Summary
DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.
Introduction
CRISPR ile hedeflenen DNA değişiklikleri oluşturmak için yeteneği / Cas9 işlevsel genomik çalışmalar için büyük bir potansiyele sahiptir. CRISPR / Cas9 sisteminin iki bileşeni vardır; Staphylococcus pyogenes ve hedefli DNA ekibi (s, 1) Cas9 yönlendiren bir yaklaşık 100 nt kılavuz RNA (gRNA) molekülünden türetilen Cas9 nükleaz. Hedef tanıma, ilk olarak haiz ~ hedefleme vektörleri 2,3 yüksek kapasiteli bir üretim sağlayan gRNA, 20-nt. Tasarlanmış olabilir Çoğu organizmalar, zaten CRISPR / Cas9 teknolojisi 4,5 ile olmuştur.
Bitkiler, CaMV 35S promotörü gibi yapısal promotörler, in, genel olarak Cas9 nükleaz 6 ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. gRNAs gRNA ilk taban kısıtlayan RNA polimeraz III U6 ya da U3 promoterler kullanılarak ifade edilir ya G, verimli bir transkripsiyon için U3 U6 veya A için. Ancak RNA polimeraz II baloBu kısıtlamaların ücretsiz oters, aynı zamanda 7,8 kullanılmıştır.
Farklı gRNAs farklı verimlilik ile DNA mutasyonlarının neden, ve bu yüzden ilk olarak tüm fabrika dönüşümleri yatırım veya kapsamlı fenotipik ekranlar kurmadan önce CRISPR vektörleri doğrulamak için önemli olabilir. CRISPR geçici ifadesi zordur mutasyonlar ve bu yaklaşımlar ile pratik fenotipik deneylerinin algılama hale stabil bitkilerde 6 ile karşılaştırıldığında, genel olarak, DNA modifikasyon daha düşük bir frekans ile sonuçlanır örneğin agroinfiltration kullanarak, bitkilerde oluşturur. Sözde saçak kökler stabil bitkiler için ay karşı bağımsız kararlı bir şekilde transforme edilmiş bir malzeme çok sayıda hafta içinde oluşturulabilir çünkü uygun, alternatif sistem vardır. CRISPR vektörleri saçak kök 9,10 DNA mutasyonlarının uyaran çok etkilidir.
DNA montaj yöntemleri etkin bir şekilde overl içeren DNA parçalarını birbirine bağlamakapping 11 sona erer. Bazı DNA düzeneği yöntemlerinin önemli bir avantajı birleştirilmiş ürünler haline ssDNA (yani, oligolar) dahil yeteneğidir. gRNAs yalnızca ~ 20 nt uzunluğunda ve yeni hedefler sentezlenen oligo yapılabilir için, bu DNA montaj yöntemleri CRISPR klonlama için de uygundur. Burada anlatılan protokollerin başarılı soya 10, kavak 12 kullanılan ve şu anda domates edilmiş CRISPR vektörlerinin P201 serisi dayanmaktadır. Sunulan klonlama işlemi geçerli klonlama yöntemiyle 10 üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor. Yani, tam fonksiyonel vektörler tek bir gün içinde tek bir klonlama reaksiyonda oluşturulabilir. Vektör yapımı daha da eller üzerinde zaman ve malzeme maliyetleri azaltarak, paralel olarak birden fazla CRISPR vektörleri oluşturmak için toplanmış olabilir. Ayrıca hedef gen delesyonlu transjenik malzemeler üretmek için etkili bir yöntem olarak, domates saçak kök oluşumu için bir protokol mevcut. Saçak kök geçerlidir için kullanılırCRISPR vektörleri yedik ve daha sonraki deneyler için malzeme sağlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kılavuzu RNA Tasarım ve Vektör İnşaat
- ilgi genleri hedef sekansları tanımlamak. Bu adımda 13,14 için uygun çevrimiçi CRISPR hedef bulma çeşitli programlar vardır.
NOT: Burada GN 20 GG hedef motifi kullanmak, ancak diğer tasarımlar kullanılan uygulama veya vektör sistemine bağlı olarak uygun olabilir. - Tasarım 60-mer gRNA oligo DNA montaj için gerekli olan 5 ile çevrili hedef motifleri 've 3' 20 nt dizileri GN 19 bölümünü kapsayacak şekilde. Son 60-mer motifi: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
NOT: Standart desalted primerler iyi çalışır. - Montaj için, dört DNA (Şekil 1) hazırlayın. DNA dizileri için ek dosyasına bakın.
