Summary
عن طريق تجميع الحمض النووي، وناقلات كريسبر متعددة يمكن بناؤها بالتوازي في رد فعل الاستنساخ واحد، مما يجعل بناء أعداد كبيرة من كريسبر ناقلات مهمة بسيطة. الطماطم جذور شعر هي نظام نموذجا ممتازا للتحقق من صحة ناقلات كريسبر وتوليد مواد متحولة.
Introduction
القدرة على توليد التعديلات الحمض النووي المستهدفة مع كريسبر / Cas9 لديها امكانات كبيرة لدراسات الجينوم وظيفية. هناك نوعان من مكونات كريسبر / نظام Cas9. ونوكلياز Cas9، والمستمدة من المقيحة المكورات العنقودية وجزيء ما يقرب من 100 الإقليم الشمالي دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) الذي يوجه Cas9 إلى الموقع الحمض النووي المستهدفة (ق) 1. وتمنح الاعتراف استهداف من قبل لأول مرة ~ 20 الإقليم الشمالي من gRNA، والذي يسمح لإنتاج عالية الإنتاجية من ناقلات تستهدف 2،3. معظم الكائنات الحية التي يمكن هندستها، وقد تم بالفعل مع كريسبر التكنولوجيا / Cas9 4،5.
في النباتات، والمروجين التأسيسي، مثل المروج CaMV 35S، وتستخدم عادة لدفع التعبير عن نوكلياز Cas9 6. يتم التعبير عن gRNAs باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز الثالث U6 أو U3 المروجين الذي يقيد قاعدة الأولى من gRNA إما G، لU6، أو ألف لU3، عن النسخ كفاءة. ومع ذلك RNA البلمرة الثاني حفلة موسيقيةoters، التي تكون خالية من هذه القيود، وقد استخدمت أيضا 7،8.
gRNAs مختلفة لحث طفرات الحمض النووي مع كفاءات مختلفة، وذلك يمكن أن يكون من المهم للتحقق من صحة أولا ناقلات كريسبر قبل الاستثمار في التحولات كامل النبات أو إنشاء شاشات المظهرية واسعة النطاق. التعبير عابر كريسبر يبني في النباتات، وذلك باستخدام تسريب الأجرعية على سبيل المثال، ينتج عموما في أدنى تردد من تعديل الحمض النووي بالمقارنة مع النباتات مستقرة 6، مما يجعل الكشف عن الطفرات صعبة وفحوصات المظهري غير عملي مع هذه النهج. ما يسمى جذور شعر هي، نظام بديل مناسب لأن عددا كبيرا من المواد مستقلة، تحولت مستقر يمكن أن تتولد في غضون أسابيع، على العكس من أشهر النباتات مستقرة. ناقلات كريسبر فعالة جدا في إحداث طفرات الحمض النووي في جذور شعر 9،10.
طرق تجميع الحمض النووي ligate بكفاءة شظايا الحمض النووي التي تحتوي على overlapping ينتهي 11. والميزة الرئيسية لبعض أساليب تجميع الحمض النووي هو القدرة على دمج ssDNA (أي oligos) في تجميع المنتجات. منذ gRNAs ليست سوى ~ 20 NT طويلة وأهداف جديدة يمكن مع oligos توليفها، وهذه الأساليب تجميع الحمض النووي هي مناسبة تماما لاستنساخ كريسبر. وتستند هذه البروتوكولات المذكورة هنا على سلسلة P201 ناقلات كريسبر التي استخدمت بنجاح في فول الصويا 10، الحور 12 والآن الطماطم. إجراء الاستنساخ قدم ويقدم العديد من المزايا على طريقة الاستنساخ الحالي 10. وهي ناقلات تعمل بكامل طاقتها ويمكن أن تتولد في رد فعل الاستنساخ واحد في يوم واحد. ويمكن أيضا بناء ناقلات تكون مجمعة لتوليد ناقلات كريسبر متعددة في نفس الوقت، وكذلك الحد العملي على الوقت وتكاليف المواد. نقدم أيضا على بروتوكول لتوليد الطماطم جذور شعر باعتباره وسيلة فعالة لإنتاج المواد المعدلة وراثيا مع الحذف الجينات المستهدفة. وتستخدم جذور شعر لصالحةأكل ناقلات كريسبر وتوفير المواد اللازمة لتجارب لاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. دليل الحمض النووي الريبي التصميم والبناء المتجهات
- تحديد تسلسل هدف للجينات الفائدة. وهناك مجموعة متنوعة من البرامج لتقصي الهدف كريسبر على الانترنت المناسبة لهذه الخطوة 13،14.
