Summary
Utilizzando assemblaggio DNA, vettori multipli CRISPR possono essere costruiti in parallelo in una singola reazione clonazione, rendendo la costruzione di un gran numero di CRISPR vettori un compito semplice. Pomodoro radici pelose sono un sistema eccellente modello per convalidare vettori CRISPR e generare materiali mutanti.
Introduction
La capacità di generare le modifiche del DNA mirati con CRISPR / Cas9 ha un grande potenziale per gli studi di genomica funzionale. Ci sono due componenti del sistema CRISPR / Cas9; la nucleasi Cas9, derivata da pyogenes Staphylococcus e una molecola di circa 100 nt guida RNA (gRNA) che dirige Cas9 al sito DNA bersaglio (s) 1. Obiettivo riconoscimento è conferito dal primo ~ 20-nt del gRNA, che consente la produzione di high-throughput di targeting vettori 2,3. La maggior parte degli organismi che possono essere progettati, già sono stati con CRISPR tecnologia / Cas9 4,5.
Nelle piante, promotori costitutivi, come il promotore CaMV 35S, sono comunemente utilizzati per guidare l'espressione della nucleasi Cas9 6. I gRNAs sono espressi utilizzando le RNA polimerasi III U6 o U3 promotori che limita la prima base del gRNA, o un G, per la U6, o A per U3, per la trascrizione efficiente. Tuttavia prom RNA polimerasi IIoters, che sono liberi di queste restrizioni, sono stati utilizzati 7,8.
Diversi gRNAs inducono mutazioni del DNA con diverse efficienze, e quindi può essere importante per convalidare prima vettori CRISPR prima di investire nelle trasformazioni intero impianto o la creazione di ampi schermi fenotipici. Espressione transiente di CRISPR costruisce nelle piante, utilizzando agroinfiltration per esempio, comporta generalmente una minore frequenza di modifica DNA rispetto agli impianti stabili 6, rendendo il rilevamento di mutazioni difficili e saggi fenotipici impraticabili con tali approcci. Le cosiddette radici pelose sono una comoda, sistema alternativo poiché un gran numero di materiali stabilmente trasformate indipendenti può essere generato all'interno settimane, anziché mesi per impianti stabili. Vettori CRISPR sono molto efficaci a indurre mutazioni del DNA nelle radici pelose 9,10.
metodi di assemblaggio DNA legare in modo efficiente frammenti di DNA contenenti overlANALITICI finisce 11. Un vantaggio importante di alcuni metodi di assemblaggio DNA è la capacità di incorporare ssDNA (cioè oligonucleotidi) nei prodotti assemblati. Dal momento che gRNAs sono solo ~ 20-nt lunga e nuovi obiettivi possono essere realizzati con oligonucleotidi sintetizzati, questi metodi di assemblaggio del DNA sono adatti per CRISPR clonazione. I protocolli descritti qui sono basate sulla serie P201 di vettori CRISPR che è stato usato con successo nella soia 10, pioppo 12 e ora pomodoro. La procedura di clonazione presentato offre diversi vantaggi rispetto al metodo di clonazione corrente 10. Vale a dire, vettori completamente funzionali possono essere generati in una singola reazione clonazione in un solo giorno. costruzione del vettore può anche essere raggruppati per generare più vettori CRISPR in parallelo, riducendo ulteriormente hands-on costi di tempo e materiali. Presentiamo anche un protocollo per la generazione di pomodoro radici pelose come un metodo efficiente per la produzione di materiali transgenici con delezioni geniche mirate. radici pelose sono utilizzati per validemangiato i vettori CRISPR e fornire materiale per esperimenti successivi.
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Protocol
1. Guida RNA Progettazione e Costruzione di vettore
- Identificare sequenze bersaglio per i geni di interesse. Ci sono una varietà di programmi di destinazione conoscitiva CRISPR in linea adatte per questo passo 13,14.
NOTA: Qui usiamo il GG motivo bersaglio GN 20, ma altri disegni possono essere adatti a seconda del sistema di applicazione o il vettore utilizzato. - Progettazione 60-mer oligonucleotidi gRNA per includere la porzione GN 19 dei motivi di destinazione affiancato da 5 'e 3' sequenze di 20-nt che sono necessari per il montaggio del DNA. Il motivo finale 60-mer è: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
NOTA: Standard, primer dissalati funzionano bene. - Preparare i quattro DNA per il montaggio (Figura 1). Vedere file supplementare per sequenze di DNA.
