Introduction
Le test des comètes alcalines mesure les ruptures d'ADN au niveau d'une seule cellule. Les suspensions de cellules individuelles sont noyées dans agarose sur une lame de microscope et les cellules ont été lysées pour former nucléoïdes, qui contiennent des boucles surenroulées de l'ADN. Electrophorèse à pH> 13 résultats dans la perte de surenroulement dans des boucles d'ADN contenant la rupture des brins, les brins d'ADN libérés migrent vers l'anode, la création de structures de comète qui peuvent être observées par microscopie à fluorescence. ADN Fragmenté migre de la «tête» de la comète dans la «queue» en fonction de la taille du fragment, et la fluorescence relative de la queue de la comète par rapport à l'intensité totale (de la tête et de la queue) peut être utilisé pour quantifier l' ADN rupture 1 , 2. Le test est simple, sensible, polyvalent, rapide et relativement peu coûteux 1. La détection d'ADN fragmenté causées par des agents endommageant l'ADN est utilisé un dosage pour la quantification des lésions de l'ADN dans les cellules ou les noyaux isolés à partir individeux tissus d'animaux traités avec le matériau (x) potentiellement génotoxiques. En raison de ses avantages, le test in vivo de la comète est recommandé comme un second test in vivo de génotoxicité (jumelé avec le test du micronoyau in vivo) pour effectuer des évaluations de sécurité des produits en cours Conférence internationale sur l' harmonisation (ICH) 3 et Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA ) 4 lignes directrices réglementaires. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé le test pour évaluer des dommages de l' ADN in vivo induite par les ingrédients alimentaires, les produits pharmaceutiques et les nanomatériaux 5-10. Rat foie sera utilisé comme exemple dans ce protocole, mais le test des comètes peut être réalisée avec d'autres tissus / organes d'animaux de laboratoire, aussi longtemps que des cellules individuelles intactes peuvent être isolées à partir du tissu.
Certains types de dommages à l'ADN sont difficiles à détecter que les ruptures d'ADN sans modifier le test des comètes alcalines de base. Dans le cas des dommages oxydatifs à l'ADN, brin breaks peuvent être créés au niveau des lésions oxydatives de l'ADN par digestion avec des enzymes de réparation tels que la 8-oxoguanine ADN-N glycosylase humaine 1 (hOGG1, ce qui crée des pauses à la 8-oxoguanine (8 oxoGua) et la méthyl-fapy-guanine 11. en outre, l' endonucléase III (endo III) crée des sauts principalement à pyrimidines oxydées 1. Ainsi, l'addition d'une étape enzymatique digestion permet le dosage d' une méthode spécifique et sensible pour mesurer les dégâts oxydatifs de l' ADN in vivo 12. en utilisant ces tests, nous avons démontré les dommages oxydatifs à l'ADN induite par la substance toxique dans le foie des rats et des souris 6-8 et dans le cœur des rats 10.
Le test des comètes alcalines a de nombreuses applications en toxicologie génétique et la biosurveillance humaine: 1) en tant que suivi dans l' essai in vivo pour génotoxiques identifiés par sensibles tests in vitro 3,13, 2) pour évaluer les mécanismes de lésions de l' ADN xénobiotiques-induite dans plusieurs tissus 14, 3) pour examiner si unecancérogène fonctionne à l' aide d' un génotoxique ou un mode non génotoxique d'action (MOA) 7, 4) pour évaluer l' ADN réparation des dommages 15, 5) pour étudier les maladies humaines et les expositions professionnelles 16 et 6) comme un test de criblage à haut débit potentiel de spécifique d' un organe de génotoxicité 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Éthique déclaration: procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) au Centre FDA / national pour la recherche toxicologique.
NOTE: La conception de l' étude décrite ici est basée sur le protocole développé par le Centre japonais pour la validation des méthodes alternatives (JaCVAM) pour leur validation de l'essai in vivo rongeur alcaline de la comète 18, et en outre modifié en fonction des recommandations du guide de l' OCDE TG489 19 .