ملاحظة: هنا نستخدم GN 20 GG عزر الهدف، ولكن تصاميم أخرى قد تكون مناسبة وفقا لنظام تطبيق أو ناقلات المستخدمة. - تصميم 60-mer من oligos gRNA لتشمل الجزء GN 19 من الزخارف الهدف يحيط بها 5 'و 3' تسلسل 20 الإقليم الشمالي المطلوبة لتجميع الحمض النووي. النهائي عزر 60 مير هو: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 ".
ملاحظة: عادي، الاشعال المحلاة تعمل بشكل جيد. - إعداد السلطات الوطنية المعينة أربعة لتجميع (الشكل 1). رؤية الملف التكميلي لتسلسل الحمض النووي.
- هضم 1-5 ميكروغرام من p201N: Cas9 10 البلازميد مع تقييد انزيم جمعية مهندسي البترول أنا في 1X العازلة 4 عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. عمود تنقية هضمccording لتعليمات الشركة الصانعة. Resuspend في ~ 15 ميكرولتر من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، وتحديد بواسطة القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية.
- إجراء عملية هضم الثانية مع تقييد انزيم سوا أنا في 1X العازلة 3.1 عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تحقق 100-200 نانوغرام على هلام الاغاروز 0.8٪ لتأكيد عملية الهضم الكامل.
ملاحظة: سوف البلازميد هضمها بشكل صحيح لديهم فرقة واحدة في 14313 سنة مضت. ليس مطلوبا من تعطيل الحرارة الإنزيم ونزع الفسفات: مذكرة. يمكن تخزين البلازميد هضمها في -20 درجة مئوية. - PCR تضخيم truncatula Medicago (متى) مروج U6 وسقالة السلطات الوطنية المعينة من تقوم تقنية gRNA المكوك 10 البلازميد باستخدام بادئات سوا I_MtU6F / MtU6R وScaffoldF / جمعية مهندسي البترول I_ScaffoldR، على التوالي. استخدام البلمرة عالية الدقة للشروط PCR: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 31 دورات (98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية). و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تصور ~ 3 مكل من PCR العلاقات العامةoducts العلاقات على هلام الاغاروز 1٪ لتأكيد التضخيم. وamplicon MtU6 هو 377 نقطة أساس وamplicon سقالة 106 نقطة أساس. عمود تنقية المنتجات PCR المتبقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، كميا بواسطة القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية ومخزن في -20 درجة مئوية.
- Resuspend وأنبوب كامل من oligos gRNA إلى 100 ميكرومتر في الماء مختبر الصف. إضافة 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر بنسبة ضئيلة إلى 500 ميكرولتر من 1X العازلة 2.1. تخلط جيدا. إذا تجميع oligos متعددة، إضافة 1 ميكرولتر من كل جزئية 100 ميكرومتر إلى 1X العازلة 2.1 أنبوب. ويمكن تخزين oligos المخفف في -20 درجة مئوية.
- برمجة cycler الحرارية لعقد عند 50 درجة مئوية، وذلك باستخدام غطاء ساخنة. الجمع بين 100 نانوغرام (0.011 بمول) من ناقلات خطي، 50 نانوغرام (0.2 بمول) من MtU6 المروج، 12 نانوغرام (0.2 بمول) من سقالة، 1 ميكرولتر (0.2 بمول) من جزئية المخفف gRNA (ق)، والماء إلى حجم 5 ميكرولتر. إضافة 5 ميكرولتر من 2X مزيج الرئيسي تجميع الحمض النووي عالية الدقة، وتخلط جيدا وتدور باستمرار. احتضان رد فعل لمدة 60 دقيقة في50 ° C cycler الحرارية. ثم ضع رد فعل على الجليد.