- 2 saat boyunca 37 ° C'de 1x Tampon 4 kısıtlama enzimi Spe I ile Cas9 10 plazmid: p201N 5 ug - 1 Digest. Bir özet Sütun arındırmaküreticinin talimatlarına şeklinizi ona göre. ~ 10 mM Tris-HCI 15 ul içinde süspanse ve UV spektrofotometre ile miktarı belirlenir.
- İkinci 2 saat boyunca 25 ° C'de 1x Tampon 3.1 kısıtlama enzimi Swa I ile sindirmek, bir gerçekleştirin. tam sindirim onaylamak için% 0.8 agaroz jel üzerinde ng 200 - 100 kontrol edin.
NOT: Bir doğru sindirilmiş plazmid 14313 bp tek bir grup var olacaktır. Not: enzim ve defosforilasyon ısı inaktivasyonu gerekli değildir. Sindirilen plazmid, -20 ° C'de saklanabilir. - PCR primerleri Swa I_MtU6F / MtU6R sırasıyla ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR kullanılarak pUC gRNA Shuttle 10 plazmidden Medicago truncatula (M +), U6 promoteri ve iskele DNA'lar yükseltmek. PCR, aşağıdaki koşullar ile yüksek aslına polimeraz kullanarak: 3 dakika için 95 ° C; 31 döngü (20 saniye 98 ° C, 15 sn için 60 ° C, 30 saniye için 72 ° C); ve 5 dakika için 72 ° C.
- PCR pr ~ 3 ul alikotları görselleştirmekbir% 1 agaroz jeli üzerinde oducts amplifikasyon teyit etmek için. MtU6 amplikon 377 bp ve iskele amplikon 106 bp. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, kalan PCR ürünleri Kolon saflaştırmak -20 ° C'de UV spektrofotometrisi ve mağaza tarafından tayin edin.
- laboratuvar dereceli su içinde 100 uM gRNA oligos tüm tüp tekrar süspansiyon. 1x Tampon 2.1 500 ul 100 uM oligo 1 ul ekle. İyice karıştırın. Birden fazla oligos havuzu varsa, 1x Tampon 2.1 tüpüne her 100 uM oligo 1 ul ekleyin. Seyreltilmiş oligo -20 ° C'de saklanabilir.
- ısıtılmış kapak ile, 50 ° C de tutmak için bir termal döngü Program. bir hacme lineer vektör seyreltilmiş gRNA oligo (ler) ve su MtU6 promoteri skafoldun, 12 ng (0.2 pmol), 1 ul (0.2 umol) bir 50 ng (0.2 umol) 100 ng (0.011 umol) birleştirin 5 ul. 2x yüksek sadakat DNA montaj ustası karışımı 5 ul ekleyin iyice karıştırın ve aşağı doğru döndürün. 60 dakika boyunca reaksiyon inkübe50 ° C termal döngü. Daha sonra buz üzerinde reaksiyon yerleştirin.
Not: Reaksiyon hacimleri düşük DNA verimi karşılamak için artırılabilir. - Yeterli E. halinde reaksiyon 2 ul Transform 50 mg L -1 kanamisin (Kan 50) ile takviye LB standart teknikler ve plaka kullanılarak coli hücreleri. gece boyunca 37 ° C'de kaplanmıştır hücreleri büyütün. -20 ° C'de, kalan DNA düzeneği reaksiyonu kaydedin.
- primerler StUbi3P218R ve ISceIR kullanılarak PCR ile koloni ekranı. su ile 1 Kalan DNA düzeneği reaksiyonunun bir kısım seyreltilir: 5'tir. no-insert kontrol olarak Cas9 plazmid: pozitif koloni ekranı için kontrol ve dairesel p201N 1 ng olarak 1 ul kullanın.
- PCR, aşağıdaki koşullar ile amplifiye; 3 dakika boyunca 95 ° C; 31 döngü (30 saniye için 95 ° C, 30 sn için 58 ° C, 30 saniye için 72 ° C); ve 5 dakika için 72 ° C 'de. bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünleri görselleştirme. Doğru girmeler 725 bp ve vektörler zekâ bir grup olduğundan emin olun(örneğin, kesilmemiş vektör) hout ekler bir 310-bp şeridini sahip olacaktır.
- 37 ° C'de 50 sıvı kültürler, gece boyunca LB Kan pozitif koloniler büyümek ve üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler saflaştırılması. Sanger sekansı StUbi3P218R astar ile plazmidler ve hata klonlama esnasında katılan emin olmak için MtU6 promotörü, hedef, ve iskele dizilerine kromatogramlar hizalayın.
