Introduction
Die alkalische Comet-Assay misst DNA-Strangbrüche auf Einzelzellebene. Suspensionen einzelner Zellen in Agarose auf einem Mikroskop-Objektträger eingebettet und die Zellen lysiert Nukleoide zu bilden, die supercoiled Schleifen von DNA enthalten. Elektrophorese bei pH> 13 führt zum Verlust von Supercoiling in DNA Schlaufen enthaltenden Strangbrüche, mit den befreit DNA-Stränge in Richtung der Anode wandernde, wodurch Kometen artigen Strukturen, die durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden kann. Fragmentierte DNA wandert aus dem "Kopf" des Kometen in den "Schwanz" auf der Basis der Größe des Fragments, und die relative Fluoreszenz des Kometenschweif im Vergleich zu der Gesamtintensität (Kopf und Schwanz) verwendet werden kann , um DNA - Bruch 1 quantifizieren , 2. Der Test ist einfach, empfindlich, vielseitig, schnell und relativ kostengünstig 1. Der Nachweis von fragmentierter DNA durch DNA-schädigende Mittel ist ein Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Zellen oder isolierten Zellkernen von indivi verwendetDoppelgewebe von Tieren, die mit potentiell genotoxischen behandelnde Material (s). Aufgrund seiner Vorteile ist die in - vivo - Comet - Assay als zweite in vivo Genotoxizität Test empfohlen (gepaart mit der in vivo - Mikrokerntest) für die Durchführung von Produktsicherheit Bewertungen in bestehenden International Conference on Harmonisation (ICH) 3 und European Food Safety Authority (EFSA ) 4 regulatorischen Vorgaben. In unserem Labor haben wir den Test zur Bewertung der in - vivo - DNA - Schäden , die durch Lebensmittelzutaten, Pharmazeutika und Nanomaterialien 5-10 induzierte eingesetzt. Rattenleber wird als ein Beispiel in diesem Protokoll verwendet werden, aber der Comet-Assay kann mit anderen Geweben / Organen von Versuchstieren, solange intakten Einzelzellen aus dem Gewebe isoliert durchgeführt werden werden.
Bestimmte Arten von DNA-Schäden sind schwierig, wie DNA-Strangbrüche zu erfassen, ohne die grundlegende alkalischen Comet-Assay modifiziert wird. Im Falle der oxidative DNA-Schäden, Strang bReaks kann durch Verdau mit der Reparatur - Enzyme wie menschliches 8-Oxoguanin-DNA-N-Glycosylase - 1 (hOGG1, die Pausen bei der 8-Oxoguanin erzeugt (8-oxoGua) und Methyl-Fapy-Guanin - 11 bei oxidative Läsionen in DNA erstellt werden. auch Endonuclease III (Endo III) erzeugt Pausen hauptsächlich an oxidiertem Pyrimidine 1. Somit ist die Zugabe eines Enzym-Verdauungsschritt macht den Assay eine spezifische und sensitive Methode zur Messung oxidative DNA - Schädigung in vivo . 12 diese Assays verwendet wird , haben wir gezeigt , toxicant induzierte oxidative DNA - Schädigung in der Leber von Ratten und Mäusen , 6-8 und im Herzen von Ratten 10.
Die alkalische Comet - Assay hat viele Anwendungen in der genetischen Toxikologie und Human - Biomonitoring: 1) als ein Follow-up in vivo - Test für Genotoxinen durch empfindliche identifiziert in - vitro - Tests 3,13, 2) Mechanismen der xenobiotischen-induzierte DNA - Schäden in mehreren Geweben zu bewerten 3) 14, zu untersuchen , ob einKarzinogen betreibt eine gentoxische oder nichtgenotoxisches Wirkungsweise (MOA) 7 verwenden, 4) Reparatur DNA - Schäden zu bewerten 15, 5) 16 menschliche Krankheiten und Belastungen am Arbeitsplatz zu untersuchen und 6) als potenzielle Hochdurchsatz - Screening - Test für organspezifische Genotoxizität 17.
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Protocol
Ethik-Anweisung: Verfahren mit Tieren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) bei der US FDA / Nationales Zentrum für toxikologische Forschung genehmigt.
HINWEIS: Die hier beschriebene Studiendesign basiert auf dem Protokoll , das von dem japanischen Zentrum für die Validierung alternativer Methoden (JaCVAM) für ihre Validierung des Nagetiers in - vivo - Assay alkalische Komet 18 entwickelt und weiter in OECD - Richtlinie auf Empfehlungen modifiziert basierend TG489 19 .
