Summary
DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。
Introduction
CRISPR / Cas9で標的DNAの変更を生成する能力は、機能的ゲノム研究のための大きな可能性を秘めています。 CRISPR / Cas9システムの2つのコンポーネントがあります。 ブドウ球菌化膿連鎖球菌と、標的DNA部位（複数可）1にCas9を指示およそ100-ntのガイドRNA（gRNA）分子に由来Cas9ヌクレアーゼ、。標的認識は、最初にによって与えられる〜ターゲティングベクター2,3の高スループット生産を可能にするgRNA、20-NT。操作することができるほとんどの生物は、既にCRISPR / Cas9技術4,5とされています。
植物では、例えば、CaMV35Sプロモーターなどの構成的プロモーターは、一般にCas9ヌクレアーゼ6の発現を駆動するために使用されます。 gRNAsはgRNAの最初の塩基を制限するRNAポリメラーゼIII U6またはU3プロモーターを用いて表現しているのいずれかG、効率的な転写のためのU3のためのU6、またはA、のために。しかし、RNAポリメラーゼIIのプロムこれらの制限のないotersも、7,8を使用されています。
異なるgRNAsは異なる効率を有するDNAの突然変異を誘発し、最初に全植物の形質転換に投資するか、大規模な表現型の画面を設定する前に、CRISPRベクトルを検証するために重要であり得ます。植物におけるCRISPRコンストラクトの一過性発現は、例えば、アグロインフィルトレーションを使用して、一般的なアプローチでは非実用的変異の検出が困難と表現型のアッセイを行うこと、安定した植物体6と比較して、DNA修飾の低い周波数になります。いわゆる毛状根は、安定した植物についてヶ月とは対照的に独立した、安定に形質転換された材料の多くは、数週間以内に発生させることができるので便利で、代替システムです。 CRISPRベクターは、毛状根9,10においてDNA突然変異を誘発するのに非常に効果的です。
DNAアセンブリ方法は、効率的overlを含むDNA断片を連結しますappingは11を終了します。いくつかのDNAの組み立て方法の主な利点は、組み立てられた製品へのssDNA（ すなわち 、オリゴ）を組み込む能力です。 gRNAsのみ〜20ヌクレオチド長であり、新たなターゲットが合成オリゴを用いて作製することができるので、これらのDNAアセンブリ方法は、CRISPRクローニングに適しています。ここに記載されたプロトコルが正常に大豆10、ポプラ12で使用され、現在はトマトされたCRISPRベクトルのP201シリーズに基づいています。提示クローニング手順は、現在のクローニング法10の上にいくつかの利点を提供しています。すなわち、完全に機能的なベクターは、1日に単一クローニング反応で生成することができます。ベクター構築はさらに手をオン還元時間と材料費、並行して複数のCRISPRベクトルを生成するためにプールすることができます。我々はまた、標的遺伝子の欠失を有するトランスジェニック材料を製造するための効率的な方法として、トマト毛状根を生成するためのプロトコルを提示します。毛状根を有効に使用されていますCRISPRベクトルを食べ、その後の実験のための材料を提供します。
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Protocol
1.ガイドRNAの設計とベクター構築
- 目的の遺伝子のための標的配列を同定します。このステップ13,14に適したオンラインCRISPRターゲット発見の様々なプログラムがあります。
注：ここでは、GN 20 GGの標的モチーフを使用していますが、他の設計は、使用するアプリケーションまたはベクターシステムに応じて適切であり得ます。 - DNAの組み立てに必要とされる5 'および3' 20-ntの配列が隣接標的モチーフのGN 19の部分を含むようにデザイン60-merのgRNAオリゴ。最終的な60マーモチーフはある：5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3」。
注：標準、脱塩したプライマーは正常に動作します。 - アセンブリのための4つのDNA（ 図1）を準備します。 DNA配列のための補足ファイルを参照してください。
- 2時間37℃で1×緩衝液4中の制限酵素のSpeIとCas9 10プラスミド：p201N5μgの- 1ダイジェスト。ダイジェスト列は、浄化します製造元の指示にccording。 〜10 mMトリス - 塩酸15μlのを中に再懸濁し、UV分光光度法により定量化します。
- 第2時間、25℃で1×緩衝液3.1に制限酵素SWA Iで消化を行います。完全な消化を確認するために、0.8％アガロースゲル上でngの200から100を確認してください。