1. Préparation
- préparation de diapositives
- Dissoudre l' agarose ordinaire de fusion à 1% (p / v) dans un tampon phosphate (Ca 2+, Mg 2+ libre et sans rouge de phénol) par chauffage dans un four à micro - ondes.
- Placer la solution agarose fondu 1% standard dans un bain d'eau C 55 ° et équilibrer la température du bain. microscope en verre Dip glisse dans la solution d'agarose, égoutter tout excess agarose et essuyez le dos des lames propres. Placer les lames à la verticale sur une surface plane et laisser les lames sécher à la température ambiante; stocker les lames dans un endroit sec.
- Préparation des solutions d'essai de comète
- Préparer une solution à 0,5% d'agarose à bas point de fusion. Dissoudre l' agarose bas point de fusion dans un tampon phosphate (Ca 2+, Mg 2+, et sans rouge de phénol) par chauffage dans un four à micro - ondes. Gardez la solution à 37-45 ° C pendant la préparation de diapositives comète; jeter toute solution d'agarose restant après.
- Préparer un tampon de lyse. Faire une solution 100 mM de disodique acide éthylènediaminetétraacétique (disodique EDTA, M. 372,24 g / mol), 2,5 M de chlorure de sodium (NaCl, M. 58.44 g / mol), et 10 mM tris hydroxyméthyl aminométhane (Tris Base, M. 121.14 g / mol) dans de l'eau purifiée et ajuster le pH à 10 avec 10 une solution N d'hydroxyde de sodium (NaOH, M. 40 g / mol). Le jour de l'utilisation, ajouter le Triton X-100 et le diméthylsulfoxyde (DMSO, M. 78,13 g / mol) à la solution finale à atteindre concentrations de 1% et 10%, respectivement, et on agite à 4-10 ° C pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
- Faire tampon d'enzyme fraîche le jour de l'utilisation. Préparer une solution contenant 40 mM d'acide 2- [4- (2-hydroxyéthyl) pipérazin-1-yl] éthanesulfonique (HEPES, M. 238,3 g / mol), 100 mM de chlorure de potassium (KCI, M. 74,55 g / mol), 0,5 mM EDTA disodique et 0,2% de sérum albumine bovine (BSA, MM 66463 g / mol) dans de l'eau purifiée. Ajuster le pH à 8,0 avec une solution 10 N d'hydroxyde de potassium (KOH, 56,1 g / mol). On agite à la température ambiante et vérifier la dissolution complète avant l'utilisation.
- Préparer une solution tampon alcaline contenant du NaOH 300 mM et 1 mM d'EDTA disodique dans de l'eau purifiée. Agiter à 4-10 ° C pendant au moins 30 minutes avant utilisation. Mesurer le pH de la solution avant l'utilisation et assurez-vous que le pH est> 13.
- Préparer une solution de 0,4 M de Tris base dans l'eau purifiée, et ajuster à pH 7,5 avec de l'acide chlorhydrique (HCl, M. 36.46). Conserver la solution à 4-10 ° C. Ceci est un tampon neutralisant.
- Faire frèch hachant tampon le jour de l'utilisation. Préparer une solution contenant 20 mM d' EDTA disodique et 10% de DMSO dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, Ca2 +, Mg 2+, et sans rouge de phénol). Stocker sur la glace jusqu'à utilisation.
- Pour préparer la solution de coloration, diluer la tache solution mère nucléique fluorescente d'acide avec du Tris-borate-EDTA (tampon TBE) à 1: 10.000 (v / v). Protéger la solution de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium. Conserver à 2-8 ° C et utiliser avec 24 h.
2. Préparation de la cellule unique Suspensions de foie de rat
- Euthanasier rats avec CO 2 méthodes suivantes de gaz recommandées dans les lignes directrices American Veterinary Medical pour l'euthanasie des animaux: 2013 Édition 20.
