Summary
使用DNA装配，可以并行地构建在单个克隆反应多个CRISPR矢量，使得大量CRISPR的建设矢量a简单的任务。番茄毛状根是一个很好的模型系统来验证CRISPR载体和产生突变体材料。
Introduction
生成具有针对性的CRISPR DNA修改的能力/ Cas9有功能基因组学研究的巨大潜力。还有CRISPR / Cas9系统的两个组件;的Cas9核酸酶，来自金化脓和指示Cas9到目标DNA的网站，1的约100-nt的导的RNA（gRNA）分子衍生。目标识别由第一赋予〜了gRNA，其允许高通量生产靶向载体2,3的20-nt的。可工程改造大多数生物体，已经已经与CRISPR / Cas9技术4,5。
在植物中，组成型启动子，如CaMV 35S启动子，通常用于驱动Cas9核酸6的表达。的gRNAs使用RNA聚合酶III U6或U3启动子限制gRNA的第一基表示到一个G，对于U6，或A为U3，对有效转录。然而RNA聚合酶II舞会oters，这是自由的这些限制，也已经使用7,8-。
不同gRNAs诱导不同的效率DNA突变，并且因此它可以在整个植物转化的投资或设立广泛的表型屏幕之前先验证CRISPR载体是重要的。 CRISPR的瞬时表达构建体在植物中，通过使用例如农杆菌渗入，通常导致DNA修饰的一个较低的频率相比，稳定的植物6，使得突变困难和表型分析不切实际用这样的方法进行检测。所谓毛状根是由于能够在几周内产生大量的独立的，稳定转化的材料，而不是个月稳定的植物一个方便的替代系统。 CRISPR载体在发根诱导9,10 DNA突变非常有效。
DNA组装方法有效地结扎含，可欣赏的DNA片段apping结束11。的一些DNA的装配方法的主要优点是将单链DNA（ 即寡核苷酸）插入组装产品的能力。因为gRNAs仅〜20-nt的长和新的目标可以用合成的寡核苷酸进行，这些DNA装配方法非常适合于CRISPR克隆。这里所述的协议是基于P201系列CRISPR载体已在大豆10，杨树12被成功地使用，现在番茄。提出的克隆程序在当前克隆方法10提供了几个优点。即，可以在一个单一的一天的单个克隆反应中产生完全功能的载体。载体的构建也可以合并，以产生多个并行CRISPR载体，进一步减少操作时间和材料成本。我们还提出了一个协议番茄毛根的产生作为一种有效的方法，以产生具有目标基因缺失的转基因材料。发根是用来有效吃了CRISPR载体和为后续实验提供材料。
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Protocol
1.指南RNA设计载体的构建
- 确定感兴趣的基因的靶序列。有多种适于此步骤13,14在线CRISPR目标调查程序。
注意：在这里，我们使用GN 20 GG靶基序，但根据所使用的应用或载体系统上的其他设计可能是合适的。 - 设计60聚体gRNA寡聚包括由5侧翼靶基序'和3'20-nt的序列所必需的DNA组件的GN 19部。最后60聚体基序是：5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'。
注：标准，脱盐引物，做工精细。 - 制备用于装配的四个的DNA（ 图1）。见DNA序列的补充文件。
- 消化1 - p201N 5微克：Cas9 10质粒用限制酶的Spe我在1×缓冲液4在37℃下2小时。柱净化消化ccording制造商的指示。重悬〜15微升10毫摩尔Tris-HCl中，并通过紫外分光光度法量化。
- 执行在25℃的第二与在1×缓冲液3.1限制性酶SWA我消化2小时。检查100 - 200纳克在0.8％琼脂糖凝胶，以确认完全消化。