注：正しく消化されたプラスミドは、14313塩基対で単一のバンドを持っています。注：酵素や脱リン酸化の熱不活性化は必要ありません。消化されたプラスミドは、-20℃で保存することができます。 - PCRは、それぞれ、プライマーSWA I_MtU6F / MtU6RとScaffoldF / Speを I_ScaffoldRを使用してのpUC gRNAシャトル10プラスミドからのMedicago truncatula（MT）U6プロモーターと足場のDNAを増幅します。 PCR条件と高忠実度ポリメラーゼ使用：3分間95℃。 （15秒、30秒、72℃20秒間、98℃、60℃）を31サイクル;そして5分間72℃。
- PCR PRの〜3μlのアリコートを可視化増幅を確認するために1％アガロースゲル上でoducts。 MtU6アンプリコンは377 bpであり、足場のアンプリコンは106 bpです。 -20℃でUV分光光度法およびストアによって定量化、製造者の指示に従って、残りのPCR産物をカラム精製します。
- 実験室グレードの水中で100μMのgRNAオリゴの管全体を再懸濁します。バッファー（1x）2.1の500μlに100μMオリゴの1μLを加えます。よく混ぜます。複数のオリゴをプールする場合は、バッファー（1x）2.1管に各100μMのオリゴの1μlを添加します。希釈されたオリゴは、-20℃で保存することができます。
- 加熱蓋を使用して、50℃で保持するためのサーマルサイクラーをプログラムします。 MtU6プロモーターの線形化ベクター100ng（0.011ピコモル）、50 ngの（0.2ピコモル）、12 ngの足場の（0.2ピコモル）、希gRNAオリゴ（複数可）の1μL（0.2ピコモル）、および水の体積にコンバイン5μlの。 、2倍の高忠実度DNAアセンブリマスターミックスの5μLを加え、よく混ぜるとスピンダウン。 60分間反応をインキュベート50°Cサーマルサイクラー。その後、氷上で反応を置きます。
注：反応容量は低いDNA収量を収容するように増加させることができます。 - コンピテントE.への反応の2μLを変換します50 mgのLを-1カナマイシン（菅50）を補充したLB上の標準的な技術やプレートを使用して大腸菌細胞。 37℃で一晩平板培養細胞を成長させます。 -20℃で、残りのDNA集合反応を保存します。
- プライマーStUbi3P218RとISceIRを用いたPCRによるコロニー画面。 5：水1で、残りのDNAアセンブリ反応のアリコートを希釈します。無挿入制御などCas9プラスミド：陽性コロニー画面の制御と円形p201N 1ngのよう1μLを使用してください。
- PCR条件で増幅します。 3分間95°C; 31サイクル（30秒95℃、30秒間58℃、30秒間72°C）。そして5分間72℃。 1％アガロースゲル上でPCR産物を可視化します。正しい挿入は725 bpおよびベクトルウィットでバンドを持っていることを確認してくださいハウトインサート（ 例えば 、切断されていないベクトル）310-bpのバンドを持っています。
- 37℃で一晩LB菅50液体培養で陽性コロニーを成長させ、製造元の指示に従ってプラスミドを精製します。サンガーシーケンスはStUbi3P218Rプライマーとプラスミドとエラーがクローニング中に導入されなかった確実にするためにMtU6プロモーター、ターゲット、および足場配列にクロマトグラムを揃えます。
- エコ RVおよびSTY Iでプラスミドの〜1μgのを消化することによってダイジェスト診断を実行します0.8％アガロースゲル上で可視化します。 （塩基対で）断片は、以下のとおりです。4192、2001、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318、および174。
- 複数gRNAsでベクターを構築するためにDNAのアセンブリを使用してください。
- 2 gRNAカセットを有するベクターを構築するために、PCRは、それぞれの各1 ngのからUNS1_MtU6F / Speを I_ScaffoldRプ ライマーを用いてプライマーSWA I_MtU6F / UNS1_ScaffoldRと第2の位置gRNAで最初の位置gRNAを増幅します1.8 - 手順1.1で構築したプラスミド。ステップ1.3.3でPCR条件を使用してください。増幅を確認するために1％アガロースゲル上でPCR産物の〜3μlのアリコートを視覚化します。アンプリコンは〜500bpです。
- 合わせて、200μlの管に未精製のPCR産物のほぼ等量を混合（典型的には3 - 各4μlの）。アセンブリのために、PCR産物を組み合わせた1μlを添加、SWA IおよびSpeの50 ngのは、私がp201N直線化：2.5μlのと2倍の高忠実度DNAアセンブリマスターミックスの2.5μlにCas9、実験室グレードの水を。 15分間50℃でサーマルサイクラーでインキュベートします。
注：DNA組立マニュアル2のための15分間のインキュベーションをお勧めします - 3断片を。 - コンピテントE.に2μlの- 1を変換しますLBカン50上の大腸菌細胞とプレート。 37℃で一晩播種した細胞を成長させます。 -20℃で残りの反応を保存します。
- ステップ1.6と同様の条件でプライマーStUbi3P218RとISceIRを用いたPCRによるコロニー画面。正しいClonesは1200 bpのアンプリコンを持つことになります。 LB館で陽性コロニー50の液体培養物を、一晩増殖し、プラスミドを精製します。