- Régler le débit de CO 2 à 2,75. Mettez le rat dans la chambre de l' euthanasie (par exemple, pot de dessicateur, cage de rat avec couvercle ventilé) et tourner sur le CO 2 en ouvrant le robinet de la bouteille. Attendre 1,5 à 2,5 min jusqu'à ce que larat devient inconscient. Augmenter le flux de CO 2 à sa valeur maximale. Après l'arrêt de la respiration, laisser le rat dans la chambre pendant environ 1 minute pour assurer l'euthanasie. Vérifier l'euthanasie en palpant pour confirmer que le rat n'a pas le rythme cardiaque, et pincer les orteils pour déterminer que le rat ne retire pas sa branche.
- Désinfecter le poil peau avec 70% d'éthanol. Ouvrez la cavité abdominale et enlever le foie intact avec des ciseaux chirurgicaux. Après avoir retiré le foie, enlever le lobe latéral gauche du foie restant avec des ciseaux chirurgicaux. Placez le lobe latéral gauche sur une planche à découper et couper deux 3-4 mm sections transversales adjacentes d'épaisseur à l'aide d'une lame à un seul tranchant rasoir jetable.
- Placez une section transversale sur du papier filtre (pour empêcher le curling de la section), et placer la section dans 10% de formol tamponné neutre (FBN). Faire en sorte que le rapport de NBF à 10% pour les tissus est de 10: 1 ou plus. Après un temps de fixation d'au moins 72 heures, procEss le foie pour l'histopathologie (voir la section 7 ci-dessous).
- Placez la deuxième section de foie transversale dans 5 ml glacée émincer tampon (section 1.2.6) dans une boîte de 6 cm de Pétri et rincer 3 fois pour éliminer le sang résiduel.
- Transférer la section de foie dans un nouveau tube de centrifugeuse de 2 ml contenant 1 ml de tampon de hachage glacée. Émincer la section du foie bien rincé avec une paire de ciseaux fins pour libérer les cellules. Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour retirer tous les morceaux de tissu.
- Placez la suspension cellulaire unique sur la glace et utiliser pour faire des diapositives dans 1 h. Vérifier la concentration de cellules en comptant (par exemple, avec un hémocytomètre ou compteur de cellules électronique) pour veiller à ce que sa concentration est d' environ 2 x10 6 cellules / ml.
3. Préparation de Comet Diapositives
- Mélanger un volume de la suspension cellulaire unique avec 10 volumes de fusion, 37 ° C, une solution d'agarose à bas point de fusion à 0,5% (section 1.2.1).pipette Immédiatement 100 pi sur une lame revêtue d'agarose régulière du point de fusion (section 1.1). Immédiatement placer une lamelle sur le mélange de cellules-agarose. Faire au moins 8 diapositives pour chaque échantillon.
NOTE: Toutes les lames doivent être identifiées par un numéro ou un code similaire et de leur identité enregistrées, de sorte que les lames peuvent être marqués en aveugle (voir 6.2.2 ci-dessous). - Poser les diapositives plat et refroidir à 4 ° C pendant 30 min.
- Après le gel est solidifié, retirer délicatement les lamelles et plongez les lames dans un tampon de lyse pré-refroidie (section 1.2.2). Protéger les diapositives de la lumière et de garder les lames dans le tampon de lyse à 4 ° C de 1 h (minimum) à O / N (maximum).
4. Traitement enzymatique de Comet Diapositives
- Retirer 6 des 8 lames préparées à partir de chaque échantillon de tissu provenant du tampon de lyse et les rincer 3x pendant 5 minutes à chaque fois avec le tampon de l'enzyme (section 1.2.3) à température ambiante. Utilisez les deux lames restantes pour l'essai comète alcaline without enzyme-traitement (voir 5.1, ci-dessous). Après rinçage, enlever l'excès de liquide par égouttage et buvard les diapositives avec les tissus.
- Et diluer hOGG1 Endo III stocks enzyme avec du tampon enzymatique à 1: 1000 (v / v). Placer sur la glace jusqu'à utilisation.
- Appliquer 200 pi des solutions suivantes aux diapositives préparées à partir de chaque groupe de traitement: 200 pi de tampon d'enzyme seule (2 diapositives utilisées comme diapositives de référence), III solution Endo 200 solution ul de hOGG1 (2 lames) ou 200 pi (2 lames).