ملاحظة: كميات رد فعل يمكن زيادة لاستيعاب عائدات الحمض النووي منخفضة. - تحويل 2 ميكرولتر من رد الفعل إلى E. المختصة القولونية الخلايا باستخدام تقنيات القياسية ولوحة على LB تستكمل مع 50 ملغ L -1 كانامايسين (كان 50). تنمو الخلايا مطلي عند 37 درجة مئوية خلال الليل. حفظ الحمض النووي التجمع رد فعل المتبقية في -20 درجة مئوية.
- شاشة مستعمرة من قبل PCR باستخدام StUbi3P218R الاشعال وISceIR. تمييع قسامة المتبقية الحمض النووي التجمع رد فعل بالماء 1: 5. استخدام 1 ميكرولتر كعنصر تحكم إيجابية للشاشة مستعمرة و 1 نانوغرام من p201N التعميم: Cas9 البلازميد كعنصر تحكم بعدم إدراج.
- PCR تضخيم مع شروط؛ 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 31 دورات (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية). وعند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تصور المنتجات PCR على هلام الاغاروز 1٪. تأكد من أن الإدراج الصحيحة لها الفرقة في 725 شركة بريتيش بتروليوم وناقلات خفة دمسوف يدرج الحوت (على سبيل المثال، ناقلات تقطيعه) لديها الفرقة 310-BP.
- تنمو المستعمرات الإيجابية في LB كان 50 الثقافات السائل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وتنقية البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. سانجر تسلسل البلازميدات مع التمهيدي StUbi3P218R ومحاذاة الاستشرابية إلى MtU6 المروج والهدف، وتسلسل سقالة لضمان تقديم أية أخطاء خلال الاستنساخ.
- تنفيذ عملية التشخيص هضم من قبل هضم ~ 1 ميكروغرام البلازميد مع منظمة التعاون الاقتصادي RV وزريبة الخنازير أولا تصور على هلام الاغاروز 0.8٪. شظايا (في بي بي) هي: 4192، 2001، 1743، 1544، 1381، 995، 831، 702، 460، 423، 318، و 174.
- استخدام تجميع الحمض النووي لبناء ناقلات مع gRNAs متعددة.
- لبناء ناقلات مع اثنين من أشرطة gRNA، PCR تضخيم أول موقف gRNA مع الاشعال سوا I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR و-المركز الثاني gRNA مع الاشعال UNS1_MtU6F / جمعية مهندسي البترول I_ScaffoldR من 1 نانوغرام من كل فيما يخصه منالبلازميدات التي شيدت في خطوات 1،1-1،8. استخدام شروط الاسترداد في الخطوة 1.3.3. تصور ~ 3 مكل من المنتجات PCR على هلام الاغاروز 1٪ لتأكيد التضخيم. Amplicons هي ~ 500 نقطة أساس.
- الجمع بين وتخلط كميات متساوية تقريبا من المنتجات PCR-تنقية الامم المتحدة في أنبوب 200 ميكرولتر (عادة 3-4 ميكرولتر من كل منهما). للتجميع، إضافة 1 ميكرولتر الجمع بين المنتجات PCR، 50 نانوغرام من سوا أنا وجمعية مهندسي البترول أنا خطي p201N: Cas9 والماء مختبر الصف إلى 2.5 ميكرولتر و 2.5 ميكرولتر من 2X مزيج الرئيسي تجميع الحمض النووي عالية الدقة. احتضان في cycler على 50 درجة مئوية الحراري لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: أدلة الحمض النووي التجمع توصي حضانة لمدة 15 دقيقة ل2-3 شظايا. - تحويل 1-2 ميكرولتر إلى E. المختصة خلايا القولونية ولوحة على LB كان 50. زراعة خلايا مطلي عند 37 درجة مئوية خلال الليل. حفظ رد فعل المتبقية في -20 درجة مئوية.
- شاشة مستعمرة من قبل PCR مع الاشعال StUbi3P218R وISceIR مع نفس الشروط خطوة 1.6. ج الصحيحةسوف lones يكون amplicon 1200 سنة مضت. تنمو المستعمرات الإيجابية في LB كان 50 الثقافات السائل بين عشية وضحاها وتنقية البلازميدات.
