Summary
Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.
Introduction
A capacidade de gerar modificações no DNA orientadas e dotadas de CRISPR / Cas9 tem um grande potencial para estudos de genômica funcional. Existem dois componentes do sistema CRISPR / Cas9; a nuclease Cas9, derivada de Staphylococcus pyogenes e um 100-nt ARN guia (gRNA) de aproximadamente molécula que dirige Cas9 ao local de ADN alvo (s) 1. Reconhecimento do alvo é conferido pelo primeiro ~ 20 nt do gRNA, que permite a produção de alto rendimento de segmentação vetores 2,3. A maioria dos organismos que podem ser modificadas, já esteve com CRISPR tecnologia / Cas9 4,5.
Em plantas, os promotores constitutivos, tais como o promotor CaMV 35S, são vulgarmente utilizados para dirigir a expressão da nuclease Cas9 6. Os gRNAs são expressas usando a polimerase III U6 ou U3 promotores de ARN, o que limita a primeira base do gRNA, quer um G, para U6, ou R para U3, para a transcrição eficiente. No entanto prom RNA polimerase IIoters, que são livres de tais restrições, também têm sido utilizados 7,8.
Diferentes gRNAs induzir mutações de DNA com eficiências diferentes, e por isso pode ser importante para o primeiro validar vetores CRISPR antes de investir em transformações de toda a planta ou a criação de amplas telas fenotípicas. A expressão transiente de construções de CRISPR em plantas, utilizando agroinfiltração por exemplo, geralmente resulta em uma menor frequência de modificação do ADN, em comparação com as plantas estáveis 6, tornando a detecção de mutações difíceis e ensaios fenotípicos impraticáveis com tais abordagens. Os chamados raízes peludas são um sistema conveniente, alternativa uma vez que grande número de elementos independentes, transformadas de forma estável podem ser gerados dentro de algumas semanas, ao contrário de meses para plantas estáveis. Vectores CRISPR são muito eficazes na indução de mutações de ADN nas raízes 9,10.
métodos de montagem de ADN eficiente ligar fragmentos de ADN contendo Overlapping extremidades 11. Uma grande vantagem de alguns métodos de montagem de ADN é a capacidade de incorporar ADNcs (isto é, os oligos) para os produtos montados. Desde gRNAs são apenas ~ 20 nt de comprimento e novos alvos pode ser feita com os oligos sintetizados, estes métodos de montagem de ADN são bem adequados para a clonagem de CRISPR. Os protocolos aqui descritos baseiam-se na série de vectores de p201 CRISPR que tem sido utilizado com sucesso em plantas de soja 10, 12 e choupo agora tomate. O procedimento de clonagem apresentado oferece várias vantagens sobre o método de clonagem de corrente 10. Nomeadamente, os vectores totalmente funcionais podem ser gerados numa única reacção de clonagem num único dia. construção do vector também podem ser agrupados para gerar múltiplos vetores CRISPR em paralelo, reduzindo ainda mais hands-on tempo e custos de materiais. Nós também apresentamos um protocolo para a geração de tomate raízes peludas como um método eficiente para a produção de materiais transgênicos com deleções de genes-alvo. raízes peludas são usados para válidacomeu os vetores CRISPR e fornecer material para experimentos posteriores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Guia de RNA Concepção e Construção Vector
- Identificar sequências alvo para os genes de interesse. Há uma variedade de programas de encontrar alvo CRISPR linha adequados para este passo 13,14.
NOTA: Aqui usamos o GN 20 GG motivo alvo, mas outros desenhos podem ser adequadas, dependendo do sistema de aplicação ou vector usado. - Design 60-mer oligonucleótidos gRNA para incluir a porção GN 19 dos motivos alvo flanqueado em 5 'e 3' as sequências de 20 nt que são necessárias para a montagem de ADN. O motivo final de 60-mer é: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
NOTA: Padrão, primers já dessalgado funcionar bem. - Prepare os quatro DNAs de montagem (Figura 1). Veja arquivo suplementar para sequências de ADN.
- Digerir 1-5 ug de p201N: 10 Cas9 plasmídeo com a enzima de restrição Spe I em 1X tampão de 4 a 37 ° C durante 2 h. Coluna-purificar a digerir umaegundo as instruções do fabricante. Ressuspender em ~ 15 ul de Tris-HCl a 10, e quantificar por espectrofotometria de UV.
- Executar uma segunda digestão com a enzima de restrição Swa I em 1X tampão de 3,1 a 25 ° C durante 2 h. Verificar 100-200 ng sobre um gel de agarose a 0,8% para confirmar a digestão completa.