- Mettre les lames dans des boîtes de Pétri doublées avec des serviettes en papier humides, couvrir les lames avec Parafilm, et incuber à 37 ° C pendant 45 min pour Endo III traités et les diapositives de référence et 30 min pour les diapositives hOGG1 traitées.
- Après incubation, rincer les lames avec de l'eau distillée et poursuivre le traitement comme décrit dans 5.2, ci-dessous.
5. Dénouement et Électrophorèse
- Pour les lames non traitées avec des enzymes, enlever les lames du tampon de lyse, Égoutter les lames et rincer une fois avec un tampon de neutralisation à froid (section 1.2.5) pendant 5 min pour éliminer les détergents et les sels résiduels.
- Placer les lames de Steps 4.5 et 5.1 de façon aléatoire dans un réservoir d'électrophorèse sur gel horizontal, en évitant tous les espaces. Remplir le réservoir avec fraîchement préparé pH> 13 tampon d'électrophorèse (section 1.2.4) jusqu'à ce que le niveau de liquide ne couvre que les diapositives (éviter les bulles sur l'agarose et assurez-vous que le réservoir est de niveau). Enregistrez le pH du tampon et de la température au début de l'ADN de déroulement.
- Laisser les lames restent dans le tampon alcalin pendant 20 min pour permettre le déroulement de l'ADN et l'expression des dommages en milieu alcalin responsable.
- Pendant le déroulement, le programme de l'alimentation pour produire 0,7 V / cm dans la cuve d'électrophorèse (V / cm = Volts, divisée par la distance en cm entre les électrodes positives et négatives).
- Après déroulement, appuyez sur le bouton d'exécution sur l'alimentation. Si nécessaire, ajuster le courant de 300 mA, en augmentant ou en abaissant le niveau de mémoire tampon. Gardez eniveau de tampon e juste au-dessus de la surface des lames. Effectuer une électrophorèse à 4 ° C pendant 20 min. Notez l'emplacement de la diapositive, la température du tampon et le courant (ampères) au début et à la fin de l'électrophorèse.
NOTE: Trop tampon se traduira par des tensions plus faibles qui peuvent interférer avec la migration de l'ADN. - Après électrophorèse, neutraliser l'excès d'alcali en soulevant doucement les lames de la cuve et plongeant dans un tampon de neutralisation (section 1.2.5) pendant 5 min. Égoutter les diapositives et répéter deux fois.
- Fixer les lames en les immergeant dans le froid éthanol à 100% pendant 5 min. Laisser sécher les lames d'air et le placer dans un endroit sec pour le stockage.
6. ADN Coloration, Comet visualisation et d'analyse
- coloration de l'ADN
- Placer les lames sur un plateau en carton ou en métal et ajouter 200 pi de solution tache de travail nucléique fluorescente d'acide (section 1.2.7) à chaque diapositive et couvrir avec une lamelle de verre. Protéger les diapositives dela lumière permettent aux diapositives de rester en contact avec la solution de coloration pendant au moins 30 min avant de marquer. Colorer les lames dans des lots de 20 à la fois.
- Avant de lire chaque diapositive, doucement épongez loin la solution de coloration en excès, en faisant attention à ne pas perturber le verre de protection.
- Visualisation Comet et notation
- Utiliser une caméra fixée à un microscope à fluorescence pour afficher des images en direct de la glissière comète sur le moniteur de l'ordinateur.
- Aléatoirement choisir un champ de microscope contenant des cellules. Utilisation d'une souris, sélectionnez une cellule. Cliquez sur le centre de la «tête de comète" avec le clic gauche de la souris.
REMARQUE: Le logiciel calcule tous les paramètres de mesure pour la cellule et ajoute les données dans un fichier de données. - Note toutes les cellules dans le champ en cours (voir étape 6.2.4), puis utiliser les commandes de scène du microscope et la vidéo à l'écran pour trouver un autre ensemble de cellules. Note ces cellules comme décrit dans 6.2.2.
