Summary
Met behulp van DNA assembly kunnen meerdere CRISPR vectoren parallel worden geconstrueerd in een enkele klonen reactie, waardoor de bouw van grote aantallen vectoren CRISPR een eenvoudige taak. Tomaat harige wortels zijn een uitstekend model systeem om CRISPR vectoren te valideren en het genereren van mutant materialen.
Introduction
De mogelijkheid om gerichte DNA wijzigingen met CRISPR genereren / Cas9 heeft een groot potentieel voor functionele genomica studies. Er zijn twee onderdelen van het CRISPR / Cas9 systeem; de Cas9 nuclease afgeleid van Staphylococcus pyogenes en een ongeveer 100-nt guide RNA (gRNA) molecuul dat Cas9 doorstuurt naar de target DNA site (s) 1. Beeldherkenning wordt verleend door de eerste ~ 20-nt van het gRNA, die zorgt voor high-throughput productie van richtende vectoren 2,3. De meeste organismen die kunnen worden gemanipuleerd, reeds CRISPR / Cas9 technologie 4,5 hebben.
In planten, constitutieve promoters, zoals de CaMV 35S promotor, worden vaak gebruikt om de expressie van de Cas9 nuclease 6 rijden. De gRNAs worden uitgedrukt in het RNA-polymerase III U6 en U3 promotors die de eerste base van het gRNA beperkt tot hetzij een G voor U6 of A U3, voor efficiënte transcriptie. Maar RNA-polymerase II promoters, die vrij zijn van deze beperkingen zijn, zijn ook gebruikt 7,8.
Verschillende gRNAs induceren DNA-mutaties met verschillende rendementen, en dus kan het belangrijk zijn om eerst te valideren CRISPR geblokkeerd voordat investeren in hele plant transformaties of het opzetten van een uitgebreide fenotypische schermen. Tijdelijke expressie van CRISPR constructen in planten, met agroinfiltration bijvoorbeeld algemeen in een lagere frequentie van DNA modificatie vergeleken met stabiele planten 6, wat detectie van mutaties en fenotypische testen moeilijk onpraktisch met dergelijke benaderingen. Zogenaamde haarwortels is een handig, alternatief systeem aangezien een groot aantal onafhankelijke stabiel getransformeerde materialen binnen weken kan worden gegenereerd, in plaats van maanden stabiele planten. CRISPR vectoren zijn zeer effectief in het induceren van mutaties in DNA haarwortels 9,10.
DNA assemblagemethoden efficiënt ligeren DNA-fragmenten die overlapping 11 eindigt. Een belangrijk voordeel van een aantal DNA montagemethoden is de mogelijkheid om ssDNA (dwz oligo) nemen in de samengestelde producten. Aangezien gRNAs slechts ~ 20-nt lange en nieuwe doelen kunnen worden gesynthetiseerd met oligo deze DNA montagemethoden zijn geschikt voor CRISPR klonen. De hier beschreven protocollen zijn gebaseerd op de P201 serie CRISPR vectoren die met succes is toegepast in sojabonen 10, 12 en populier nu tomaat. De kloneringswerkwijze gepresenteerd biedt verscheidene voordelen boven de huidige werkwijze 10 klonen. Namelijk, kan volledig functionele vectoren in één klonen reactie in een enkele dag worden gegenereerd. Vector constructie kan ook worden samengevoegd om meerdere CRISPR vectoren parallel genereren, hands-on tijd en materiële kosten verder te verlagen. Ook presenteren een protocol voor het genereren van tomaat haarwortels een efficiënte methode om transgene materialen doelgen deleties te produceren. Harige wortels worden gebruikt om geldigeat de CRISPR vectoren en voorzien materiaal voor verdere experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Guide RNA Ontwerp en Vector Construction
- Identificeer doelwitsequenties voor de genen van belang. Er zijn diverse online CRISPR doelsoorten vinden programma's die geschikt zijn voor deze stap 13,14.
LET OP: Hier gebruiken we de GN 20 GG doel motief, maar ook andere ontwerpen kunnen geschikt zijn, afhankelijk van de toepassing of vector systeem dat wordt gebruikt. - Ontwerp 60-meer oligo gRNA de GN 19 gedeelte van de doelwitmotieven geflankeerd door 5 'en 3' 20 nt-sequenties die nodig zijn voor DNA opstelling aan. De uiteindelijke 60-mer motief is: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
OPMERKING: Standaard, ontzout primers werken prima. - Bereid de vier DNA's voor de montage (figuur 1). Zie aanvullende bestand voor DNA-sequenties.