- سانجر تسلسل البلازميدات مع StUbi3P218R الاشعال (تغطي-المركز الأول gRNA) وp201R (يغطي ثاني موقف gRNA). محاذاة الاستشرابية لتسلسل المروج والهدف، وسقالة MtU6. التشخيص الهضم مع منظمة التعاون الاقتصادي RV وقذر وسوف يؤدي إلى شظايا التالية (بي بي): 4192، 2476، 1743، 1544، 1381، 995، 831، 702، 460، 423، 318، 174. جزء بالخط العريض يحتوي على gRNA الثانية.
- بعد تلبية جميع توقعات مراقبة الجودة، وتحويل البلازميدات إلى الأجرعية rhizogenes سلالة ARqua1 15. إضافة 1 ميكرولتر من الإعدادية البلازميد 50 ميكرولتر من خلايا electrocompetent وelectroporate في كوفيت 1 مم مع الإعدادات: 2.4 كيلو فولت، 25 μF، و 200 Ω. استعادة الخلايا في ~ 500 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب ويهز عند 28 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. لوحة على LB كان 50 و زصف عند 28 درجة مئوية لمدة 2 أيام. أداء الشاشة مستعمرة باستخدام نفس الاشعال وشروط الاسترداد كما 1.3.3. جعل الأسهم الجلسرين من الحيوانات المستنسخة إيجابية.
التحول 2. مشعر الجذر
- تعقيم بذور الطماطم في 20٪ التبييض المنزلي لمدة 15 دقيقة، مع الخلط المستمر. في غطاء تدفق الصفحي، وإزالة مبيض ويغسل في الماء مختبر الصف المعقم 3 مرات.
- لوحة 30 بذور في مربع GA-7 التي تحتوي على وسائل الاعلام ½ MS (2.22 ز L -1 الأملاح + Gamborg الفيتامينات، 10 ز L -1 السكروز، 3 ز L -1 الصمغ جيلان، ودرجة الحموضة 5.8). تنبت ل~ 2 أيام في الظلام، ثم نقل GA-7 صناديق للضوء. تنمو الشتلات الخاصة ب ~ 4 أيام أخرى في ضوء.
- قبل يوم واحد تحول، خط خارج A. rhizogenes الثقافات في صلب LB كان 50 وتنمو عند 28 درجة مئوية خلال الليل.
- يوم تحول، في غطاء تدفق الصفحي تجميع المواد المعقمة: 12 مل أنابيب ثقافة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، ½ MS السائل (لا جيلان زأم)، و 200 ميكرومتر acetosyringone، ورق الترشيح، أطباق بتري، ملقط ومشرط، الماصات ونصائح ماصة. إضافة 25 ميكرولتر من acetosyringone إلى 50 مل من ½ MS وتصب ~ 6 مل في كل أنبوب الثقافة.
- استخدام عازمة غيض 200 ميكرولتر لتتخلص أ. خلايا rhizogenes من لوحة و resuspend في 6 مل من ½ MS السائل. دوامة أنبوب ل resuspend تماما الخلايا. بعد إعادة التعليق الخلايا من كل ناقلات، وقياس الكثافة الضوئية (OD) من 1 مل من الخلايا في الطول الموجي ثابت من 600 نانومتر. ضمان OD ما بين 0.2 و 0.4. تمييع أو إضافة المزيد من الخلايا عند الضرورة. كرر لكل بناء.
- إضافة ~ 2 مل من ½ MS السائل إلى طبق بتري مع ورقة تصفية معقمة. النبتات المكوس من الشتلات ومكان على ورقة الترشيح مبلل. مرة واحدة وقد تم جمع جميع النبتات، وقطع البعيدة ~ 1 سم الخروج من النبتات، مما أدى إلى قطع فلقة مع اثنين من قطع ينتهي. إضافة إإكسبلنتس إلى A. حلول rhizogenes المزيج، واحتضان لمدة 20 دقيقةمع قلب في بعض الأحيان.
ملاحظة: يتم استخدام ما يقرب من 12 إإكسبلنتس في بناء بشكل روتيني، على الرغم من ما يصل الى 80 إإكسبلنتس تم تلقيح في 6 مل من أ. حل rhizogenes. - خلال A. rhizogenes الحضانة، إضافة ورق الترشيح لأطباق بتري، واحدة في بناء تحول. أيضا تعيين ½ MS سائل الاعلام الصلبة، وعدم إعطائها، في غطاء تدفق الصفحي لتجف.