- Note la diapositive fdroit rom à gauche et vers le bas vers le haut. Choisissez environ 10 champs au hasard. Au cours de ce processus, toute cellule comète appropriée qui apparaît dans le champ de vision doit être marqué sans parti pris.
REMARQUE: Ne pas marquer une comète si une des conditions suivantes est remplie: 1) il est situé sur l'un des bords de la lame; 2) deux ou plusieurs comètes se chevauchent; 3) il y a des débris dans la queue; 4) le logiciel ne peut pas différencier entre la tête et la queue; ou 5) la coloration du noyau et / ou la queue diffère grandement des autres comètes sur la diapositive.
NOTE: Les comètes avec la quasi-totalité de leur fluorescence d'ADN dans la queue sont souvent désignés comme des comètes «hérisson». comètes hérisson ne devraient pas être marqués, mais le nombre de hérissons détectés au cours de la notation de diapositives doivent être enregistrées et déclarées en pourcentage des comètes totales. - Analyser au moins 75 comètes par diapositive, à la lecture de deux diapositives par organe / tissu pour obtenir au moins 150 cellules / comète échantillon total. Après que le nombre requis de cellules à partir d'une lame ont soiten a reçu, le résultat est enregistré dans un fichier tableur pour l'analyse ultérieure des données.
7. histopathologie Analyse
- Après un minimum de 72 heures de fixation dans 10% FBN, suivie par le tissu de rognage 21, traiter systématiquement et intégrer le lobe du foie latéral gauche des échantillons dans une paraffine cire à base de support 22. Section des échantillons à environ 5 microns et de recueillir sur des lames de verre.
- Colorer les sections avec hématoxyline & éosine (H & E):
- Chauffer les lames avec les sections de tissu de paraffine dans un four à 60 ° C pendant 2 heures avant la procédure de coloration.
- Utilisez xylène pour Déparaffiner les côtés. Réhydrater les lames avec de l'éthanol gradué (EtOH) à une course rinçage à l'eau du robinet.
- Placer les lames dans 450 ml d'hématoxyline pendant 2 min et 40 sec. Rincer les lames avec de l'acide (acide acétique glacial 2 ml à 450 ml d'eau déminéralisée) pour 4 sec suivant par 5 min en cours d'exécution l'eau du robinet de rinçage.
- Placez le glissées dans 450 ml d'EtOH à 70% contenant 1 ml d'hydroxyde d'ammonium pendant 2 min, puis rinçage à l'eau courante du robinet pendant 2 minutes et 30 secondes, et 70% d'EtOH rinçage pendant 1 min.
- Incuber les lames avec 450 ml de solution d'éosine Y contenant de l'acide acétique glacial 4 ml pendant 3 min.
- Déshydrater les lames avec EtOH gradué. Effacer les diapositives avec du xylène (trois fois 1 min chaque), et maintenir les lames dans le xylène jusqu'à ce que des lamelles sont placées sur les lames.
- Examiner les lames par microscopie optique, les résultats records, et des lésions non néoplasiques qualité de la gravité comme 1 (minimal), 2 (légère), 3 (modéré), ou 4 (marqué).
NOTE: Le degré de sévérité appliquée pour une lésion spécifique est basée sur la proportion relative du foie avec la lésion (= minimum <1-15%; légère = 16-35%, modérée = 36-60%, et marqué = 61- 100%).
Analyse 8. Données
- L'animal est considéré comme l'unité expérimentale pour les évaluations statistiques. endommagement de l'ADN est exprimée en% DNA dans la queue.
- dommages oxydatifs à l'ADN est calculé comme suit: les diapositives de référence (pas de traitement enzymatique) fournissent une estimation des pauses ADN de fond brin (SB).