NOTA: Um plasmídeo correctamente digerido terá uma única banda a 14313 pb. Nota: a inactivação térmica da enzima e desfosforilação não são necessários. plasmídeo digerido podem ser armazenadas a -20 ° C. - PCR amplificar o truncatula Medicago (Mt) de promotor U6 e andaime DNAs pela PUC gRNA Shuttle 10 plasmídeo utilizando os primers Swa I_MtU6F / MtU6R e ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, respectivamente. Usar uma polimerase de alta fidelidade com as condições de PCR: 95 ° C durante 3 min; 31 ciclos (98 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 15 seg, 72 ° C durante 30 seg); e 72 ° C durante 5 min.
- Visualize ~ 3 mL alíquotas de pr PCRodutos sobre um gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. O amplicon MtU6 é 377 pb e o fragmento amplificado andaime é de 106 pb. Coluna-purificar os produtos de PCR restantes de acordo com as instruções do fabricante, quantificar por espectrofotometria de UV e armazenar a -20 ° C.
- Ressuspender todo o tubo de oligos gRNA 100 mM em água de grau de laboratório. Adicionar 1 ml de oligo 100 uM a 500 ul de 1x tampão de 2,1. Misture bem. Se pooling múltiplos oligos, adicionar 1 ul de cada oligo 100 uM para o tubo do tampão 1x 2.1. oligos diluído pode ser armazenado a -20 ° C.
- Programar um termociclador para manter a 50 ° C, usando uma tampa aquecida. Combinar 100 ng (0,011 pmol) de vector linearizado, 50 ng (0,2 pmol) de promotor MtU6, 12 ng (0,2 pmol) de andaime, 1 ul (0,2 pmol) de oligo diluída gRNA (s), e água até um volume de 5 ul. Adicionar 5 ul de 2x de alta fidelidade montagem DNA mistura principal, misture bem e girar para baixo. Incubar de reacção durante 60 min no50 ° C termociclador. Em seguida, coloque a reação no gelo.
Nota: Os volumes de reacção pode ser aumentada para acomodar os rendimentos baixos de ADN. - Transformar 2 ul da reacção em E. competente células de E. coli, utilizando técnicas padrão e placa em placas de LB suplementadas com 50 mg L-1 de canamicina (Kan 50). Crescer as células plaqueadas a 37 ° C durante a noite. Guardar a reacção montagem ADN remanescente à temperatura de -20 ° C.
- tela Colony por PCR utilizando o StUbi3P218R primers e ISceIR. Dilui-se uma alíquota da reacção de montagem ADN remanescente com água 1: 5. Use 1 ml como um controle positivo para a tela da colônia e 1 ng de p201N circular: plasmídeo Cas9 como um controle não-inserção.
- Amplificar por PCR com as condições; 95 ° C durante 3 min; 31 ciclos (95 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg); e a 72 ° C durante 5 min. Visualizar os produtos de PCR num gel de agarose a 1%. Certifique-se de que as inserções correctas têm uma banda de 725 pb e vetores witinserções hout (por exemplo, vetor sem cortes) terá uma banda de 310 pb.
- Crescer colónias positivas em LB Kan 50 culturas líquidas durante a noite a 37 ° C e purificar plasmideos de acordo com as instruções do fabricante. sequência Sanger plasmídeos com o primer StUbi3P218R e alinhar cromatogramas ao promotor MtU6, alvo, e sequências de andaime para garantir que não haja erros foram introduzidas durante a clonagem.
- Realizar um diagnóstico digerir por digestão ~ 1 ug de plasmídeo com Eco RV e Sty I. Visualizar num gel de agarose a 0,8%. Fragments (em pb) são: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318 e 174.
- Use montagem DNA para construir vectores com vários gRNAs.
- Para construir um vector com duas cassetes gRNA, amplificar por PCR a primeira posição gRNA com os iniciadores Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR e a segunda posição gRNA com os iniciadores UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR de 1 ng de cada um dos respectivosplasmídeos construídos nos passos 1.1 - 1.8. Use as condições de PCR no passo 1.3.3. Visualizar ~ 3 aliquotas ul de produtos de PCR num gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. Amplicons são ~ 500 pb.
- Combinar e misturar quantidades aproximadamente iguais dos produtos de PCR purificados em un num tubo de 200 ul (tipicamente 3-4 mL de cada). Para a montagem, adicionar 1 ul de produtos de PCR combinados, 50 ng de Swa I e Spe I linearizado p201N: Cas9, água de grau laboratorial e 2,5 uL e 2,5 uL de 2x de alta fidelidade de ADN montagem mistura principal. Incubar em um termociclador a 50 ° C durante 15 min.
Nota: Os manuais de montagem de DNA recomenda a 15 min de incubação por 2 - 3 fragmentos. - Transformação 1 - 2 ul em E. competente coli e placa em LB Kan 50. Cultivar células plaqueadas a 37 ° C durante a noite. Guardar a reacção restante à temperatura de -20 ° C.