注：正常消化质粒将在14313 BP有一个乐队。不需要的酶和去磷酸化的热灭活：音符。消化的质粒可被储存在-20℃。 - PCR扩增使用引SWA I_MtU6F / MtU6R分别ScaffoldF / SPE I_ScaffoldR，从市局gRNA班车10质粒的苜蓿 （百万吨）U6启动子和支架的DNA。使用与PCR条件高保真聚合酶：95℃，3分钟; 31个循环（98℃，20秒，60℃15秒，72℃30秒）;和72℃5分钟。
- 可视化PCR公关〜3微升等分在1％琼脂糖凝胶oducts确认扩增。该MtU6扩增为377 bp和脚手架扩增为106基点。根据制造商的说明列纯化剩余的PCR产物，在-20℃下用紫外分光光度法和存储量化。
- 悬浮gRNA寡聚的整个管在实验室级水100微米。加入1μl100μM寡核苷酸的500微升1×缓冲液2.1。拌匀。如果汇集多个寡核苷酸，加入1微升各100μM寡核苷酸为1倍的缓冲管2.1。稀释寡聚可以储存在-20℃。
- 编程热循环仪在50℃下保存，使用加热盖。线性化载体，50毫微克稀释gRNA寡（s）和水的MtU6子，12毫微克（0.2皮摩尔）支架，1微升（0.2皮摩尔）（0.2皮摩尔）的结合100纳克（0.011皮摩尔）至体积5微升。加入5微升2个高保真DNA组装预混，拌匀降速。孵育反应在60分钟50℃的热循环仪。然后置于冰上反应。
注意：反应体积可以增加，以适应低DNA产量。 - 变换2微升反应到感受态大肠杆菌细胞使用在LB标准技术和板补充有50毫克的L -1卡那霉素（菅50）。生长铺板细胞在37℃下过夜。保存在-20℃下剩余的DNA装配反应。
- 使用引StUbi3P218R和ISceIR通过PCR殖民地屏幕。用水稀释1剩余的DNA装配反应的等分试样：5。使用1微升作为殖民地屏幕阳性对照，圆形p201N 1纳克：Cas9质粒作为一个没有插入控件。
- PCR扩增的条件; 95℃，3分钟; 31个循环（95℃，30秒，58℃，30秒，72℃30秒）;并在72℃下5分钟。可视化在1％琼脂糖凝胶的PCR产物。确保正确插入725 bp和载体机智有一个乐队豪特的插入（ 例如 ，未切向量）将有一个310-bp条带。
- 在37℃下在LB菅生长阳性菌落50液体培养过夜，并根据制造商的说明纯化质粒。桑格序列与StUbi3P218R底漆质粒和对齐色谱图的MtU6启动，目标和支架序列，以确保克隆过程中引入了错误。
- 进行消化〜1微克质粒与生态休旅车和麦粒肿 I.诊断消化可视化在0.8％琼脂糖凝胶。片段（血压）为：4192，2001，1743年，1544 1381 995，831，702，460，423，318，174。
- 使用DNA组装构建载体与多个gRNAs。
- 为了构建具有两个gRNA盒的载体，PCR扩增用引物SWA I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR和第二位置gRNA从1纳克每一个相应的引物UNS1_MtU6F / SPE I_ScaffoldR第一位置gRNA1.8 - 质粒步骤1.1构建。使用的PCR条件在步骤1.3.3。可视化在1％琼脂糖凝胶PCR产物的〜3微升等分试样，以确认扩增。扩增子〜500基点。
- 结合并在200微升混合管的未纯化的PCR产物大约等量的（一般为3 - 4微升每个）。进行组装，加入1微升合并的PCR产物，SWA我的50纳克和SPE I线性p201N：Cas9，实验室级水至2.5微升和2.5微升2×高保真DNA装配主混合物。孵育15分钟50℃的热循环仪。
注意：将DNA组件手册建议一个15分钟温育2 - 3片段。 - 转换1 - 2微升到感受态大肠杆菌细胞和板块在LB菅直人50。生长铺板的细胞在37℃下过夜。保存在-20℃剩余的反应。
- 菌落屏幕通过PCR用引物StUbi3P218R和ISceIR用相同的条件与步骤1.6。正确的Clones将有1200 bp的扩增。在菅直人的LB增长阳性克隆50液体培养过夜，净化质粒。