- Digest 1-5 ug p201N: Cas9 10 plasmide met het restrictie-enzym SpeI in 1x Buffer 4 bij 37 ° C gedurende 2 uur. Column-zuiveren het verteren eenolgens instructies van de fabrikant. Resuspendeer in ~ 15 ui 10 mM Tris-HCl en kwantificeren door UV spectrofotometrie.
- Voer een tweede digest met het restrictie-enzym SwaI in 1x buffer 3,1 bij 25 ° C gedurende 2 uur. Raadpleeg 100-200 ng op een 0,8% agarosegel om volledige digestie bevestigen.
LET OP: Een correct verteerd plasmide zal een enkele band hebben op 14.313 bp. Noot: Hitte inactivatie van het enzym en defosforylatie zijn niet vereist. Het gedigesteerde plasmide kan worden bewaard bij -20 ° C. - PCR versterken de Medicago truncatula (Mt) U6 promotor en steiger DNA's uit de pUC gRNA Shuttle 10 plasmide met behulp van de primers Swa I_MtU6F / MtU6R en ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, respectievelijk. Gebruik een high-fidelity polymerase met de PCR-condities: 95 ° C gedurende 3 min; 31 cycli (98 ° C gedurende 20 seconden, 60 ° C gedurende 15 sec, 72 ° C gedurende 30 sec); en 72 ° C gedurende 5 minuten.
- Visualiseer ~ 3 ui porties van PCR producten op een 1% agarosegel om amplificatie te bevestigen. De MtU6 amplicon is 377 bp en het schavot amplicon is 106 bp. Kolom zuiveren resterende PCR producten volgens de voorschriften, gekwantificeerd door UV-spectrofotometrie en bewaar bij -20 ° C.
- Resuspendeer de hele tube gRNA oligo tot 100 urn in het laboratorium-grade water. Voeg 1 pl 100 pM oligo aan 500 pl 1x Buffer 2,1. Goed mengen. Als pooling meerdere oligos, voeg 1 pl van elk 100 uM oligo het 1x Buffer 2,1 tube. Verdunde oligo's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
- Programmeer een thermocycler te houden bij 50 ° C, onder toepassing van een verwarmde deksel. Combineer 100 ng (0,011 pmol) gelineariseerd vector, 50 ng (0,2 pmol) van MtU6 promoter, 12 ng (0,2 pmol) van steiger, 1 gl (0,2 pmol) verdund gRNA oligo (s) en water tot een volume van 5 pl. Voeg 5 ul van 2x high-fidelity DNA assemblage master mix, meng goed en spin down. Incubeer reactie gedurende 60 min in50 ° C PCR-apparaat. Plaats vervolgens de reactie op het ijs.
Opmerking: Reactie volumes kan worden verhoogd tot lage DNA opbrengsten tegemoet te komen. - Transformatie 2 ul van het reactiemengsel in competente E. coli-cellen met behulp van standaardtechnieken en plaat op LB aangevuld met 50 mg L -1 kanamycine (Kan 50). Kweek-cellen uitgeplaat bij 37 ° C overnacht. Sla de resterende DNA assemblage reactie bij -20 ° C.
- Kolonie scherm door middel van PCR met behulp van de primers StUbi3P218R en ISceIR. Verdun een aliquot van het overgebleven DNA samenstel reactie met water 1: 5. Gebruik 1 pl als een positieve controle voor de kolonie scherm en 1 ng van circulaire p201N: Cas9 plasmide als een no-insert controle.
- PCR versterken met de voorwaarden; 95 ° C gedurende 3 min; 31 cycli (95 ° C gedurende 30 sec, 58 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 30 sec); en bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Visualiseren PCR producten op een 1% agarosegel. Zorg ervoor dat de juiste inserties hebben een band bij 725 bp en vectoren without inzetstukken (bijvoorbeeld ongesneden vector) zal een 310-bp band hebben.