- مغرفة النبتات من أ. حل rhizogenes مع ملقط معقم وتوضع على ورق الترشيح جافة. مع تغطية بيتري غطاء لضمان الأنسجة لا تجف حين الشروع في التحول المقبل. النبتات وصمة عار على ورقة الترشيح ونقلها، الجانب مجافي المحور تصل إلى نصف وسائل الاعلام MS. التفاف لوحات مع الشريط الجراحية وشارك في زراعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 أيام.
- بعد شارك في زراعة، النبتات نقل، الجانب مجافي المحور تصل إلى ½ سائل الإعلام MS تستكمل مع 300 ملغم لتر -1 تيكارسيلين / حمض clavulanic (تيم 300، لمنع نمو RESIDالسياقية أ. rhizogenes) وكان 50 (لاختيار النباتات) والتفاف مع الشريط الجراحية. الحفاظ على الثقافات تحت الأضواء الفلورية في درجة حرارة الغرفة مع الضوئية التي استمرت 16 ساعة.
- بعد ~ 1.5 - يتم استئصال 2 أسابيع جذور لا يقل عن 2 سم في الطول من النبتات باستخدام ملقط معقم ومشرط ونقلها إلى ½ MS كان 50 تيم 300 وسائل الإعلام. نقل 10 إلى 15 جذور لوحة واحدة. بمناسبة موقف نصائح الجذر مع علامة، والتفاف مع الشريط الجراحية، والاحتفاظ بها في غرفة الثقافة.
- بعد أسبوع واحد، وتعتبر الجذور تحول المتزايد على وسائل الإعلام الانتقائي. حصاد عينة فرعية من جذور تحولت لاستخراج الحمض النووي باستخدام طريقة الحمض النووي استخراج المفضل. ملاحظة: لوحات مع النبتات يمكن الاحتفاظ بها ل2-3 المحاصيل الأسبوعية، بعد هذه النقطة جذور تنمو لتصبح فوضى متشابكة ويصعب عزل. يمكن الحفاظ على أنسجة الجذر غير المقطوع إلى أجل غير مسمى. مجموعة متنوعة من فحوصات يمكن القيام بها على عينة من الحمض النووي معزولةالصورة لتحديد الحمض النووي تردد الطفرة والنوع. ووصف النتائج من عدد قليل من هذه المقايسات أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كريسبر بناء ناقلات مع التجمع الحمض النووي يولد عادة عشرات إلى مئات من الحيوانات المستنسخة مستقلة. فحص مستعمرة من قبل PCR تحدد بسهولة استنساخ الصحيحة، ويمكن أن تميز بين البلازميدات مع وبدون تدرج (الشكل 2A) وهي مفيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. عادة، كل من الحيوانات المستنسخة تحتوي على إدراج ويمكن للمستخدم اختيار لتخطي الخطوات مستعمرة الفحص تماما. وتستخدم هضم التشخيص (الشكل 2B) وسانجر تسلسل لمراقبة الجودة. عندما لا تحدث أخطاء، فهي عادة لوحظت في مناطق الحمض النووي متداخلة، أي "نهاية المروج MtU6، وgRNA، أو 3 '5 نهاية تسلسل سقالة. إذا يتم تجميع متعددة oligos gRNA الى رد فعل واحد، ويتم تحديد gRNAs التي كتبها سانجر التسلسل. إدماج gRNAs فرد وتوزع بالتساوي ومعظم gRNAs يمكن عزله عن تحول واحد (الشكل 2C (الشكل 2C).
وعادة ما تكون لاحظت الطماطم جذور شعر 1-2 أسابيع بعد التحول (الشكل 3A). يتم استئصال جذور ≥2 سم في الطول، وتحويلها إلى ويمكن تحديد جذور مقاومة للكانامايسين المتوسطة انتقائية وبعد أسبوع واحد (الشكل 3B). سوف تنمو معظم الجذور إلى حد ما على وسائل الاعلام انتقائية ونمو الجذور في جذور تحول يمكن أن تكون متغيرة. إذا أمكن، تحديد جذور الأسرع بقوة للتحليل. يتم استرداد واحد إلى اثنين جذور مقاومة للكانامايسين عادة مع كل فلقة تلقيح. مع النقل العادية، جذور تحولت يمكن الحفاظ أجل غير مسمى على وسائل الإعلام الانتقائي.