1. Vorbereitung
- Slide Vorbereitung
- Man löst regelmäßig schmelzender Agarose bei 1% (w / v) in Phosphatpuffer (Ca 2+, Mg 2+ frei und Phenolrot frei) durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen.
- Legen Sie das geschmolzene 1% Standard-Agarose-Lösung in einem 55 ° C Wasserbad und ins Gleichgewicht, die Temperatur mit dem Bad. Dip Glasobjektträger in die Agarose-Lösung, abfließen alle excess Agarose und die Rückseite der Folien sauber wischen. Legen Sie die Folien aufrecht auf eine ebene Oberfläche und lassen Sie die Folien bei RT trocknen; Speichern Sie die Folien in trockenen Ort aufbewahren.
- Herstellung von Comet-Assay-Lösungen
- Bereiten Sie 0,5% niedrig schmelzenden Agarose-Lösung. Auflösen niedrigschmelz Agarose in Phosphatpuffer (Ca 2+, Mg 2+ und Phenolrot frei) durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen. Halten Sie die Lösung bei 37-45 ° C während Komet Dia Vorbereitung; verwerfen danach alle verbleibenden Agarose-Lösung.
- Bereiten Sie Lysepuffer. Machen Sie eine 100 mM Lösung von Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Herr 372,24 g / mol), 2,5 M Natriumchlorid (NaCl, Herr 58.44 g / mol) und 10 mM Tris hydroxymethyl aminomethan (Tris-Base, Herr 121,14 g / mol) auf pH 10 mit 10 N Natronlauge (NaOH, Mr 40 g / mol) in gereinigtem Wasser, und zu justieren. Am Tag der Verwendung, Triton X100 und Dimethylsulfoxid (DMSO, Mr 78,13 g / mol) zu der Lösung hinzufügen endgültige Konzentrat zu erreichenIonen von 1% und 10% betragen, und unter Rühren bei 4-10 ° C für mindestens 30 min für die vor der Verwendung.
- Machen Sie frische Enzympuffer am Tag der Nutzung. Bereiten einer Lösung, die 40 mM 2- [4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethansulfonsäure (HEPES, Mr 238,3 g / mol), 100 mM Kaliumchlorid (KCl, Mr 74.55 g / mol), 0,5 mM EDTA und 0,2% Rinderserumalbumin (BSA, Herr 66.463 g / mol) in gereinigtem Wasser. Den pH-Wert auf 8,0 mit 10 N Kaliumhydroxidlösung (KOH, 56,1 g / mol). Rühren bei RT und überprüfen Sie die vollständige Auflösung vor der Verwendung.
- Bereiten Sie eine alkalische Pufferlösung, die 300 mM NaOH und 1 mM EDTA in gereinigtem Wasser. Man rührt bei 4-10 ° C für mindestens 30 min vor der Verwendung. Messung des pH-Werts der Lösung vor der Verwendung und sicherstellen, dass der pH-Wert> 13 auf.
- Bereiten Sie eine Lösung von 0,4 M Tris-Base in gereinigtem Wasser, und stellen auf pH 7,5 mit Salzsäure (HCl, Herr 36.46). Bewahren Sie die Lösung bei 4-10 ° C. Dies wird neutralisierende Puffer.
- Machen Sie fresh mincing Puffer am Tag der Verwendung. Bereiten Sie eine Lösung , die 20 mM EDTA und 10% DMSO in Hanks Balanced Salt Solution enthält (HBSS, Ca 2+, Mg 2+, und Phenol - Rot frei). Lagern auf Eis bis zum Gebrauch.
- Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoff-Stammlösung Zur Färbung Lösung herzustellen, verdünnt mit Tris-Borat-EDTA (TBE-Puffer) bei 1: 10.000 (v / v). Schützen Sie die Lösung vor Licht mit Aluminiumfolie. Lagerung bei 2-8 ° C und mit 24 Stunden verwendet werden.
2. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Rattenleber
- Euthanize Ratten mit CO 2 -Gas folgende Methoden empfohlen in den American Veterinary Medical Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: 2013 Ausgabe 20.