- プライマーStUbi3P218R（最初の位置gRNAをカバー）とp201R（第2位置gRNAをカバー）とサンガーシーケンスプラスミド。 MtU6プロモーター、ターゲット、および足場配列にクロマトグラムを合わせます。 エコ RVおよびSTYと診断ダイジェスト私は（塩基対で）以下の断片になります：4192、2476、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318、174太字の断片は、第二gRNAが含まれています。
- すべての品質管理の期待に応えた後、 アグロバクテリウム・リゾゲネス株ARqua1 15にプラスミドを形質転換します。 2.4 kVの、25μF、および200Ω：設定で1ミリメートルのキュベット内のエレクトロ細胞とエレクトロポレーションの50μlに、プラスミドプレップの1μlを添加します。 SOCの〜500μlの中で細胞を回収し、2時間28℃で振とうします。 LB菅50とグラム上のプレート2日間28℃で行。 1.3.3と同じプライマー及びPCR条件を用いたコロニー画面を実行します。陽性クローンからグリセロールストックを作ります。
2.毛状根形質転換
- 一定に混合しながら、15分間、20％の家庭用漂白剤でのトマトの種子を滅菌します。層流フード中で、漂白剤を除去し、無菌実験室グレードの水で3回洗浄します。
- ½MS培地（2.22グラムのL -1 MS塩+ガンボーグビタミン、10グラムのL -1スクロース、3グラムL -1ジェランガム、pHは5.8）を含むGA-7ボックス内のプレート30の種子。光にGA-7ボックスを移動した後、暗所で〜2日間発芽。光の中で〜4日分以上の苗を育てます。
- 変換前の日、ストリークアウトA.固体LBカン50の文化をリゾゲネス 、一晩28℃で成長します。
- 変態の日、層流フード内で無菌の材料組み立てる：12ミリリットル培養管を、50mlコニカルチューブ1/2 MS液体（無ゲラングラムUM）、200μMのアセトシリンゴン、濾紙、ペトリ皿、ピンセットやメス、ピペット及びピペットチップ。 1/2 MS 50mlにアセトシリンゴンの25μlを添加して、各培養チューブに〜6ミリリットルを注ぎます。
- A.をこすりするために曲がった200μlのチップを使用します½MS液体の6ミリリットル中にプレートを再懸濁からリゾゲネス細胞 。ボルテックスチューブは完全に細胞を再懸濁します。各ベクターからの細胞を再懸濁した後、600 nMでの固定波長で細胞を1mlの光学密度（OD）を測定します。 ODが0.2と0.4の間であることを確認します。希釈又は、必要に応じて複数のセルを追加します。各構築物について、この手順を繰り返します。
- 滅菌ろ紙でペトリ皿にの1/2 MS液体〜2ミリリットルを追加します。湿らせたろ紙上の苗木と場所から消費税子葉。一旦全ての子葉は、2つの切断端部を有する子葉片で、その結果、子葉のオフ遠位〜1cmにカットし、収集されました。 A.に外植片を追加します。 リゾゲネス溶液は、混合し、20分間インキュベート時折反転しています。
注意：構造物あたり約12の外植片が日常的に使用され、多くの80として外植片をA. 6mlに接種されているもののリゾゲネスソリューション 。 - A.間、 リゾゲネスのインキュベーション、1あたりの構築物は、形質転換、ペトリ皿にろ紙を追加します。また、乾燥する層流フードで、½MS固形培地、抗生物質なしを設定します。
- A.から子葉をスクープ乾燥ろ紙上の滅菌ピンセットと場所とリゾゲネスソリューション 。次の変換処理中に、組織が乾燥しないようにペトリ蓋でカバーしています。 MS培地を1/2にろ紙と転送、背軸側を上にブロット子葉、。外科手術用テープでプレートをラップし、2日間室温で暗所での共同開拓。
- 共培養した後、子葉を転送し、背軸側を上に、残油の成長を防止するために、300 mgのLを添加したMS培地-1チカルシリン/クラブラン酸（ティム300を 、1/2にUALのA.リゾゲネス ）とカン50（植物選択用）および外科テープで包みます。 16時間の光周期で、室温で蛍光灯の下での培養を維持します。
- 長さは2週間の根2cm以上滅菌ピンセットやメスを使用して、子葉から切り出し、MSカン50ティム300メディアを1/2に転送されます- 〜1.5後。単一のプレートに10〜15の根を転送します。マーク・マーカーと根の先端の位置、外科手術用テープでラップし、培養室で維持します。
- 一週間後、形質転換された根は、選択培地上で成長が見られます。好適なDNA抽出法を用いて、DNA抽出のための形質転換根のサブサンプルを収穫。注：子葉を持つプレートは2のために保つことができる - もつれた混乱に成長し、単離することが困難である根を指した後3週ごとの収穫、。非収穫根組織を無期限に維持することができます。種々のアッセイは、単離されたDNA試料に対して実施することができますDNA変異の頻度及び種類を決定することです。いくつかのこのようなアッセイの結果を以下に記載します。
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Representative Results