- Bir teşhis Eco RV ve Sty I ile plazmid ~ 1 mikrogram sindirerek sindirmek gerçekleştirin % 0.8 agaroz jeli üzerinde görselleştirme. (Bp olarak) parçalarıdır: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, ve 174.
- Birden fazla gRNAs ile vektörleri oluşturmak için DNA donanımını kullanın.
- İki gRNA kasetler ile bir vektör yapılandırmak için, PCR, ilgili her birinden 1 ng primer UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR olan primerler Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR ve ikinci pozisyonlar gRNA ile birinci pozisyon gRNA amplifiye1.8 - plazmidler adımlarla 1.1 inşa edilmiştir. Aşama 1.3.3 PCR koşulları kullanarak. amplifikasyon teyit etmek için bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünlerinin ~ 3 ul alikotları görselleştirmek. Amplıkonlar ~ 500 bp.
- Birleştirin ve 200 ul bir tüp içinde un saflaştırılmış PCR ürünleri, yaklaşık olarak eşit miktarda karışımı (tipik olarak 3 - her 4 ul). Montaj için, PCR ürünleri kombine 1 ul, Swa I 50 ng ekleyebilir ve Spe I p201N linearize: Cas9, laboratuvar dereceli su 2.5 ul ve 2x yüksek kalitede DNA montaj ustası karışımı 2.5 ul. 15 dakika boyunca 50 ° C termal döngüleyici içinde inkübe edin.
Not: DNA montaj kılavuzları 2 için 15 dakika inkübasyon önerir - 3 fragmanları. - Yeterli E. içine 2 ul 1 - Dönüşümü LB Kan 50 koli hücreleri ve plaka. gece boyunca 37 ° C 'de, tabakalanmış hücrelere büyütün. -20 ° C'de, kalan reaksiyon kaydedin.
- Aşama 1.6 ile aynı koşullarda primerler StUbi3P218R ve ISceIR PCR ile koloni ekranı. doğru cLones 1200 bp amplikon sahip olacaktır. LB Kan olumlu koloniler 50 sıvı kültürleri bir gecede büyümek ve plazmidler arındırmak.
- primerler StUbi3P218R ile Sanger dizisi plazmidler (ilk pozisyon gRNA kapsar) ve p201R (ikinci pozisyon gRNA kapsar). MtU6 promotörü, hedef, ve iskele dizilerine kromatogramlar hizalayın. Teşhis Eco RV ile sindirmek ve Sty I (bp olarak) aşağıdaki parçaları neden olur: 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Koyu renk fragman ikinci gRNA içerir.
- Agrobacterium suşu ARqua1 15 rhizogenes içine tüm kalite kontrol beklentilerinin karşılanması sonrasında, plazmid dönüşümü. ayarları ile 1 mm küvet içinde elektro uyumlu hücre ile elektroporasyona 50 ul plazma preparatı 1 ul ekleyin: 2.4 kV, 25 | iF ve 200 w. SOC ~ 500 ul hücre yeniden elde etmek ve 2 saat boyunca 28 ° C'de çalkalanır. LB Kan 50 ve g Plaka2 gün boyunca 28 ° C 'de sıra. 1.3.3 ile aynı primerler ve PCR koşulları kullanılarak koloni ekranını gerçekleştirin. Pozitif klonlardan gliserol stokları sağlayın.
2. Tüylü Kök Dönüşüm
- sabit karıştırma ile 15 dakika boyunca% 20 ev tipi ağartıcı içinde domates tohumu sterilize edin. bir laminar akış başlığı içinde, çamaşır suyu kaldırmak ve steril laboratuar dereceli suda 3 kez yıkayın.
- ½ MS ortamı (2.22 g L-1, MS tuzları + Gamborg vitaminleri, 10 g L-1 sukroz, 3 g L-1 gellan zamkı, pH 5.8) ihtiva eden bir GA-7 kutu içinde levha 30 tohumları. Karanlıkta 2 ~ için gün çimlenme, daha sonra ışığa GA-7 kutularını taşıyın. ışığında ~ 4 gün daha fidan büyür.
- Dönüşüm gün önce, çizgi dışarı A. Katı LB Kan 50 kültürleri rhizogenes ve gece boyunca 28 ° C'de büyür.
- dönüşümün Günü, laminer akış kaputu steril malzemeler monte: 12 ml kültür tüpleri, 50 ml konik tüp, ½ MS sıvı (yok gellan gum), 200 uM asetosiringon, filtre kağıdı, petri, forseps ve neşter, pipetler ve pipet uçları. ½ MS 50 ml asetosiringon 25 ul ilave edin ve her kültür tüpü içine ~ 6 mL dökün.