- Stellen Sie den CO 2 Durchflussrate bei 2,75. Legen Sie die Ratte in der Euthanasie Kammer (zB Exsikkator Glas, Rattenkäfig mit belüfteter Deckel) und schalten Sie den CO 2 durch das Flaschenventil geöffnet wird . Warten für 1,5 bis 2,5 min, bis dieRatte wird bewusstlos. Erhöhen Sie die CO 2 Strömung auf seine maximale Einstellung. Nach Beendigung der Atmung, für die Ratte in der Kammer verlassen etwa 1 min Euthanasie zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, Euthanasie durch Palpation, um zu bestätigen, dass die Ratte keinen Herzschlag hat, und Kneifen Sie die Zehen, um festzustellen, dass die Ratte nicht seine Gliedmaßen nicht entziehen.
- Desinfizieren Sie die behaarte Haut mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Bauchhöhle und entfernen Sie die intakte Leber mit chirurgische Scheren. Nach der Leber zu entfernen, entfernen Sie den linken Seitenlappen aus der verbleibenden Leber mit chirurgischen Schere. Platzieren Sie den linken Seitenlappen auf einem Schneidebrett und schneiden Sie zwei benachbarte 3-4 mm dicken Querschnitten mit einem Einweg einschneidig Rasierklinge.
- Setzen Sie einen Querschnitt auf Filterpapier (zur Verhinderung von Kräuseln des Abschnitts) und legen Sie den Abschnitt in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF). Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von 10% NBF an Gewebe 10: 1 oder größer ist. Nach einer Fixierungszeit von mindestens 72 h, Process die Leber für die Histopathologie (siehe Abschnitt 7, unten).
- Legen Sie die zweite Quer Leber Abschnitt in 5 ml eiskaltem Hacken- Puffer (Abschnitt 1.2.6) in einer 6 cm Petrischale und spülen Sie 3 mal Restblut zu entfernen.
- Übertragen Sie die Leber Abschnitt in ein neues 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml eiskaltem Hacken- Puffer. Mince die gut abgespült Leber Abschnitt mit einem Paar von feinen Schere, um die Zellen zu lösen. Der Stamm der Zellsuspension durch ein 40 & mgr; m Zellsieb alle Gewebe Klumpen zu entfernen.
- Legen Sie die Einzelzellsuspension auf Eis und verwenden für Dias innerhalb 1 Stunde zu machen. Überprüfen Sie die Konzentration der Zellen durch Zählen (beispielsweise mit einem Hämozytometer oder elektronischen Zellzähler) , um sicherzustellen , daß seine Konzentration etwa 2 x10 6 Zellen / ml.
3. Herstellung von Comet Slides
- Man mischt ein Volumen der Einzelzellsuspension mit 10 Volumen von geschmolzenem, 37 ° C, 0,5% niedrig schmelzenden Agarose-Lösung (siehe Abschnitt 1.2.1).Pipette sofort 100 ul auf einen Objektträger mit regelmäßigen Schmelzpunkt Agarose (Abschnitt 1.1) beschichtet. Ab sofort setzen Sie ein Deckglas über die Zelle-Agarose-Gemisch. Machen Sie mindestens 8 Folien für jede Probe.
HINWEIS: Alle Folien von einer Zahl oder einen ähnlichen Code und ihre Identität aufgezeichnet sollten identifiziert werden, so dass die Schieber in verblindet bewertet werden können (6.2.2 siehe weiter unten). - Legen Sie die Dias flach und kühl bis 4 ° C für 30 min.
- Nachdem das Gel erstarrt ist, vorsichtig die Deckgläser entfernen und die Folien in vorgekühlte Lysepuffer (Abschnitt 1.2.2) einzutauchen. Schützen Sie die Folien aus Licht und halten Sie die Folien in der Lyse-Puffer bei 4 ° C 1 Stunde (Minimum) bis O / N (Maximum).
4. Enzymbehandlung von Comet Slides
- Entfernen Sie 6 der 8 Dias aus jeder Gewebeprobe aus dem Lysepuffer und spülen sie mit Enzympuffer (Abschnitt 1.2.3) bei RT für 5 min je 3x. Verwenden Sie die verbleibenden zwei Folien für den alkalischen Comet-Assay whne Enzym-Behandlung (siehe 5.1, unten). Nach dem Spülen entfernen überschüssige Flüssigkeit durch Ablassen und die Folien mit Gewebe-Blotting.
- Verdünnte hOGG1 und Endo III Enzym Bestände mit Enzympuffer bei 1: 1000 (v / v). Auf Eis bis zum Gebrauch.
- Wenden Sie 200 ul der folgenden Lösungen zu den Folien aus jeder Behandlungsgruppe hergestellt: 200 ul Enzympuffer allein (2 Dias als Referenz Dias verwendet), 200 & mgr; l hOGG1 Lösung (2 Dias) oder 200 & mgr; l Endo III-Lösung (2 Dias).