- tela Colony por PCR com primers StUbi3P218R e ISceIR com as mesmas condições que o passo 1.6. correcta clones terá um amplicon 1.200 pb. Crescer colónias positivas em LB Kan 50 culturas líquidas durante a noite e purificar plasmídeos.
- Sanger plasmídeos sequência com o StUbi3P218R iniciadores (cobre primeira posição gRNA) e p201R (cobre-segunda posição gRNA). Alinhar cromatogramas para as sequências de promotor, de destino e de andaime MtU6. Diagnóstico digerir com Eco RV e Sty I irá resultar nos seguintes fragmentos (em pb): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. fragmento em negrito contém a segunda gRNA.
- Após a reunião todas as expectativas de controle de qualidade, transformar plasmídeos em Agrobacterium rhizogenes estirpe ARqua1 15. Adicionar 1 ul da preparação de plasmídeo a 50 ul de células electrocompetentes e electroporar numa cuvete de um milímetro com as definições: 2,4 kV, 25 uF, 200 e Ω. Recuperar células em ~ 500 mL de SOC e agitar a 28 ° C durante 2 h. Placa em LB Kan 50 e glinha a 28 ° C durante 2 dias. tela colónia executar usando os mesmos iniciadores e condições de PCR como 1.3.3. Adicione estoques de glicerol a partir de clones positivos.
Transformação 2. Hairy Root
- Esterilizar sementes de tomate em água sanitária de 20% para 15 min, com mistura constante. Em uma capela de fluxo laminar, retire a água sanitária e lave em água de grau de laboratório estéril 3 vezes.
- Placa 30 sementes em uma caixa GA-7 contendo meio ½ MS (2,22 g L -1 MS sais + Gamborg vitaminas, 10 g L -1 de sacarose, 3 g L -1 goma de gel, pH 5,8). Germinar para ~ 2 dias no escuro, em seguida, passar GA-7 caixas de luz. A produção de mudas para ~ 4 mais dias na luz.
- No dia antes da transformação, raia fora A. rhizogenes culturas acesa LB Kan 50 e crescer a 28 ° C durante a noite.
- Dia da transformação, na capela de fluxo laminar montar materiais estéreis: 12 ml tubos de cultura, tubo de 50 ml, ½ MS líquido (sem gelana gum), 200? M acetoseringona, papel de filtro, placas de Petri, pinça e bisturi, pipetas e ponteiras. Adicionar 25 ul de acetossiringona a 50 ml de ½ MS e despeje ~ 6 ml em cada tubo de cultura.
- Use uma inclinação ponta de 200 mL para raspar A. rhizogenes células da placa e os ressuspender em 6 ml de ½ MS líquido. Vortex do tubo para voltar a suspender as células. Após ressuspender as células de cada vector, medir a densidade óptica (OD) de 1 ml de células a um comprimento de onda fixo de 600 nm. Certifique-se de OD é entre 0,2 e 0,4; diluir ou adicionar mais células como necessário. Repita o procedimento para cada construção.
- Adicionar 2 ml de ~ ½ MS líquido para uma placa de Petri com papel de filtro estéril. cotilédones especiais sobre o consumo de mudas e coloque sobre o papel de filtro umedecido. Uma vez que todos os cotilédones foram recolhidos, cortar as distais ~ 1 cm fora dos cotilédones, resultando em peças de cotilédones, com duas extremidades cortadas. Adicionar explantes com A. soluções rhizogenes, misturar e incubar por 20 mincom inversão ocasional.
Nota: Cerca de 12 explantes por construção são rotineiramente utilizados, embora até 80 explantes foram inoculados em 6 ml de A. solução rhizogenes. - Durante a A. rhizogenes incubação, adicionar papel de filtro para placas de Petri, um por construto transformado. Também definir ½ MS meios sólidos, sem antibióticos, na capela de fluxo laminar para secar.
- Colher cotilédones de A. solução rhizogenes com uma pinça estéril e coloque sobre papel de filtro seco. Cubra com Petri tampa para garantir tecidos não sequem enquanto prosseguir para a próxima transformação. cotilédones mancha no papel de filtro e transferência, com o lado abaxial para cima, a ½ meio MS. Enrole placas com fita cirúrgica e co-cultivar no escuro à temperatura ambiente durante 2 dias.
- Após o co-cultivo, cotilédones de transferência, com o lado abaxial para cima, para meio de cultura MS suplementado com 300 mg L-1 ticarcilina / ácido clavulânico (Tm 300, para impedir o crescimento de residual A. rhizogenes) e Kan 50 (para seleção de plantas) e enrole com fita cirúrgica. Manter culturas sob luzes fluorescentes à temperatura ambiente com um fotoperíodo de 16 horas.