- Digest: 1 - 5 mg di p201N: Cas9 10 plasmide con l'enzima di restrizione Spe I in 1x tampone 4 a 37 ° C per 2 ore. Colonna-purificare il digest unecondo le istruzioni del produttore. Risospendere in ~ 15 ml di 10 mM Tris-HCl, e quantificare mediante spettrofotometria UV.
- Eseguire una seconda digerire con l'enzima di restrizione SWA I in 1x tampone 3.1 a 25 ° C per 2 ore. Controllo di 100 - 200 ng su un gel di agarosio 0,8% per confermare completa digestione.
NOTA: Un plasmide correttamente digerito avrà una singola banda a 14.313 bp. Nota: inattivazione termica dell'enzima e defosforilazione non sono richiesti. plasmide digerito può essere conservato a -20 ° C. - PCR amplifica il truncatula Medicago (Mt) U6 promotore e impalcature DNA dal PUC gRNA navetta 10 plasmide utilizzando i primer Swa I_MtU6F / MtU6R e ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, rispettivamente. Utilizzare una polimerasi ad alta fedeltà con le condizioni di PCR: 95 ° C per 3 min; 31 cicli (98 ° C per 20 sec, 60 ° C per 15 sec, 72 ° C per 30 sec); e 72 ° C per 5 min.
- Visualizza ~ 3 aliquote microlitri di PCR products su un gel di agarosio 1% per confermare l'amplificazione. L'amplicone MtU6 è 377 bp e l'amplicone patibolo è di 106 bp. Colonna-purificare i restanti prodotti di PCR in base alle istruzioni del produttore, quantificare mediante spettrofotometria UV e conservare a -20 ° C.
- Risospendere l'intero tubetto di oligonucleotidi gRNA a 100 micron di acqua di laboratorio di grado. Aggiungere 1 ml di 100 mM oligo a 500 ml di 1x tampone 2.1. Mescolare bene. Se il pool più oligonucleotidi, aggiungere 1 ml di ogni oligo 100 micron al 2,1 tubo 1x tampone. oligo diluiti possono essere conservati a -20 ° C.
- Programmare un termociclatore di tenere a 50 ° C, utilizzando un coperchio riscaldato. Combinare 100 ng (0,011 pmol) del vettore linearizzato, 50 ng (0,2 pmol) di MtU6 promoter, 12 ng (0,2 pmol) dell'impalcatura, 1 ml (0,2 pmol) di diluito oligo gRNA (s), e acqua ad un volume di 5 ml. Aggiungere 5 ml di 2x ad alta fedeltà assemblaggio DNA master mix, mescolare bene e spin down. Incubare la reazione per 60 min in50 ° C termociclatore. Poi posizionare la reazione in ghiaccio.
Nota: i volumi di reazione può essere aumentata per ospitare basse rese di DNA. - Trasforma 2 ml di reazione in E. competente coli cellule utilizzando tecniche standard e piastra su LB integrato con 50 mg L-1 kanamicina (Kan 50). Crescere cellule placcato a 37 ° C durante la notte. Salvare la reazione di assemblaggio DNA rimanente a -20 ° C.
- schermo Colony mediante PCR utilizzando il StUbi3P218R primer e ISceIR. Diluire un'aliquota della reazione complesso DNA residuo con acqua 1: 5. Usare 1 ml come controllo positivo per lo schermo colonia e 1 ng di p201N circolare: Cas9 plasmide come un controllo non-insert.
- PCR amplifica le condizioni; 95 ° C per 3 min; 31 cicli (95 ° C per 30 sec, 58 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec); ed a 72 ° C per 5 min. Visualizzare prodotti di PCR su un gel di agarosio 1%. Assicurarsi che gli inserimenti corretti hanno una banda a 725 bp e vettori ingegnoInserti Hout (ad esempio, non tagliato vettore) avranno una banda di 310 bp.
- Crescere colonie positive in LB Kan 50 colture liquide durante la notte a 37 ° C e purificare plasmidi secondo le istruzioni del produttore. Sequenza Sanger plasmidi con il primer StUbi3P218R e allineare cromatogrammi alle MtU6 promotore, target, e le sequenze ponteggio per garantire l'assenza di errori sono stati introdotti durante la clonazione.