- Legen Sie die Folien in Petrischalen mit angefeuchteten Papiertüchern ausgekleidet, decken Sie die Folien mit Parafilm, und bei 37 ° C für 45 min für Endo III-behandelt und Referenz Dias und 30 min für hOGG1 behandelten Dias.
- Nach der Inkubation spülen Sie die Folien mit destilliertem Wasser und weiterverarbeiten, wie in 5.2 beschrieben, weiter unten.
5. Abwickeln und Elektrophorese
- Für Dias nicht mit Enzymen behandelt, die Folien aus dem Lysepuffer entfernenablassen, die Folien und spülen Sie einmal mit kaltem Neutralisierungspuffer (Abschnitt 1.2.5) für 5 min Restreinigungsmittel und Salze zu entfernen.
- Die Objektträger aus den Schritten 4.5 und 5.1 zufällig in einer horizontalen Gelelektrophorese Tank, unter Vermeidung von Räumen. Füllen Sie den Tank mit frisch zubereiteten pH> 13-Elektrophorese-Puffer (Abschnitt 1.2.4), bis der Flüssigkeitspegel nur die Folien bedeckt (vermeiden Sie Blasen über die Agarose und stellen Sie sicher, dass der Tank-Ebene). Aufzeichnen der Puffer pH-Wert und Temperatur zu Beginn der DNA Abwickeln.
- Lassen Sie die Folien in der alkalischen Puffer bleiben für 20 min zum Abwickeln der DNA und die Expression von alkali haftet Schaden zu ermöglichen.
- Beim Abwickeln, Programm die Stromversorgung von 0,7 V / cm in der Elektrophorese-Tank (V / cm = Volts durch den Abstand in cm zwischen den positiven und negativen Elektroden geteilt) zu erzeugen.
- Nach dem Abwickeln, drücken Sie die Stromversorgung der Lauftaste. Passen Sie bei Bedarf den Strom auf 300 mA durch Anheben oder den Pufferpegel zu senken. Halten Sie the Puffer Ebene knapp über der Oberfläche der Folien. Führen Elektrophorese bei 4 ° C für 20 min. Nehmen Sie die Folie Platzierung, um die Temperatur des Puffers und der Strom (Ampere) zu Beginn und am Ende der Elektrophorese.
HINWEIS: Zu viel Puffer wird in niedrigere Spannungen führen, die mit DNA-Migration stören können. - Nach der Elektrophorese neutralisieren die überschüssige Alkali durch sanft die Dias aus dem Tank heben und in Neutralisationspuffer (Abschnitt 1.2.5) für 5 min eingetaucht wird. Lassen Sie die Folien und noch zweimal wiederholen.
- Befestigen Sie die Schieber nach 5 Minuten in kaltem 100% Ethanol eingetaucht wird. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen und in einem trockenen Raum für die Lagerung.
6. DNA-Färbung, Comet Visualisierung und Analyse
- DNA-Färbung
- Legen Sie die Folien auf einem Karton oder Metallschale und mit 200 & mgr; l von Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoff Arbeitslösung (siehe Abschnitt 1.2.7) zu jeder Folie und Deckel mit einem Deckglas. Schützen Sie die Folien ausLicht erlauben die Objektträger für mindestens 30 min vor scoring in Kontakt mit der Färbelösung zu bleiben. Beflecken die Folien in Chargen von 20 zu einem Zeitpunkt.
- Bevor jede Folie zu lesen, sanft abgetupft überschüssige Färbelösung, wobei darauf geachtet, nicht zu stören, das Deckglas entfernt.
- Comet Visualisierung und Scoring
- Verwenden Sie eine Videokamera an einem Fluoreszenzmikroskop angebracht Live-Bilder des Kometen Folie auf dem Computer-Monitor anzuzeigen.
- ein Mikroskopfeld enthaltenden Zellen in zufälliger Reihenfolge wählen. Mit Hilfe einer Maus, wählen Sie eine Zelle. Klicken Sie auf die Mitte des "Komet Kopf" mit der linken Maustaste der Maus.
HINWEIS: Die Computersoftware alle Messparameter für die Zelle berechnet und fügt die Daten in eine Datendatei. - Ergebnis alle Zellen im aktuellen Feld (siehe Schritt 6.2.4), und verwenden Sie dann die Bühne Kontrollen des Mikroskops und der Online-Video eine andere Gruppe von Zellen zu finden. Ergebnis dieser Zellen, wie in 6.2.2 beschrieben.