REMARQUE: Les lames d'enzymes traitées fournissent une mesure de cassures et de bases oxydées (SB + OX). En supposant une dose - réponse linéaire pour l' ADN% dans la queue en fonction des dommages de l' ADN, la soustraction de SB de SB + OX donne une estimation des ruptures de brins d' ADN de oxydées pyrimidines / purines modifiées 23. - Analyser l'ADN% dans la queue en fonction de la dose par une ANOVA, suivie d'un test de Dunnett pour des comparaisons par paires des réponses chez les animaux traités au contrôle du véhicule.
NOTE: Tous les tests sont une queue et une valeur p inférieure à 0,05 est fixé comme critère de signification statistique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le test des comètes alcalines in vivo a été réalisée conjointement avec le test des comètes enzyme modifiée pour mesurer les dommages de l' ADN direct et oxydatif dans le foie des rats traités avec de l' acétate de cyprotérone (CPA) 5. CPA est un médicament hormonal synthétique qui provoque des tumeurs du foie de rat d'une manière spécifique du sexe, avec cinq fois plus fortes doses nécessaires pour induire des tumeurs du foie chez les rats mâles par rapport aux femelles 24. Nous avons constaté que les dommages de l'ADN directement produit par la SCP dans le foie des rats mâles et femelles a le même schéma spécifique du sexe comme son hepatotumorigenicity: une dose cinq fois plus élevé de l'APC est nécessaire pour induire une augmentation significative des lésions de l'ADN dans le foies de mâles par rapport aux femelles (figure 1).
Nous supposons que le résultat du dosage de la comète spécifique du sexe est due à l'activité de la sulfotransférase hydroxystéroïde (s) (TVH), qui est 15 fois plus élevéechez les rats femelles adultes que chez les mâles adultes. Métabolisme TVH est une étape de limitation de vitesse dans l'activation de l' APC au métabolite (s) 25 liaison à l' ADN. En revanche, les dommages oxydatifs à l'ADN CPA induite était généralement plus importante chez les hommes que les foies de rats femelles, et donc moins susceptible d'être une limitation de vitesse étape dans la formation de tumeurs (Figure 2). Évaluation histopathologique des foies de rats CPA-traités n'a montré aucun signe d'apoptose induite par un agent ou (tableaux 1 et 2) la nécrose, ce qui indique que les résultats positifs de l' essai comète ne sont pas un effet secondaire de la cytotoxicité 5. Les figures 1 et 2 et les tableaux 1 & 2 sont réimprimé avec la permission de Elsevier BV (référence 5).
Figure 1. lésions de l' ADN dans le foie de CPA traités hommes et moi les rats femellesasured avec le test de la comète alcaline in vivo. Des groupes de cinq mâles et femelles F344 sept semaines rats ont été traités avec de l' huile d' olive ou de 10, 25, 50 ou 100 mg / kg / jour CPA dans l' huile d' olive. Les traitements ont été effectués à 0, 24, et 45 h, les rats ont été sacrifiés à 48 h, et les dommages de l'ADN a été mesurée dans le foie sous forme d'ADN% de la queue en utilisant le test des comètes alcalines. CPA traitement induit une augmentation de l'ADN de queue% dans le foie des rats mâles d'une manière analogue à seuil, avec des augmentations significatives étant détectées uniquement avec les doses de 50 et 100 mg / kg / jour. traitement CPA ruptures d'ADN dans le foie des rats femelles induite de manière quasi linéaire dose-dépendante, avec une augmentation significative de l'ADN% de queue détectés dans tous les groupes ACP. Les plus bas niveaux observés Génotoxicité effets (LOGELs) pour dommages à l'ADN induits par l'ACP dans le foie des rats mâles et femelles ont été estimées à 10 et 50 mg / kg / jour, respectivement. * Significatif à p≤0,05 par rapport au véhicule concontrôle; barres d'erreur représentent l' écart - type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les dommages oxydatifs de l' ADN dans le foie des hommes CPA-traités et des rats femelles mesurée avec l'essai de comète alcaline modifiée par une enzyme in vivo. Des groupes de cinq mâles et femelles F344 sept semaines rats ont été traités avec de l' huile d' olive ou de 10, 25, 50 ou 100 mg / kg / jour CPA dans l'huile d'olive. Les traitements ont été effectués à 0, 24 et 45 heures, les animaux ont été sacrifiés au bout de 48 heures, et l'essai comète modifiée par une enzyme a été réalisée en utilisant l'ADN% de la queue comme une métrique de dommages à l'ADN. Toutes les doses ACP ont