- 与引StUbi3P218R桑格序列质粒（包括第一位置gRNA）和p201R（包括第二位gRNA）。对齐色谱图至MtU6启动，目标和支架序列。诊断消化用Eco RV和麦粒肿我会导致以下片段（以bp）：4192，2476，1743，1544，1381，995，831，702，460，423，318，174粗体片段含有第二gRNA。
- 满足所有质量控制的预期后，转化质粒导入发根农杆菌菌株ARqua1 15。加入1μl质粒制备的50微升电感受态细胞和电穿孔的在1毫米反应杯与设置：2.4千伏，25μF，200Ω。收回〜500微升SOC的细胞，在28℃下摇动2小时。板在LB菅直人50和g排在28℃下2天。使用相同的引物和PCR条件如1.3.3执行菌落屏幕。从阳性克隆使甘油原液。
2.发根变
- 消毒在20％家用漂白剂番茄种子15分钟，用恒定的混合。在层流罩，除去漂白剂和在无菌实验室级水洗涤3次。
- 在GA-7箱板30种子含1的MS培养基（2.22克L- -1 MS盐+ Gamborg维生素10克L -1蔗糖，3克L -1结冷胶，pH值5.8）。发芽在黑暗中为〜2天，然后移至GA-7框的光。生长〜4中的光多天苗。
- 改造前一天，连胜了A.发根坚实的LB菅直人50文化，在28℃下生长过夜。
- 变换的一天，在层流罩组装无菌材料：12毫升培养试管50毫升锥形管，半MS液相（无绞兰克UM），200μM乙酰丁香酮，滤纸，培养皿，镊子和手术刀，移液器和枪头。加入25微升乙酰丁香酮至50ml MS半，倒〜6毫升到每个培养管。
- 使用弯曲的200微升尖刮A.发根细胞从板块和重悬在6毫升½MS液体。涡流管完全悬浮细胞。从每个向量重悬细胞后，测量在600nm的固定波长为1毫升的细胞的光密度（OD）。确保OD为0.2和0.4之间;稀释或添加更多的细胞是必要的。重复每个结构。
- 约2ml半MS液相添加至培养皿用无菌滤纸。从上沾湿滤纸苗和地方消费税子叶。一旦所有子叶已收集，切成远侧约1cm断子叶，导致在子叶片具有两个切割端。添加外植体A.发根农杆菌的解决方案，混合，孵育20分钟偶尔反相。
注意：每个构建大约12植常规使用，但多达80外植体已经在6ml A的接种发根农杆菌的解决方案。 - 在A.发根农杆菌孵育，加滤纸培养皿，一是每个构建物转化。还设置MS半固体介质，没有抗生素，在层流罩干燥。
- 舀出子叶的A.发根农杆菌的解决方案与干燥滤纸无菌镊子和地点。的Petri盖覆盖，以确保组织不干燥而进行下一个转变。在滤纸上，并转移，背面朝上，印迹子叶到½MS培养基。包裹与手术带和板在黑暗中在室温下共同培养2天。
- 共培养，转子叶，背面侧之后，到½MS培养基补充有300mg的L-1替卡西林/克拉维酸（添300，以防止残油的生长UAL A.发根 ）和菅直人50（对于植物的选择），并包裹与手术胶带。保持在荧光灯下培养在室温下用16小时的光周期。
- 后〜1.5 - 2周根至少有2厘米的长度从子叶使用无菌镊子和手术刀切下并转移到½MS菅50添300的介质。转移10到15根到单个板。标记根尖用标记的位置，与手术胶带包裹，并在培养室维持。
- 一周后，转化的根看到的选择性培养基中生长。嘉实转型根的一个子样本使用首选的DNA提取方法提取DNA。注：与子叶板可以保持2 - 3周的收获，在此之后的根长成一团糟，并难以分离。非收获根组织能无限期地保存。多种测定法可以在分离的DNA样品进行s到确定DNA的突变频率和类型。从几个此类测定结果如下所述。
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Representative Results