- Ergebnis der Schieber from rechts nach links und von unten nach oben. Wählen Sie rund 10 Felder zufällig. Während dieses Prozesses kann jeder geeignete Komet Zelle, die im Sichtfeld erscheint sollte ohne Vorspannung erzielt.
HINWEIS: Partitur kein Komet, wenn einer der folgenden Punkte zutrifft: 1) auf einem der Ränder des Schiebers angeordnet ist; 2) zwei oder mehr Kometen überlappen; 3) Es gibt Schmutz in den Schwanz; 4) die Software kann zwischen dem Kopf und der Schwanz nicht unterscheiden; oder 5) die Färbung des Kerns und / oder Schwanz unterscheidet sich stark von anderen Kometen auf der Folie.
HINWEIS: Kometen mit fast allen ihren DNA-Fluoreszenz in den Schwanz sind oft bezeichnet als "Igel" Kometen. Hedgehog Kometen sollten nicht gewertet werden, aber die Anzahl von Igeln während des Gleitens Scoring erkannt als Prozentsatz der gesamten Kometen aufgezeichnet und gemeldet werden. - Analysieren Sie mindestens 75 Kometen pro Folie, Lesen zwei Folien pro Organ / Gewebe mindestens 150 Komet Zellen / Probe insgesamt zu erhalten. Nach der erforderlichen Anzahl von Zellen, die aus einer Folie haben seinen hat, wird das Ergebnis als Tabellendatei für die spätere Datenanalyse gespeichert.
7. Histopathologie Analyse
- Nach mindestens 72 h Fixierung in 10% NBF, gefolgt von Gewebe 21 Trimmen, routinemäßig verarbeiten und bettet das linke seitliche Leberlappen der Proben in einem Paraffin-Wachs - Basis Medium 22. Abschnitt die Proben bei etwa 5 Mikron und sammeln sich auf Glasobjektträger.
- Beflecken die Sektionen mit Hematoxylin und Eosin (H & E):
- Erhitzen Sie die Folien mit den Paraffingewebeschnitten in einem 60 ° C Ofen für 2 Stunden vor dem Färbeverfahren.
- Verwenden Xylol, die Seiten zu Deparaffinisieren. Rehydrieren die Folien mit abgestuften Ethanol (EtOH) zu einem mit Leitungswasser gespült läuft.
- Legen Sie die Folien in 450 ml Hämatoxylin für 2 min und 40 sec. Rinse-Folien mit Säure (2 ml Eisessig auf 450 ml entionisiertem Wasser) für 4 Sekunden gefolgt von 5 min fließendem Leitungswasser abspülen.
- Platzieren Sie den geschobenes in 450 ml 70% EtOH mit 1 ml Ammoniumhydroxid für 2 min, gefolgt von Leitungswasser spülen für 2 Minuten und 30 Sekunden ausgeführt wird, und 70% EtOH Spülung für 1 min.
- Inkubieren Sie die Objektträger mit 450 ml Eosin Y Lösung 4 ml Eisessig 3 min enthält.
- Entwässern Sie die Folien mit abgestuften EtOH. Deaktivieren Sie die Folien mit Xylol (dreimal je 1 min), und halten Sie gleitet in Xylol bis Abdeckung rutscht auf den Schlitten gelegt werden.
- Untersuchen Sie die Folien durch Lichtmikroskopie, Rekord Befunde und Klasse nicht-neoplastischen Läsionen für die Schwere als 1 (minimal), 2 (mild), 3 (moderat) oder 4 (markiert).
HINWEIS: Der Schweregrad für eine bestimmte Läsion angewendet wird, basierend auf den relativen Anteil der Leber mit der Läsion (minimal = <1-15%; mild = 16-35%; mäßig = 36-60% und markiert = 61- 100%).
8. Datenanalyse
- Das Tier wird die Versuchseinheit für statistische Auswertungen berücksichtigt. DNA-Schäden als% DN ausgedrücktEin in Schwanz.
- Oxidative DNA-Schäden wird wie folgt berechnet: die Referenz Dias (kein Enzymbehandlung), geben eine Schätzung der Hintergrund DNA-Strangbrüche (SB).