- Positieve kolonies groeien in LB-Kan 50 vloeibare kweken overnacht bij 37 ° C en zuiveren plasmiden volgens de instructies van de fabrikant. Sanger reeks plasmiden met de StUbi3P218R primer en lijn chromatogrammen aan de MtU6 promotor, doel, en steiger sequenties om ervoor te zorgen tijdens het klonen werden geen fouten geïntroduceerd.
- Voer een diagnostische verteren door het verteren van ~ 1 ug plasmide met Eco RV en Sty I. Visualiseren op een 0,8% agarosegel. Fragmenten (in bp) zijn: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318 en 174.
- Gebruik DNA assemblage te construeren met meerdere gRNAs.
- Een vector met twee cassettes gRNA construeren, PCR amplificeren van de eerste positie gRNA de primers Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR en de tweede positie gRNA de primers UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR van 1 ng van elk van de respectieveplasmiden geconstrueerd stappen 1,1-1,8. Met de PCR-omstandigheden in stap 1.3.3. Visualiseren ~ 3 gl aliquots van de PCR producten op een 1% agarosegel om amplificatie te bevestigen. Amplicons zijn ~ 500 bp.
- Combineer en meng ongeveer gelijke hoeveelheden un gezuiverde PCR producten in een 200 pl buis (gewoonlijk 3-4 pl elk). Voor de montage, voeg 1 pl gecombineerd PCR-producten, 50 ng van Swa I en Spe I gelineariseerd p201N: Cas9, laboratorium-grade water tot 2,5 pi en 2,5 pi van 2x high-fidelity DNA assemblage master mix. Incubeer in een 50 ° C thermische cycler gedurende 15 min.
Opmerking: De DNA opbouwinstructies beveelt een 15 min incubatie gedurende 2 - 3 fragmenten. - Transformeer 1-2 pi in competente E. coli-cellen en plaat op LB Kan 50. Kweek cellen uitgeplaat bij 37 ° C overnacht. Sla de resterende reactie bij -20 ° C.
- Kolonie scherm door middel van PCR met primers StUbi3P218R en ISceIR met dezelfde voorwaarden als stap 1.6. correct cLones zal een 1200 bp amplicon hebben. Groeien positieve kolonies in LB Kan 50 vloeibare kweken 's nachts en te zuiveren plasmiden.
- Sanger reeks plasmiden met de primers StUbi3P218R (beslaat de eerste positie gRNA) en p201R (dekt tweede positie gRNA). Lijn chromatogrammen aan de MtU6 promotor, doel, en steiger sequenties. Diagnostische verteren met EcoRV en Styl zal resulteren in de volgende fragmenten (in bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Vetgedrukte fragment bevat de tweede gRNA.
- Na een ontmoeting met alle kwaliteitscontrole verwachtingen van het transformeren plasmiden in Agrobacterium rhizogenes stam ARqua1 15. Voeg 1 pl van het plasmide prep tot 50 pi elektrocompetente cellen en electroporate in een 1 mm cuvette met instellingen: 2,4 kV, 25 uF en 200 Ω. Herstel cellen in ~ 500 pi SOC en schud bij 28 ° C gedurende 2 uur. Plaat op LB Kan 50 en grij bij 28 ° C gedurende 2 dagen. Voer kolonie scherm met behulp van dezelfde primers en PCR-omstandigheden als 1.3.3. Maak glycerol voorraden van positieve klonen.
2. Hairy Root Transformation
- Steriliseren tomatenzaad in 20% bleekmiddel voor 15 minuten onder constant mengen. In een laminaire stroming kap, verwijder het bleekmiddel en wassen in steriel laboratorium-grade water 3 keer.
- Plate 30 zaden in een GA-7 doos met ½ MS media (2,22 g L -1 MS-zouten + Gamborg vitaminen, 10 g L -1 sucrose, 3 g L -1 gellangom, pH 5,8). Kiemen voor ~ 2 dagen in het donker, ga dan GA-7 dozen aan het licht. Groei zaailingen voor ~ 4 dagen in het licht.
- De dag voor de transformatie, streak uit A. rhizogenes kweken op vaste LB Kan 50 en groeien bij 28 ° C overnacht.
- Dag van de transformatie, in de laminaire stroming kap monteren steriele materialen: 12 ml cultuur buizen, 50 ml conische buis, ½ MS vloeistof (geen gellan gum), 200 uM acetosyringoon, filterpapier, petrischaaltjes, pincet en scalpel, pipetten en pipetpunten. Voeg 25 ul van acetosyringoon 50 ml ½ MS en giet ~ 6 ml in elk kweekbuis.