DNAアセンブリとCRISPRベクター構築は、一般的に独立したクローンの数十〜数百を生成します。 PCRによるコロニーのスクリーニングは簡単なトラブルシューティングのために有用である（ 図2A）の正確なクローンを識別し、インサートを有するとせずに、プラスミドを区別することができます。一般的に、クローンのすべては、インサートを含み、ユーザが完全にコロニースクリーニングのステップをスキップすることを選ぶことができます。診断消化物（ 図2B）およびサンガー配列決定は、品質管理のために使用されます。エラーが発生した場合、それらは通常、重複するDNA領域において観測される、すなわち 、5 'MtU6プロモーターの端、gRNA、または3'骨格配列の終わり。複数gRNAオリゴは、単一の反応にプールされている場合は、gRNAsは、サンガー配列決定によって決定されます。個々 gRNAsの取り込みを均一に分布され、gRNAsのほとんどは、単一の変換（ 図2Cから単離することができます図2C）です。
トマト毛状根は、通常の変換（ 図3A）の2週間後に1を観察しています。長さのルーツ≥2センチ切除し、選択培地とカナマイシン耐性ルートが1週間後（ 図3B）を同定することができるに転送されます。ほとんどの根は選択培地上である程度成長すると形質転換根における根の成長を可変することができます。可能な場合は、分析のために最も活発に成長している根を選択します。 2カナマイシン耐性ルーツへの一つは、一般的に接種した子葉ごとに回収されます。定期的に転送して、形質転換された根は、選択培地上で無期限に維持することができます。
DNAは、カナマイシン耐性の根から抽出され、PCRはamplifするために使用されyの標的領域（複数可）。 PCR産物は、クローニング及び配列決定（ 図3C）、制限断片長多型分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動16（ 図3D）、T7E1エンドヌクレアーゼ16、またはハイスループットアンプリコン配列決定、突然変異率を決定するために、種々のアッセイにおいて使用することができます10。選択gRNA /標的配列に応じて、他のCRISPRプラントシステム6に報告されているように、突然変異および変異の効率の範囲を観察することができます。
CRISPRアセンブリの図1の原理 DNAアセンブリ反応では、4つのDNAを一緒に混合します。 p201N：SWA IおよびSpe I（黒丸）、MtU6プロモーター（緑の矢印）、足場（黄色のバー）とGN 19標的配列を含む60-merのgRNAオリゴ（bであるCas9は線形化LUEバー）。各DNA分子の末端は、隣接する部品との20bpのオーバーラップします。 DNAの集合反応は、単一の環状分子にこれらのDNAを再結合します。結合部位StUbi3p218RとISceIRプライマーは、黒い矢印で示さ2x35SされていますCas9カセットは紫で、StUbi3：nptII遺伝子カセットは、オレンジと左と右の境界線が灰色の棒で示されています。注意：ベクトル地図は縮尺通りではないです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.コロニーのスクリーニングおよび DNAアセンブリおよび形質転換から20個のクローンのプラスミド品質管理。A） は、コロニースクリーニング。 M、100-bpのラダー。 +、p201N：Cas9：GFPT2ポジティブコントロール。 NI、p201N：Cas9無挿入コントロール。 GA、希釈されたDNAの集合反応。 NT、無鋳型対照Cas9：制限付きgRNAベクトルがエコ RVおよびSTY I.酵素。4 p201NのB）代表ダイジェストM、2-ログラダー。C）標準および高忠実度DNAアセンブリミックスと11 gRNAオリゴは、単一の反応にプールした回収されたベクトルの分布の忠実度の比較。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.毛状根培養およびDNA改変の検出。 A）毛状根は、11日後に変換。B子葉から現れる見ることができる）のルーツは、約1週間半MSカン50培地上で選択されています。灰色のバーは、めっき時の根の先端の位置を示している。クローニングのC）の例とシークエンシングは、4つの異なる毛状根のイベントに二つの異なる遺伝子標的とするDNAの変異を決定します。灰色のボックスは、GN 20 GG標的配列を示し、Δは、変異の種類を示しており、示された変異を有するクローンの数。D）ポリアクリルアミドゲル電気泳動の例DNA変異を決定します。大きな欠失及びヘテロバンドは、標的配列におけるDNA変異の存在を示します。シックス・12の独立したイベントは、変異体（Δ）として記録しました。 WT、野生型コントロール。 NT、無鋳型対照。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団の助成金IOS-1025642（GBM）によってサポートされていました。我々はARqua1株を提供するためのマリア・ハリソンに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
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