HINWEIS: Die enzymbehandelte Folien bieten ein gewisses Maß an Strangbrüchen und oxidierte Basen (SB + OX). Eine lineare Dosis - Antwort für% DNA in tail als Funktion der DNA - Schädigung, Subtraktion von SB aus SB + OX gibt eine Schätzung der DNA - Strangbrüche von oxidiertem Pyrimidine / verändert Purine 23 annimmt. - Analyse% DNA in tail als Funktion der Dosis von Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnett-Test für paarweise Vergleiche der Reaktionen bei den behandelten Tieren zur Fahrzeugsteuerung.
HINWEIS: Alle Tests werden one-tailed und einen p-Wert von weniger als 0,05 wird als Kriterium für statistische Signifikanz gesetzt.
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Representative Results
Die in vivo alkalischen Komet - Test wurde in Verbindung mit dem enzymmodifizierten Comet - Assay durchgeführt , sowohl direkt als auch oxidative DNA - Schädigung in der Leber von Ratten , die mit Cyproteronacetat (CPA) 5 behandelt , zu messen. CPA ist ein synthetisches hormonelle Medikament , das Lebertumoren bei männlichen Ratten zu induzieren benötigt höhere Dosen induziert im Vergleich zu Frauen 24 Rattenlebertumoren in einer geschlechtsspezifische Art und Weise, mit fünffach. Wir fanden, dass die direkte durch CPA erzeugten DNA-Schädigung in der Leber von männlichen und weiblichen Ratten die gleiche geschlechtsspezifische Muster als hepatotumorigenicity aufweist: eine fünffach höhere Dosis von CPA wird benötigt, um eine signifikante Erhöhung der DNA-Schädigung in der zu induzieren Lebern von Männern im Vergleich zu Frauen (Abbildung 1).
Wir vermuten, dass die geschlechtsspezifische Comet-Assay Ergebnis der Aktivität von hydroxysteroid sulfotransferase zurückzuführen ist (s) (HST), die 15-fach höherbei erwachsenen weiblichen Ratten als bei erwachsenen Männern. HST Stoffwechsel ist ein geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in der Aktivierung von CPA an DNA-bindenden Metabolit (en) 25. Im Gegensatz dazu CPA-induziert oxidative DNA - Schädigung in der Regel größer als weibliche männlichen Rattenlebern und daher weniger wahrscheinlich eine geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in der Tumorbildung (Figur 2) sein. Histopathologie Auswertung von Lebern von CPA-behandelten Ratten zeigten keine Anzeichen von Mittel-induzierte Apoptose oder Nekrose (Tabellen 1 und 2), was darauf hinweist , dass die positiven Comet - Assay Ergebnisse waren nicht ein sekundärer Effekt der Zytotoxizität 5. Die Figuren 1 und 2 und den Tabellen 1 und 2 werden mit Genehmigung von Elsevier BV (Referenz 5) neu aufgelegt.
Figur 1. DNA - Schädigung in Lebern von CPA-behandelten männlichen und weiblichen Ratten measured mit der in - vivo - alkalischen Comet - Assay. Gruppen von fünf sieben Wochen alten männlichen und weiblichen F344 - Ratten wurden mit Olivenöl behandelt oder mit 10, 25, 50 oder 100 mg / kg / Tag CPA in Olivenöl. Die Behandlungen wurden bei 0, 24 durchgeführt und 45 Stunden wurden die Ratten nach 48 h getötet, und die DNA-Schädigung wurde in Leber als% Schwanz-DNA unter Verwendung des alkalischen Komet-Test gemessen. CPA-Behandlung eine Zunahme in% Schwanz-DNA in der Leber von männlichen Ratten in einer Schwellenartig mit signifikanter Anstieg induziert nur die 50 und 100 mg / kg / Tag-Dosen festgestellt werden. CPA-Behandlung DNA-Strangbrüche induziert in der Leber von weiblichen Ratten in einer nahezu linearen Dosis-abhängige Weise mit signifikanter Anstieg in DNA% tail in allen CPA-Gruppen nachgewiesen. Die niedrigsten Beobachtete Genotoxizität Effect Levels (LOGELs) für CPA-induzierte DNA-Schäden in der Leber von weiblichen und männlichen Ratten wurden schätzungsweise 10 und 50 mg / kg / Tag sein, respectively. * P ≤ 0,05 bei relativ zum Fahrzeug con Significanttrol; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Oxidative DNA - Schäden in Lebern von CPA-behandelten männlichen und weiblichen Ratten gemessen mit dem enzymmodifizierten in vivo alkalischen Komet - Test. Gruppen von fünf von sieben Wochen alten männlichen und weiblichen F344 - Ratten wurden mit Olivenöl behandelt oder mit 10, 25, 50 oder 100 mg / kg / Tag CPA in Olivenöl. Die Behandlungen wurden bei 0, 24 durchgeführt und 45 h wurden die Tiere nach 48 Stunden getötet und die enzymmodifizierten Comet-Assay wurde unter