produit des augmentations significatives de dommages à l'ADN Endo III-sensibles dans le foie des rats mâles CPA-traités; tandis que l'Endo III sensible à ADN dAmage n'a été détectée que chez les rats femelles traités avec 25, 50 et 100 mg / kg / jour CPA (A). Toutes les doses de l'ACP ont donné lieu à des augmentations significatives de hOGG1 sensibles dommages oxydatifs à l'ADN dans le foie des rats mâles; l' augmentation des dommages à l'ADN hOGG1 sensibles ont été détectés que chez les rats femelles traitées avec 50 et 100 mg / kg / jour CPA (B). * Significatif à p≤0,05 par rapport au contrôle du véhicule; barres d'erreur représentent l' écart - type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les tableaux 1 et 2. Les résultats des analyses histopathologiques. Depuis cytotoxicité peut générer des résultats d'analyse de la comète faux-positifs, des évaluations histopathologiques pour les cellules apoptotiques et / ou nécrotiques doivent être menées pour les tissus comète positifs. Dans l'étude actuelle, aucune apoptose des hépatocytes ou la nécrose induite CPA a été observéedans le foie des deux rats mâles et femelles, qui excluait la possibilité d'une réponse fausse d'essai comète positive.
| Lésion | Données | dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Vacuolisation cytoplasmique des hépatocytes | Count Lesion | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # examiné | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lésion% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| gravité Moyenne | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hépatocytes mitose | Count Lesion | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # examiné | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lésion% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| gravité Moyenne | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Tableau 1. Incidence des lésions non néoplasiques dans le foie des rats mâles F344 véhicules- et CPA-traités.
| Lésion | Données | dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Vacuolisation cytoplasmique des hépatocytes | Count Lesion | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # examiné | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lésion% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| gravité Moyenne | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| hépatocytes mitose | Count Lesion | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # examiné | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lésion% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| gravité Moyenne | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hépatocytes caryomégalie | Count Lesion | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # examiné | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lésion% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| gravité Moyenne | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Tableau 2. Incidence des lésions non néoplasiques dans le foie de CPA traités rats F344 véhicule et.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit la mesure concurrente de dommages à l'ADN et à l'oxydation directe dans le foie de rat au niveau de la cellule unique. Le protocole général est applicable à tout tissu à partir duquel les cellules ou les noyaux individuels peuvent être isolés avec un minimum de lésions de l' ADN induites par le traitement ( à savoir, des lésions de l' ADN induites et non par l'agent d'essai, mais la manipulation et le traitement des tissus d'origine animale). Dans notre recherche, nous avons procédé à des essais de comètes alcalines sur les cellules de la moelle osseuse 7,9, de l' estomac 6, reins 9, de la vessie 9, poumon 9, coeur 10, glande mammaire 5, de l' utérus 5, testis 5, et le sang 5. Ces essais peuvent fournir une méthode rapide, simple et peu coûteux pour l'étude de lésions de l'ADN induites par des xénobiotiques dans plusieurs organes et de tissus d'animaux de laboratoire. En outre, cette méthode peut être utilisée pour les études de biosurveillance humaine par des essais conducteurs, par exemple, le sang périphérique, exfoliéeles cellules des voies urinaires, ou les épithéliums buccale ou nasale obtenus à partir d'individus cliniquement ou professionnellement exposés. L'approche de base peut également être utilisée pour évaluer les dommages de l' ADN dans des cellules cultivées in vitro.