يتم استخراج الحمض النووي من الجذور مقاومة للكانامايسين ويستخدم PCR لamplifذ المنطقة المستهدفة (ق). منتجات PCR يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من فحوصات لتحديد كفاءة الطفرة، مثل الاستنساخ والتسلسل (الشكل 3C)، تحليل تقييد جزء طول تعدد الأشكال، بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام 16 (الشكل 3D)، T7E1 نوكلياز داخلية 16 أو الإنتاجية العالية amplicon التسلسل 10. وكما ورد في أنظمة كريسبر-النباتية الأخرى 6، اعتمادا على تسلسل gRNA / الهدف المحدد، مجموعة من الطفرات والكفاءة طفرة يمكن ملاحظة.
. الشكل 1. مبدأ الجمعية كريسبر في رد فعل التجمع الحمض النووي، ويتم خلط أربعة السلطات الوطنية المعينة معا. p201N: Cas9 خطي مع سوا أنا وجمعية مهندسي البترول الأول (دائرة سوداء)، والمروج MtU6 (السهم الأخضر)، سقالة (الشريط الأصفر) وبنسبة ضئيلة gRNA 60 مير تحتوي على تسلسل الهدف GN 19 (بشريط LUE). نهايات كل جزيء الحمض النووي تتداخل 20 نقطة أساس مع قطعة مجاورة. رد فعل التجمع DNA يعيد توحيد هذه السلطات الوطنية المعينة إلى ذلك، جزيء دائري واحد. يشار التمهيدي StUbi3p218R وISceIR مواقع الربط مع السهام السوداء، و2x35S: Cas9 كاسيت الأرجواني، وStUbi3: كاسيت nptII هو البرتقالي واليسار ويشار إلى الحدود اليمنى مع القضبان الرمادية. ملاحظة: خريطة متجه ليست لتوسيع نطاق الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. فحص مستعمرة والبلازميد مراقبة الجودة. أ) فحص مستعمرة 20 الحيوانات المستنسخة من تجميع الحمض النووي والتحول. M، سلم 100-BP. +، p201N: Cas9: GFPT2 مراقبة إيجابية. NI، p201N: Cas9 السيطرة عدم إدراج. GA، الحمض النووي تضعف رد فعل التجمع. NT، لا قالب السيطرة. ب) الممثل هضم أربعة p201N: Cas9: ناقلات gRNA مع تقييد الانزيمات ايكو RV وزريبة الخنازير أولا M، 2-سجل سلم. C) مقارنة الإخلاص للمعيار وعالية الدقة يمزج تجميع الحمض النووي وتوزيع ناقلات تعافى عندما كان يتم تجميع 11 oligos gRNA الى رد فعل واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الثقافات مشعر الجذر والكشف عن الحمض النووي تعديل. أ) يمكن أن ينظر إلى جذور مشعر الناشئة من النبتات بعد 11 يوما تحول B) يتم اختيار الجذور على ½ MS كان 50 وسائل الإعلام لمدة أسبوع تقريبا. القضبان الرمادية تدل على موقف نصائح الجذرية في وقت من الطلاء. C) مثال الاستنساخ وتسلسل لتحديد الطفرات الحمض النووي مع اثنين من أهداف الجينات المختلفة في أربع مناسبات شعر الجذر مختلفة. مربع رمادي يدل على GN 20 GG تسلسل الهدف، Δ يشير إلى نوع من الطفرات، وعدد من الحيوانات المستنسخة مع الطفرة المشار إليها. D) مثال إس دي إس بايج لتحديد الطفرات الحمض النووي. الحذف كبيرة وشرائح مضاعف متغاير تشير إلى وجود طفرات الحمض النووي في تسلسل الهدف. وسجل ستة من 12 الأحداث مستقلة المسوخ (Δ). WT، من النوع البري السيطرة؛ NT، لا قالب السيطرة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل منحة المؤسسة الوطنية للعلوم IOS-1025642 (GBM). نشكر ماريا هاريسون لتوفير سلالة ARqua1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