- Eseguire una diagnosi digest da digerire ~ 1 mg di plasmide con Eco e RV porcile I. Visualizzare su un gel di agarosio 0,8%. Frammenti (in punti base) sono: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, e 174.
- Utilizzare il montaggio del DNA per costruire vettori con più gRNAs.
- Per costruire un vettore con due cassette gRNA, PCR amplifica la prima posizione gRNA con i primer Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR e la seconda posizione di gRNA con i primer UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR da 1 ng di ciascuno dei rispettiviplasmidi costruiti in passi 1.1 - 1.8. Utilizzare le condizioni di PCR nella fase 1.3.3. Visualizzare ~ 3 aliquote microlitri di prodotti di PCR su un gel di agarosio 1% per confermare l'amplificazione. Gli ampliconi sono ~ 500 bp.
- Unire e miscelare circa la stessa quantità di prodotti di PCR non-purificata in tubo da 200 ml (di solito 3 - 4 ml di ciascuno). Per il montaggio, aggiungere 1 ml combinati prodotti di PCR, 50 ng di Swa I e Spe I linearizzato p201N: Cas9, acqua di laboratorio di grado a 2,5 ml e 2,5 ml di 2x ad alta fedeltà assemblaggio DNA master mix. Incubare in un termociclatore a 50 ° C per 15 min.
Nota: I manuali di montaggio DNA raccomanda 15 minuti di incubazione per 2 - 3 frammenti. - Trasforma 1 - 2 ml in E. competente coli e piatto su LB Kan 50. Crescere le cellule placcato a 37 ° C durante la notte. Salvare la reazione rimanente a -20 ° C.
- schermo Colony mediante PCR con primer StUbi3P218R e ISceIR con le stesse condizioni passo 1.6. corretto cLones avranno un amplicone 1.200 bp. Crescere colonie positive in LB Kan 50 colture liquide durante la notte e purificare plasmidi.
- Sanger plasmidi sequenza con il primer StUbi3P218R (buste primo posizione gRNA) e p201R (copre la seconda posizione gRNA). Allineare cromatogrammi alle MtU6 sequenze promotore, di destinazione, e ponteggi. Diagnostic digerire con Eco e RV porcile mi darà luogo ai seguenti frammenti (in bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. frammento Bolded contiene la seconda gRNA.
- Dopo aver incontrato tutte le aspettative di controllo della qualità, di trasformare i plasmidi in Agrobacterium rhizogenes ceppo ARqua1 15. Aggiungere 1 ml di preparazione plasmide di 50 ml di cellule electrocompetent e l'elettroporazione in una provetta 1 mm con le impostazioni: 2.4 kV, 25 uF, e 200 Ω. Recuperare le cellule a ~ 500 ml di SOC e agitare a 28 ° C per 2 ore. Piastra su LB Kan 50 e gfila a 28 ° C per 2 giorni. Eseguire schermo colonia utilizzando gli stessi primer e condizioni di PCR come 1.3.3. Fare scorte glicerolo da cloni positivi.
Trasformazione 2. Peloso Root
- Sterilizzare semi di pomodoro a 20% candeggina per uso domestico per 15 min, con una costante miscelazione. In una cappa a flusso laminare, rimuovere la candeggina e lavare in acqua da laboratorio-grado sterile 3 volte.
- Piastra 30 semi in una scatola GA-7 contenenti supporti ½ MS (2,22 g L -1 MS sali + Gamborg vitamine, 10 g L -1 di saccarosio, 3 g L -1 gellano, pH 5,8). Germini per ~ 2 giorni al buio, quindi spostare GA-7 scatole di luce. Crescere piantine per ~ 4 più giorni alla luce.
- Il giorno prima trasformazione, striscia fuori A. rhizogenes culture in solido LB Kan 50 e crescere a 28 ° C durante la notte.
- Giorno di trasformazione, nella cappa a flusso laminare assemblare materiali sterili: 12 ml provette di coltura, tubo da 50 ml, ½ MS liquido (non gellano gum), 200 micron acetosyringone, carta da filtro, piastre di Petri, pinze e bisturi, pipette e puntali per pipette. Aggiungere 25 ml di acetosyringone a 50 ml di ½ MS e versare ~ 6 ml in ciascuna provetta cultura.