CRISPR载体的构建与DNA组装通常会产生数十到数百个独立的克隆。通过PCR克隆筛选容易识别正确的克隆，可以带和不带刀片（ 图2A），这是用于故障排除质粒进行区分。通常情况下，所有的克隆包含插件和用户可以选择完全跳过克隆筛选步骤。诊断消化（ 图2B）和Sanger测序被用于质量控制。什么时候发生错误，它们通常在重叠DNA区域观察到的， 即 ，在5'端的MtU6的启动子，所述gRNA，或3'支架序列的末端。如果多个gRNA寡聚汇集成一个单一的反应中，gRNAs由Sanger测序来确定。个别gRNAs掺入均匀分布和大部分gRNAs可以从一个单一的转换（ 图2C中分离图2C）。
变换（ 图3A）后番茄毛根通常观察到一到两周。根≥2长度厘米切下并转移至选择培养基和卡那霉素抗性根可在一周后（ 图3B）来识别。大多数根将增长到一定程度的选择性媒体和转型根是可变的根系生长;如果可能的话，选择分析的最蓬勃发展的根源。一来二卡那霉素抗性每根接种子叶通常恢复。通过定期转移，转型根可以无限期地在选择性培养基上维持。
DNA从卡那霉素抗性的根中提取和PCR是用来amplify中的目标区域（多个）。 PCR产物可以以多种测定法可用于确定突变效率，如克隆和测序（ 图3C），限制性片段长度多态性分析，聚丙烯酰胺凝胶电泳16（ 图3D），T7E1内切核酸酶16，或高通量的扩增子测序10。据报道在其他CRISPR -植物系统6中 ，根据所选择的gRNA /靶序列，一个范围的突变和突变的效率可被观察到。
图1. CRISPR大会原理在该DNA装配反应，四的DNA混合在一起; p201N：Cas9线性与SWA和SpeI我（黑色圆圈），MtU6子（绿色箭头），支架（黄色条）及含有GN 19靶序列的60聚体gRNA低聚（二略栏）。每个DNA分子的末端重叠20bp的与相邻的片。该DNA装配反应重组这些DNA成一个单一的，环状分子。的StUbi3p218R和ISceIR引物结合位点以表示黑色箭头所示，2x35S：Cas9盒是紫色，所述StUbi3：NPTII盒是橙色和左，右边缘与灰色条表示。注：矢量地图是不按比例，请点击此处查看该图的放大版本。
图2.菌落筛选，并从DNA的组装和改造20个克隆质粒的质量控制。A）克隆筛选。男，100 bp的阶梯; +，p201N：Cas9：GFPT2阳性对照; NI，p201N：Cas9没有插入控制; GA，稀释的DNA装配反应; NT，无模板控制。b）四p201N代表摘要：Cas9：用限制性gRNA载体酶Eco RV和麦粒肿 I.男，2日志梯子C）标准和高保真DNA组装混合时11 gRNA寡汇集成一个单一的反应回收矢量分布保真度的比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.毛状根培养和DNA修饰的检测。 A）毛状根可以看出从子叶出现的11天之后的转变。B）根是上半MS菅直人50媒体选择了大约一个星期。灰线表示在电镀。 的C时）克隆的实例根尖的位置，排序确定在四个不同的发根事件有两种不同的靶基因DNA突变。灰色框表示的GN 20 GG靶序列，Δ表示突变的类型，并克隆与所指示的突变。D）的聚丙烯酰胺凝胶电泳的实施例的数量，以确定DNA突变。大的缺失和异源条带表明DNA突变的靶序列的存在。 12个独立事件六记为突变体（Δ）。 WT，野生型控制; NT，无模板控制。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项研究是由美国国家科学基金会资助IOS-1025642（GBM）的支持。我们感谢玛丽亚·哈里森提供ARqua1应变。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
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| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
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