vävnad; 2) alltför lång tid mellan eutanasi och komet glaspreparering; eller 3) exponering av en enda cell fjädring för UV-containing ljus. Inrättandet av en historisk databas för intervallen och fördelningarna av positiva kontroller också rekommenderas för att säkerställa att analysen visar lämplig känslighet för kända genotoxins. Metylmetansulfonat (MMS) användes som positiv kontroll i den aktuella studien; etylmetansulfonat (EMS) rekommenderas av JACVAM som en positiv kontroll för in vivo-kometanalys 18.
Införliva spjälkningar med skadespecifika endonukleaser i kometen analysprotokoll ökar känsligheten och specificiteten hos analysen genom erkännande av vissa typer av DNA-skador in exemplet som presenteras här, oxiderade DNA-baser. Man bör dock vara medveten om att vissa endonukleaser kan ha förmåga att känna igen och klyva vid olika klasser av DNA-skador; i fallet med Endo III omfattar detta lesioner som inte är associerade med oxidativ DNA-skada. En positiv Endo III-modifierad komet analysresultatet kan tyda på en blandad MOA. By jämförelse är hOGG1 mer specifik för oxidativa skador och data från en hOOG1 modifierad analys kan vara mer användbar för att upprätta en MOA som innebär oxidativ DNA-skada 11.
Cytotoxicitet (cell apoptos och nekros) kan resultera i DNA-strängbrott och ett falskt positivt komet analysresultat: positiva komet analysresultat i sig kan inte tolkas som genotoxicitet. Information om cytotoxicitet krävs för att fastställa den biologiska betydelsen av en positiv komet analysresultatet. Histopatologisk analys av komet positiva vävnader rekommenderas av OECD TG489 som ett relevant mått på vävnadstoxicitet 19. Positiva komet analysuppgifter med tydliga tecken på toxicitet vävnad (cell apoptos eller nekros) bör tolkas med försiktighet.
In vivo alkaliska kometanalys och Endo III- och hOGG1 modifierade alkaliska komet analyser kan användas på ett kvantitativt sätt att fatta beslut om genotoxicitetxenobiotiska exponeringar. De kan också användas för att bedriva grundforskning i DNA-skador och reparation i flera djurvävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
- Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