- Utilizzare una punta piegata 200 pl per raschiare A. cellule rhizogenes dalla piastra e risospendere in 6 ml di ½ MS liquido. Vortex la provetta per risospendere completamente le cellule. Dopo risospendere le cellule da ciascun vettore, misurare la densità ottica (OD) di 1 ml di cellule ad una lunghezza d'onda fissa di 600 nM. Assicurarsi OD è compresa tra 0,2 e 0,4; diluire o aggiungere più celle, se necessario. Ripetere per ogni costrutto.
- Aggiungere ~ 2 ml di ½ MS liquido ad una capsula di Petri con una carta da filtro sterile. cotiledoni accise dalle piantine e posto sulla carta da filtro inumidita. Una volta che tutti i cotiledoni sono stati raccolti, tagliare i distali ~ 1 cm fuori dei cotiledoni, con conseguente pezzi cotiledone con due estremità tagliate. Aggiungere espianti ad A. soluzioni rhizogenes, si mescolano, e incubare per 20 mincon inversione occasionale.
Nota: circa 12 espianti al costrutto sono abitualmente utilizzati, anche se, come ben 80 espianti sono stati inoculati in 6 ml di A. soluzione rhizogenes. - Durante la A. rhizogenes incubazione, aggiungere carta da filtro a piastre di Petri, uno per ogni costrutto trasformato. Impostare anche ½ terreni solidi MS, antibiotici, nella cappa a flusso laminare ad asciugare.
- Scoop cotiledoni di A. soluzione rhizogenes con pinza sterile e posto su carta da filtro asciutta. Coprire con il coperchio Petri per garantire i tessuti non seccano mentre si procede alla successiva trasformazione. cotiledoni macchia sulla carta da filtro e il trasferimento, lato abaxial up, a ½ supporto MS. Avvolgere piastre con nastro chirurgico e co-coltivazione al buio a temperatura ambiente per 2 giorni.
- Dopo aver co-coltivazione, cotiledoni di trasferimento, lato abaxial up, a ½ supporti MS integrati con 300 mg L-1 ticarcillina / acido clavulanico (Tim 300, per impedire la crescita di residUAL A. rhizogenes) e Kan 50 (per la selezione delle piante) e avvolgere con nastro adesivo chirurgico. Mantenere culture sotto luci fluorescenti a temperatura ambiente con un fotoperiodo di 16 ore.
- Dopo ~ 1,5 - 2 settimane radici di almeno 2 cm di lunghezza sono asportati dai cotiledoni con pinza sterile e un bisturi e trasferiti a ½ MS Kan 50 Tim 300 mezzi. Trasferire 10 a 15 radici di una singola lastra. Segnare la posizione degli apici radicali con un pennarello, avvolgere con nastro adesivo chirurgico, e mantenere in camera cultura.
- Dopo una settimana, radici trasformate sono visti crescono sul terreno selettivo. Raccolto un sottocampione di radici trasformate per l'estrazione del DNA utilizzando il metodo del DNA di estrazione preferito. Nota: Piastre con cotiledoni possono essere conservati per 2 - 3 raccolti settimanalmente, dopo che indicano le radici crescono in un pasticcio aggrovigliato e sono difficili da isolare. tessuti radicali non raccolte possono essere mantenuti a tempo indeterminato. Una varietà di saggi può essere eseguita sul campione di DNA isolatas per determinare il DNA mutazione frequenza e tipo. I risultati di un paio di tali dosaggi sono descritti di seguito.
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Representative Results
CRISPR vettore costruzione con assemblaggio DNA genera tipicamente decine a centinaia di cloni indipendenti. Lo screening mediante PCR Colony identifica facilmente cloni corretti e in grado di distinguere tra i plasmidi con e senza inserti (Figura 2a) che è utile per la risoluzione dei problemi. Tipicamente, tutti i cloni contengono un inserto e un utente può scegliere di ignorare i passaggi di screening colonia del tutto. Digest diagnostici (Figura 2b) e il sequenziamento Sanger sono utilizzati per il controllo qualità. Quando si verificano errori, di solito sono osservati nelle regioni di DNA sovrapposte, cioè, 'estremità del promotore MtU6, il gRNA, o 3' del 5 fine della sequenza scaffold. Se più oligo gRNA vengono raggruppati in una singola reazione, i gRNAs sono determinati da Sanger sequenziamento. L'incorporazione dei singoli gRNAs è uniformemente distribuito e la maggior parte delle gRNAs può essere isolato da una singola trasformazione (Figura 2C (Figura 2C).