- A. kazımak için bir bükülmüş 200 ul ucu kullanın ½ MS sıvının 6 ml plaka ve tekrar süspansiyon ile ilgili rhizogenes hücreleri. Vortex tüpü tamamen hücreleri tekrar süspansiyon. Her bir vektör hücrelerin tekrar asılı tutulmasından sonra, 600 nM'lik bir sabit dalga uzunluğunda hücre 1 ml optik yoğunluk (OD) ölçün. OD 0.2 ve 0.4 arasında olmasını sağlayın; sulandırmak veya gerektiği gibi daha fazla hücre ekleyin. Her bir yapı için tekrarlayın.
- steril bir filtre kağıdı ile bir Petri kabı ½ MS sıvı ~ 2 ml ekleyin. nemlendirilmiş filtre kağıdı üzerinde fide ve yerden tüketim kotiledon. Bir kez tüm kotiledon toplanmıştır, iki kesim uçları ile kotiledon parçaları sonuçlanan kotiledon kapalı distal ~ 1 cm kesti. A. eksplantlar ekle rhizogenes çözeltiler, karıştırın ve 20 dakika boyunca inkübeara sıra invertli.
Not: yapı için yaklaşık 12 eksplant rutin kullanılan, çok sayıda 80 eksplantlar A. 6 ml aşılanmış olsa rhizogenes çözüm. - A. sırasında rhizogenes inkübasyon, Petri için filtre kağıdı eklemek, bir başına yapı dönüştürdü. Ayrıca kuru laminer akış kaputu, ½ MS katı ortam, hiçbir antibiyotik ayarlayın.
- A. dışarı kotiledon Scoop Kuru filtre kağıdı üzerinde steril forseps ve yer ile rhizogenes çözüm. Bir sonraki dönüşüm ilerlerken kurumasına yok dokuları sağlamak için Petri kapakla kapatın. Filtre kağıdı ve transferi, alt yüzey tarafında yukarı, üzerinde Blot kotiledon MS ortamı ½. ameliyat bandı ile plakaları sarın 2 gün oda sıcaklığında karanlıkta CO-geliştirin.
- Kadar ko-kültivasyonu, transfer kotiledonlar, alt yüzey tarafında sonra, MS ortamı (300 mg L-1 tikarsilin / klavulanik asit Tim 300 takviye ½ artık kısmından gelişmesini önlemek içinual A. rhizogenes) ve bitki seçimi için Kan 50 () ve cerrahi bant ile sarın. 16 saat fotoperiyodun oda sıcaklığında floresan ışıkları altında kültürleri korumak.
- Uzunluğu 2 hafta kökleri en az 2 cm, steril forseps ve bir neşter kullanarak kotiledonlar kesilmiş ve MS Kan 50 Tim 300 ortamı ½ aktarılır - ~ 1.5 sonra. Tek bir plaka 10 ila 15 kökleri aktarın. Bir işaretleyici ile kök uçları konumunu işaretlemek cerrahi bant ile sarın ve kültür odasında korumak.
- Bir hafta sonra, dönüştürülmüş kök seçici ortam üzerinde büyüme görülür. Tercih DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılarak DNA ekstraksiyonu için dönüştürülmüş köklerinin altörneğini hasat. Not: kotiledon ile Tabaklar 2 saklanabilir - kökleri karışık karmaşa içine büyümeye işaret ve izole etmek zordur, bundan sonra 3 haftalık hasat. Sigara hasat kök dokuları süresiz muhafaza edilebilir. birçok analiz izole edilmiş bir DNA örneği üzerinde gerçekleştirilebilirs DNA mutasyon sıklığı ve türünü belirlemek için. Birkaç tür deneylerde elde edilen sonuçlar aşağıda tarif edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA, montaj ile CRISPR vektör oluşturulması, tipik olarak, bağımsız klondan On ila yüzlerce oluşturur. PCR ile koloni taraması kolayca doğru klonlar tanımlar ve ve sorun giderme için kullanışlıdır ekler (Şekil 2A) olmadan plazmidler ayırt edebilirsiniz. Tipik olarak, klonların hepsi bir ek içeren ve bir kullanıcı tamamen koloni tarama adımlarını atlamak için tercih edebilir. Teşhis dijestleri (Şekil 2B) ve Sanger dizileme kalite kontrolü için kullanılır. Hataları ortaya ne zaman, genellikle, üst üste DNA bölgelerinde gözlenir, yani 5 'MtU6 promotör sonu, gRNA veya 3' iskele dizisinin sonu. Birden gRNA oligo tek bir reaksiyon olarak bir araya getirilmiş ise, gRNAs Sanger dizileme ile tespit edilir. Bireysel gRNAs eklenmesi eşit bir şekilde dağıtılır ve gRNAs en (Şekil 2C, bir tek dönüştürme izole edilebilir (Şekil 2C) 'dir.