- Gebruik een gebogen 200 ul tip om A. te schrapen rhizogenes cellen van de plaat en resuspendeer in 6 ml ½ MS vloeistof. Vortex de buis volledig resuspendeer de cellen. Na resuspenderen van cellen van elke vector, meet de optische dichtheid (OD) van 1 ml cellen bij een vaste golflengte van 600 nM. Zorgen OD tussen 0,2 en 0,4; verdunnen of voeg meer cellen als dat nodig is. Herhaal dit voor elk construct.
- Voeg ~ 2 ml ½ MS vloeistof naar een petrischaal met een steriel filtreerpapier. Accijnzen zaadlobben van de zaailingen en plaats op het bevochtigde filterpapier. Zodra alle zaadlobben zijn verzameld, snijd de distale ~ 1 cm af van de zaadlobben, wat resulteert in zaadlob stukken met twee afgesneden einden. Explantaten toevoegen aan A. rhizogenes oplossingen, meng en incubeer gedurende 20 minmet af en toe omkeren.
Opmerking: Ongeveer 12 explantaten per construct worden routinematig gebruikt, maar liefst 80 explantaten werden geïnoculeerd in 6 ml A. rhizogenes oplossing. - Tijdens de A. rhizogenes incubatie, voeg filter papier petrischaaltjes, één per construct getransformeerd. Ook ½ MS vast medium, geen antibiotica, in de laminaire stroming kap drogen.
- Schep zaadlobben uit A. rhizogenes oplossing met een steriel pincet en leg ze op een droge filter papier. Dek af met Petri deksel om ervoor te zorgen weefsels niet uitdrogen, terwijl u doorgaat naar de volgende transformatie. Blot zaadlobben op het filter papier en de overdracht, abaxiale kant naar boven, naar MS media ½. Wikkel platen met chirurgische tape en co-kweken in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen.
- Na co-kweek, overdracht zaadlobben, abaxiale kant naar boven, tot ½ MS medium aangevuld met 300 mg L -1 ticarcilline / clavulaanzuur (Tim 300, om de groei van residu voorkomenUAL A. rhizogenes) en Kan 50 (voor de plantaardige selection) en wikkel met chirurgische tape. Handhaaf culturen onder tl-verlichting bij kamertemperatuur met een 16-uur fotoperiode.
- Na ~ 1,5-2 weken wortels ten minste 2 cm lang zijn uitgesneden uit de zaadlobben met steriele pincet en een scalpel en overgebracht naar MS Kan 50 Tim 300 media ½. Transfer 10-15 wortels tot een enkele plaat. Markeer de positie van de wortel tips met een marker, wrap met chirurgische tape, en onderhouden in cultuur kamer.
- Na één week, worden omgezet wortels zien groeien op de selectieve media. Oogst een subgroep van getransformeerde wortels voor DNA-extractie met behulp van de gewenste DNA-extractie methode. Noot: Platen met zaadlobben worden gedurende 2-3 wekelijks oogsten, waarna punt de wortels groeien tot een wirwar en moeilijk te isoleren. Niet geoogste wortel weefsels kan onbeperkt worden gehandhaafd. Verschillende testen kunnen worden uitgevoerd op de geïsoleerde DNA-monsters DNA mutatiefrequentie en -type te bepalen. Resultaten van een paar van zulke assays worden hieronder beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CRISPR vectorconstructie met DNA samenstel genereert doorgaans tientallen tot honderden onafhankelijke klonen. Kolonie screening door PCR identificeert eenvoudig juiste klonen en kunnen onderscheiden plasmiden met en zonder inzetstukken (Figuur 2A) dat bruikbaar is voor het oplossen van problemen. Typisch, alle van de klonen bevatten een insert en een gebruiker kan kiezen om de kolonie screeningsstappen helemaal overslaan. Diagnostic verteert (Figuur 2B) en Sanger sequencing worden gebruikt voor kwaliteitscontrole. Wanneer fouten optreden, zijn ze meestal waargenomen in de overlappende DNA-gebieden, namelijk het 5 'uiteinde van de promoter MtU6 de gRNA, of het 3' uiteinde van het skelet sequentie. Als meerdere gRNA oligo worden samengevoegd in een enkele reactie worden de gRNAs bepaald door Sanger sequentiebepaling. De opname van afzonderlijke gRNAs wordt gelijkmatig verdeeld en de meeste gRNAs kan worden geïsoleerd uit een enkele transformatie (figuur 2C (figuur 2C).