Pomodoro radici pelose si osservano di solito una o due settimane dopo la trasformazione (Figura 3A). Radici ≥2 cm di lunghezza sono escisse e trasferito al terreno selettivo e le radici kanamicina resistenti possono essere identificati una settimana dopo (Figura 3B). La maggior parte delle radici cresceranno in una certa misura su terreni selettivi e la crescita delle radici nelle radici trasformate può essere variabile; se possibile, selezionare i più vigorosamente crescita radici per l'analisi. Da uno a due radici kanamicina-resistenti sono in genere recuperati per cotyledon inoculato. Con trasferimenti regolari, radici trasformate possono essere mantenute a tempo indeterminato su terreni selettivi.
DNA viene estratto da radici kanamicina resistente e PCR è usato per amplify la regione di destinazione (s). I prodotti di PCR possono essere utilizzati in una varietà di saggi per determinare l'efficienza di mutazione, come la clonazione e il sequenziamento (Figura 3C), analisi di restrizione frammento lunghezza polimorfismo, SDS-PAGE 16 (Figura 3D), T7E1 endonucleasi 16, o ad alta produttività amplicon sequencing 10. Come riportato in altri sistemi CRISPR-pianta 6, a seconda della sequenza gRNA / target selezionato, si può osservare una serie di mutazioni e efficienze mutazione.
. Figura 1. Principio dell'Assemblea CRISPR Nella reazione di assemblaggio del DNA, DNA quattro sono mescolati insieme; p201N: Cas9 linearizzato con Swa I e Spe I (cerchio nero), promotore MtU6 (freccia verde), impalcatura (barra gialla) e il 60-mer oligo gRNA contenente la sequenza bersaglio GN 19 (bbar Lue). Le estremità di ogni molecola di DNA sovrapposizioni 20 bp con il pezzo adiacente. La reazione di assemblaggio del DNA ricombina questi DNA in un unico, molecola circolare. I siti di legame di primer StUbi3p218R e ISceIR sono indicati con frecce nere, il 2x35S: Cas9 cassetta è viola, il StUbi3: cassetta nptII è arancione e sinistra e destra sono indicati i confini con barre grigie. Nota:. Vector mappa non è in scala prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Screening Colony e plasmidi controllo di qualità. A) lo screening Colonia di 20 cloni di assemblaggio del DNA e la trasformazione. M, scala di 100 bp; +, P201N: Cas9: GFPT2 controllo positivo; NI, p201N: Cas9 di controllo non-insert; GA, DNA diluito reazione di montaggio; NT, no-modello di controllo. B) Rappresentante digest di quattro p201N: Cas9: vettori gRNA con gli enzimi di restrizione Eco RV e Sty I. M, 2-log scala. C) Confronto della fedeltà dello standard e ad alta fedeltà mix di assemblaggio del DNA e la distribuzione dei vettori recuperati quando 11 gRNA oligonucleotidi sono stati raggruppati in una singola reazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Culture Peloso radice e la rilevazione del DNA modifica. A) radici pelose può essere visto che emerge da cotiledoni 11 giorni dopo la trasformazione. B) Le radici sono selezionati sulla ½ MS Kan 50 supporti per circa una settimana. Barre grigie indicano la posizione di apici radicali al momento della placcatura. C) Esempio di clonazione esequenziamento per determinare mutazioni del DNA con due diversi obiettivi gene in quattro diversi eventi peloso-root. Casella grigia denota GN 20 GG sequenza bersaglio, Δ tipo di mutazione, e il numero di cloni con la mutazione indicato. D) Esempio di SDS-PAGE per determinare mutazioni del DNA indica. Grandi cancellazioni e bande eteroduplex indicano la presenza di mutazioni del DNA alle sequenze bersaglio. Sei dei 12 eventi indipendenti sono stati segnati come mutanti (Δ). WT, wild-type di controllo; NT, non-modello di controllo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation concessione IOS-1.025.642 (GBM). Ringraziamo Maria Harrison per fornire il ceppo ARqua1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