Domates saçak kökler genelde dönüşüm (Şekil 3A) sonra, iki hafta içinde bir tane gözlenir. Uzunluğu kökleri ≥2 cm kesilir ve seçici ortam ve kanamisine dirençli kökleri bir hafta sonra (Şekil 3B) tespit edilebilir aktarılır. Çoğu kökleri seçici medya ve değişken olabilir dönüştürülmüş kökleri, kök büyümesi üzerine bir dereceye kadar artacak; Mümkünse, analiz için en güçlü büyüyen kökleri seçin. İki kanamisin dirençli köklerine biri tipik aşılanmış kotiledon başına geri kazanılır. Düzenli transferleri ile dönüştürülmüş kökleri seçici ortam üzerinde süresiz muhafaza edilebilir.
DNA, kanamisine dirençli köklerinden ekstre edilir ve PCR Amplif için kullanılany hedef bölge (ler). PCR ürünleri, klonlanması ve sekanslanması (Şekil 3C), sınırlı parça uzunluk polimorfizm analizi, poliakrilamid jel elektroforezi 16 (Şekil 3D), T7E1 endonükleaz 16 ya da yüksek verimli bir amplikon sıralama gibi mutasyon verimi belirlemek için bir çok analizde kullanılabilir 10. Seçilen gRNA / hedef dizinin bağlı, diğer CRISPR bitki sistemlerinde 6 bildirildiği gibi, mutasyonlar ve mutasyon verimliliği bir dizi görülebilir.
. CRISPR Meclisi Şekil 1. İlke DNA montaj tepki olarak, dört DNA'lar karıştırılır; p201N: Swa I ve Spe I (siyah daire), MtU6 organizatörü (yeşil ok), İskele (sarı çubuk) ve GN 19 hedef dizisini içeren 60-mer gRNA oligo (b Cas9 doğrusallaştırılmışlue bar). Her bir DNA molekülünün ucu bitişik parçası ile 20 bp örtüşmektedir. DNA montaj reaksiyonu tek bir dairesel molekülün içine bu DNA'lar birleşir. bağlayıcı siteleri StUbi3p218R ve ISceIR astar siyah oklarla gösterilmiştir, 2x35S: Cas9 kaset, mor StUbi3: nptll kaset turuncu ve sol ve sağ sınırları gri çubuklarla gösterilir. Not: Vector. Harita ölçekli değildir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Koloni Tarama ve DNA montaj ve dönüşüm 20 klonların plazmid Kalite Kontrolü. A) Koloni taraması. M, 100-bp merdiven; + P201N: Cas9: GFPT2 pozitif kontrol; NI, p201N: Cas9 no-insert kontrolü; GA, seyreltilmiş DNA tertibatı, reaksiyon; NT, hiçbir şablon kontrolü. B) Dört p201N Temsilcisi özeti: Cas9: kısıtlama gRNA vektörleri Eko RV ve Sty I. enzimleri M, 2-log merdiven. C) standart ve yüksek kalitede DNA montaj karışımları ve 11 gRNA oligos tek bir reaksiyona araya toplanmış kurtarılan vektörlerin dağıtım sadakat karşılaştırılması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Tüylü Kök Kültürleri ve DNA Modifikasyon tespiti. A) Tüylü kökleri 11 gün sonra dönüşüm. B kotiledon çıkan görülebilir) Kökler yaklaşık bir hafta boyunca ½ MS Kan 50 medya üzerinde seçilir. Gri çubuklar klonlama Örneği) kaplama. C anda kök uçları konumunu göstermek vesıralama dört farklı kıllı kök olayları iki farklı gen hedefleri olan DNA mutasyonlarının belirlenmesi. Gri kutusu Δ mutasyon tipini ve DNA mutasyonlarının belirlemek için gösterilen mutasyon d.) Poliakrilamid jeli elektroforezi örneği ile klon numarasını gösterir, GN 20 GG hedef sekans anlamına gelmektedir. Geniş silme ve hetero grupları hedef dizilerinin DNA mutasyonlarının mevcudiyetini göstermektedir. 12 bağımsız olaylar Altı mutantlar (ö) olarak skorlanmıştır. WT, vahşi tipli kontrol; NT, no-şablon kontrolü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-1025642 (GBM) tarafından desteklenmiştir. Biz ARqua1 gerginlik sağlamak için Maria Harrison teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