Tomaat harige wortels worden meestal waargenomen 1-2 weken na transformatie (figuur 3A). Wortels ≥2 cm lang worden uitgesneden en overgebracht naar selectief medium en kanamycine-resistente wortels één week later (figuur 3B) worden geïdentificeerd. De meeste wortels groeien tot op zekere hoogte op selectieve media en wortelgroei in getransformeerde wortels kan worden aangepast; indien mogelijk, selecteert u de meest krachtig groeiende wortels voor analyse. Een tot twee kanamycine-resistente wortels worden typisch teruggewonnen per cotyledon geïnoculeerd. Met regelmatige transfers, kan getransformeerd wortels voor onbepaalde tijd worden gehandhaafd op selectieve media.
DNA wordt geëxtraheerd uit voor kanamycine resistente wortels en PCR wordt gebruikt versterker;y het doelgebied (s). PCR producten kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid aan assays mutatie efficiëntie, zoals klonering en sequencing (figuur 3C), restrictie fragment lengte polymorfisme analyse polyacrylamidegelelektroforese 16 (figuur 3D), T7E1 endonuclease 16 of high-throughput amplicon sequencing bepalen 10. Zoals gemeld in andere plantensystemen CRISPR-6, afhankelijk van het gRNA / doelsequentie geselecteerd, kan een reeks mutaties en mutatie rendementen waargenomen.
. Figuur 1. Principe van CRISPR Assemblage in de DNA samenstel reactie vier DNA worden gemengd; p201N: Cas9 gelineariseerd met Swa I en Spe I (zwarte cirkel), MtU6 promotor (groene pijl), Steiger (gele balk) en de 60-mer gRNA oligo met de GN 19 doelsequentie (blue bar). De uiteinden van elk DNA-molecuul 20 bp overlapt met het aangrenzende stuk. De DNA-assemblage reactie Combineert deze DNA in één cirkelvormig molecuul. De StUbi3p218R en ISceIR primer bindingsplaatsen worden aangegeven met zwarte pijlen, de 2x35S: Cas9 cassette is paars, de StUbi3: nptII cassette is oranje en links en rechts grenzen worden aangegeven met grijze balken. Let op:. Vector kaart is niet op schaal Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Colony Screening en Plasmid Quality Control. A) Kolonie screenen van 20 klonen van DNA-assemblage en transformatie. M, 100 bp ladder; +, P201N: Cas9: GFPT2 positieve controle; NI, p201N: Cas9 no-insert controle; GA, verdund DNA assemblage reactie; NT, no-template controle. B) Representatieve samenvatting van vier p201N: Cas9: gRNA vectoren met de restrictie-enzymen Eco RV en Sty I. M, 2-log ladder. C) Vergelijking van trouw van de standaard en high-fidelity DNA assemblage mixen en distributie van teruggewonnen vectoren als 11 gRNA oligo's werden samengevoegd tot één reactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Hairy Root culturen en detectie van DNA Modificatie. A) harige wortels te zien die uit zaadlobben 11 dagen na transformatie. B) wortels worden geselecteerd op ½ MS Kan 50 media voor ongeveer een week. Grijze staven geven positie van wortel tips op het moment van de beplating. C) Voorbeeld van het klonen ensequencing om DNA-mutaties met twee verschillende genen doelwitten te bepalen in vier verschillende hairy-root events. Grijs vakje geeft aan dat GN 20 GG doelsequentie, geeft Δ type mutatie en het aantal klonen met de vermelde mutatie. D) Voorbeeld van polyacrylamide gelelektroforese DNA mutaties te bepalen. Grote deleties en heteroduplex banden de aanwezigheid van DNA mutaties op de doelsequenties. Zes van de 12 onafhankelijke evenementen werden gescoord als mutanten (Δ). WT, wild-type controle; NT, no-template controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de National Science Foundation subsidie IOS-1025642 (GBM). Wij danken Maria Harrison voor het verstrekken van de ARqua1 stam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