Verwendung von tail% DNA als Metrik von DNA-Schäden durchgeführt. Alle Dosen CPA signifikante Anstiege in Endo III empfindlichen DNA-Schädigung in der Leber von CPA-behandelten männlichen Ratten erzeugt; während Endo III-empfindliche DNA dAmage wurde mit 25 nur bei weiblichen Ratten behandelt nachgewiesen, 50 und 100 mg / kg / Tag CPA (A). Alle CPA Dosen führte zu einer signifikanten Erhöhung der hOGG1 empfindlichen oxidative DNA-Schäden in der Leber von männlichen Ratten; Erhöhungen in hOGG1 empfindlichen DNA - Schäden wurden nur bei weiblichen Ratten , die mit 50 und 100 mg / kg / Tag CPA (B) behandelte detektiert. * P ≤ 0,05 bei relativ zur Fahrzeugsteuerung signifikant; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Tabellen 1 & 2. Histopathologie Analyseergebnisse. Da Zytotoxizität falsch-positiven Comet - Assay Ergebnisse erzeugen kann, histopathologische Beurteilung für apoptotischen und / oder nekrotischen Zellen sollten für kometen positive Gewebe durchgeführt werden. In der aktuellen Studie, keine CPA-induzierte Hepatozyten Apoptose oder Nekrose beobachtetin Lebern von männlichen und weiblichen Ratten, die die Möglichkeit eines falsch positiven Comet-Assay Reaktion ausgeschlossen.
| Verletzung | Daten | Dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatozyten zytoplasmatische Vakuolisierung | Lesion Graf | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # Suchte | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lesion% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| Avg Severity | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| Hepatozyten Mitose | Lesion Graf | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # Suchte | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lesion% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| Avg Severity | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Tabelle 1 Auftreten von nicht-neoplastischen Läsionen in Lebern von fahrzeug- und CPA-behandelten männlichen F344 Ratten.
| Verletzung | Daten | Dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatozyten zytoplasmatische Vakuolisierung | Lesion Graf | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # Suchte | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesion% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| Avg Severity | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| Hepatozyten Mitose | Lesion Graf | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # Suchte | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesion% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| Avg Severity | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| Hepatozyten Karyomegalie | Lesion Graf | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # Suchte | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesion% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| Avg Severity | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Tabelle 2. Die Häufigkeit von nicht-neoplastischen Läsionen in der Leber von fahrzeug- und CPA-behandelten weiblichen F344 - Ratten.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Messung der direkten und oxidative DNA-Schäden in der Rattenleber auf Einzelzellebene. Das allgemeine Protokoll ist anwendbar auf jedes Gewebe , aus dem einzelne Zellen oder Zellkerne können mit minimalen Verarbeitungs induzierte DNA - Schädigung (dh DNA - Schädigung induziert nicht durch das Testmittel, sondern durch die Handhabung und Verarbeitung der tierischen Geweben) isoliert werden. In unserer Forschung haben wir alkalischen Comet-Assay auf Zellen aus dem Knochenmark durchgeführt 7,9, Magen 6, Niere 9, Blase 9, Lunge 9, Herz 10, Brustdrüse 5, Uterus 5, Hoden 5 und Blut 5. Diese Assays können bieten eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode zur Untersuchung von Xenobiotika-induzierte DNA-Schädigung in mehreren Organen und Geweben der Versuchstiere. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für Humanbiomonitoring Studien durch Durchführung Assays, zum Beispiel, auf dem peripheren Blut, exfoliert werden verwendet,Zellen der Harnwege oder die Mund- oder Nasen Epithelien von klinisch oder beruflich strahlenexponierten Personen gewonnen. Der Grundansatz kann auch zur Auswertung DNA - Schäden in gezüchteten Zellen in vitro verwendet werden.