Lorsque le test de la comète est intégrée dans les études de toxicologie aiguë ou subchronique, le temps d'échantillonnage, à savoir, le temps écoulé entre le dernier traitement et la collecte des tissus, est une variable critique qui doit parfois être conciliée avec la collecte d'autres données toxicologiques. Si possible, les périodes d' échantillonnage doivent être fondées sur des données cours du temps de la comète, l'heure à laquelle le pic plasmatique ou d'un tissu de concentration (Cmax) est atteinte, ou après l' état d' équilibre est atteint suivant plusieurs administrations de l'article d'essai 19. Dans les cas ont été des concentrations de données ou de tissus cinétiques ne sont pas disponibles, TG489 OCDE recommande la réalisation de deux ou plusieurs traitements et la collecte de tissus 2-6 heures après le dernier traitement, ou, si un seul traitement estmenée, l' échantillonnage des tissus à la fois 2-6 et 16-26 heures après le traitement 19.
Il est crucial que la durée de l'euthanasie à la préparation de diapositives comète soit aussi courte que possible. Il est souhaitable que la compétence expérimentale établie par la démonstration des compétences dans l'obtention de suspensions cellulaires unique de haute qualité rapidement à partir des tissus qui sont dosés. En règle générale, les diapositives comète doivent être préparés le plus tôt possible après le sacrifice des animaux, avec la préparation d'une cellule unique prenant un maximum d'une heure. Mise en place d'une base de données historiques pour établir des fourchettes et les distributions de (véhicules) contrôles négatifs est fortement recommandé de veiller à ce que le dosage est sous contrôle approprié. Des niveaux excessifs de dommages à l'ADN peuvent être observés dans les véhicules / négatifs animaux témoins lorsque les conditions suivantes se produisent: 1) mauvaise manipulation du tissu; 2) un temps trop long entre l'euthanasie et la préparation des lames comète; ou 3) l'exposition de la suspension à cellule unique aux UV-containing lumière. Création d'une base de données historique pour les plages et les distributions de contrôles positifs est également fortement recommandé d'assurer que le test affiche une sensibilité appropriée à génotoxiques connus. Méthyl méthanesulfonate (MMS) a été utilisé comme témoin positif dans l'étude actuelle; méthanesulfonate d'éthyle (EMS) est recommandé par JaCVAM comme témoin positif pour le test in vivo comète 18.
Incorporation digestions avec des endonucléases spécifiques de la lésion dans le protocole d'essai comète augmente la sensibilité et la spécificité du dosage par la reconnaissance de types particuliers de lésions génétiques dans l'exemple présenté ici, les bases de l'ADN oxydées. Cependant, il faut reconnaître que certaines endonucléases peuvent être capables de reconnaître et de cliver à différentes catégories de lésions de l'ADN; dans le cas de l'Endo III, ce qui comprend des lésions ne sont pas associées à des dommages oxydatifs de l'ADN. Un résultat de test positif Endo III modifié comète peut indiquer un protocole d'accord mixte. BComparaison de y, hOGG1 est plus spécifique pour les lésions et les données oxydatifs à partir d' un essai de hOOG1 modifié peut être plus utile pour l' établissement d' un protocole d' entente qui implique des dommages oxydatifs à l'ADN 11.
Cytotoxicité (apoptose cellulaire et nécrose) peut entraîner des ruptures de brins d'ADN et un faux résultat de test positif comète: résultats de l'essai de comète positives en elles-mêmes ne peuvent pas être interprétées comme génotoxicité. Informations sur la cytotoxicité est nécessaire pour établir la pertinence biologique d'un résultat de test des comètes positive. L' analyse histopathologique des tissus de la comète positive est recommandée par TG489 OCDE comme une mesure pertinente de la toxicité tissulaire 19. les données d'essai comète positives avec des preuves claires de la toxicité tissulaire (apoptose cellulaire ou une nécrose) doivent être interprétées avec prudence.
Le dosage de la comète alcaline in vivo et les alcalins essais de comète Endo III- et hOGG1 modifiés peuvent être utilisés d'une manière quantitative de prendre des décisions au sujet de la génotoxicitéexpositions xénobiotiques. Ils peuvent également être utilisés pour effectuer la recherche fondamentale sur les dommages de l'ADN et la réparation de tissus animaux multiples.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
- Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