Wenn der Comet - Assay in akute oder subchronische toxikologische Studien integriert, die Probenahmezeit, dh die Zeit zwischen der letzten Behandlung und der Gewebesammlung, eine kritische Variable , die manchmal mit der Sammlung von anderen toxikologischen Daten in Einklang gebracht werden müssen. Wenn möglich, sollten Probenahmezeiten auf Zeitverlauf Komet Daten basieren, dem Zeitpunkt , an dem der Spitzen Plasma oder Gewebekonzentration (Cmax) erreicht wird, oder nach dem stationären Zustand erreicht wird , nach mehreren Verwaltungen des Testartikels 19. In Fällen wurden sind kinetische Daten oder Gewebekonzentrationen nicht verfügbar, OECD TG489 Durchführung von zwei oder mehr Behandlungen und Sammeln von Geweben 2-6 Stunden nach der letzten Behandlung empfiehlt, oder, wenn eine einzige Behandlung istdurchgeführt, 19 Gewebe an beiden 2-6 und 16-26 Stunden nach der Behandlung zu probieren.
Es ist entscheidend, dass die Länge der Zeit von Euthanasie zum Kometen Dia Vorbereitung so kurz wie möglich sein. Es ist ratsam, dass experimentelle Kompetenz durch Kenntnisse demonstrieren hochwertige Suspensionen einzelne Zelle aus dem Gewebe zu erhalten schnell festgestellt werden, die getestet werden. Im Allgemeinen sollten Komet Dias so bald wie möglich nach dem Tieropfer vorbereitet werden, mit Einzelzellpräparation maximal eine Stunde nehmen. Einrichtung einer historischen Datenbank Bereiche und Verteilungen von negativ (Fahrzeug) Kontrollen zu etablieren wird dringend empfohlen, um sicherzustellen, dass der Test unter geeigneten Kontrolle ist. Zu hohe Mengen an DNA-Schäden kann in Fahrzeug / negativer Kontrolltiere beobachtet werden, wenn die folgenden Voraussetzungen erfüllt sind: 1) unsachgemäße Behandlung des Gewebes; 2) eine zu lange Zeit zwischen Euthanasie und Kometen Dia Vorbereitung; oder 3) Exposition der Einzelzellsuspension zu UV-mit deg Licht. Einrichtung einer historischen Datenbank für die Bereiche und Verteilungen von positiven Kontrollen auch sehr zu empfehlen, um sicherzustellen, dass der Test geeignete Empfindlichkeit bekannten Genotoxinen anzeigt. Methylmethansulfonat (MMS) wurde als positive Kontrolle in der vorliegenden Studie verwendet; Ethylmethansulfonat (EMS) wird durch JaCVAM als positive Kontrolle für die in - vivo - Comet - Assay 18 empfohlen.
Die Einbeziehung Aufschlüsse mit Läsion spezifischen Endonukleasen in den Comet-Assay-Protokoll erhöht die Sensitivität und Spezifität des Assays durch die Anerkennung von bestimmten Arten von DNA-Läsionen in dem hier vorgestellten Beispiel oxidierter DNA-Basen. Es sollte jedoch erkannt werden, dass einige Endonukleasen zu erkennen und spalten bei verschiedenen Klassen von DNA-Läsionen fähig sein können; im Fall von Endo III umfasst dies Läsionen nicht oxidative DNA-Schädigung verbunden sind. Eine positive Endo III-modifizierten Comet-Assay Ergebnis kann ein gemischtes MOA anzuzeigen. By Vergleich ist hOGG1 spezifischer für oxidative Schädigungen und Daten von einem hOOG1-modifizierten Assay sein kann nützlicher für eine Feststellung , dass MOA oxidative DNA - Schädigung 11 beinhaltet.
Zytotoxizität (Zell-Apoptose und Nekrose) in DNA-Strangbrüchen führen und ein falsch-positives Comet-Assay Ergebnis: positiv Comet-Assay Ergebnisse selbst nicht als Genotoxizität interpretiert werden. Informationen auf Zytotoxizität erforderlich, um die biologische Relevanz eines positiven Comet-Assay Ergebnis zu etablieren. Die histopathologische Analyse des Kometen-positive Gewebe wird von der OECD TG489 als relevantes Maß für Gewebetoxizität 19 empfohlen. Positive Comet-Assay-Daten mit klaren Beweis von Gewebetoxizität (Zell-Apoptose oder Nekrose) sollten mit Vorsicht interpretiert werden.
Die in - vivo - alkalischen Comet - Assay und die Endo III- und hOGG1-modifizierten alkalischen Komet - Assays können in einer quantitativen Art und Weise verwendet werden , um Entscheidungen zu treffen über die Genotoxizität vonxenobiotic Belichtungen. Sie können auch in mehreren Tiergeweben zu führen Grundlagenforschung in DNA-Schädigung und Reparatur verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
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