- Depois de ~ 1,5 - 2 semanas raízes, pelo menos, 2 cm de comprimento são excisados a partir dos cotilédones, utilizando fórceps estéreis e um bisturi e transferidos para meio MS Kan 50 300 Tm meios. Transferir 10 a 15 raízes de uma única placa. Marcar a posição das pontas de raiz com um marcador, enrole com fita cirúrgica, e manter na sala de cultura.
- Após uma semana, as raízes transformadas são vistas crescer nos meios selectivos. Colher uma subamostra de raízes transformadas para extração de DNA utilizando o método de DNA de extracção preferido. Nota: Placas com cotilédones pode ser mantido por 2 - 3 colheitas semanais, após o que apontam as raízes crescem em um emaranhado e são difíceis de isolar. tecidos da raiz não colhidas pode ser mantida indefinidamente. Uma variedade de ensaios pode ser realizado na amostra de DNA isolados para determinar a freqüência mutação do DNA e tipo. Os resultados de algumas dessas análises estão descritos a seguir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
construção CRISPR vector com montagem de DNA normalmente gera dezenas a centenas de clones independentes. Triagem Colony por PCR facilmente identifica clones corretos e pode distinguir entre plasmídeos com e sem inserções (Figura 2A) que é útil para solução de problemas. Normalmente, todos os clones contêm uma inserção e um usuário pode optar por ignorar as etapas de triagem colónia completamente. Digestões de diagnóstico (Figura 2B) e Sanger de sequenciação são usadas para controlo de qualidade. Quando ocorrem erros, que são normalmente observadas nas regiões de ADN sobrepostas, ou seja, "do promotor MtU6, o gRNA, ou a 3 'da extremidade 5 da sequência de suporte. Se múltiplos oligos gRNA são reunidas numa única reacção, os gRNAs são determinados por sequenciação de Sanger. A incorporação de gRNAs individuais é distribuída uniformemente e a maioria dos gRNAs pode ser isolado a partir de uma única transformação (Figura 2C (Figura 2C).
Tomate raízes peludas são geralmente observada uma a duas semanas após a transformação (Figura 3A). Raízes ≥2 cm de comprimento são excisados e transferidos para as raízes resistentes à canamicina meio selectivo e pode ser identificada uma semana mais tarde (Figura 3B). A maioria das raízes vai crescer em algum grau em meios selectivos e crescimento das raízes nas raízes transformada pode ser variável; se possível, selecione as raízes mais vigorosamente crescentes para análise. Uma a duas raízes resistentes à canamicina são tipicamente recuperados por cotilédones inoculados. Com transferências regulares, raízes transformadas podem ser mantidos indefinidamente em meios seletivos.
ADN é extraído a partir de raízes resistentes à canamicina e PCR é utilizado para amplify região alvo (s). Os produtos de PCR podem ser usados em uma variedade de ensaios para determinar a eficiência de mutação, tais como a clonagem e sequenciação (Figura 3C), análise de restrição Fragment Length Polymorphism, electroforese em gel de poliacrilamida 16 (Figura 3D), T7E1 endonuclease de 16, ou de elevado rendimento amplicão sequenciação 10. Como relatado em outros sistemas de plantas CRISPR-6, dependendo da sequência de gRNA / alvo seleccionado, uma variedade de mutações e eficiências de mutação pode ser observado.
. Figura 1. Princípio do conjunto CRISPR Na reacção montagem ADN, quatro DNAs são misturados em conjunto; p201N: Cas9 linearizado com Swa I e Spe I (círculo), promotor MtU6 (seta verde), andaime (barra amarela) eo oligo gRNA 60-mer contendo a sequência alvo GN 19 (bbar lue). As extremidades de cada molécula de ADN de 20 pb se sobrepõe com a parte adjacente. A reacção montagem ADN recombina estes ADNs em uma única molécula, circular. O StUbi3p218R e ISceIR locais de ligação do iniciador são indicados com setas pretas, o 2x35S: Cas9 cassete é roxo, o StUbi3: cassete nptII é laranja e esquerdo e direito bordas são indicadas com barras cinzentas. Nota:. Vector mapa não é à escala Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Rastreio Colony e plasmídeo de Controle de Qualidade. A) rastreio Colony de 20 clones de montagem de DNA e transformação. M, escada de 100 pb; +, P201N: Cas9: controle positivo GFPT2; NI, p201N: Cas9 controle sem inserção; GA, DNA diluída reacção montagem; NT, não-modelo de controle. B) Representante resumo de quatro p201N: Cas9: vetores gRNA com as enzimas de restrição Eco RV e Sty I. M, 2-log escada. C) Comparação de fidelidade do padrão e de alta fidelidade misturas de montagem DNA e distribuição dos vectores recuperados quando 11 oligos gRNA foram reunidas em uma única reação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. culturas Hairy raiz e detecção de DNA modificação. A) As raízes peludas pode ser visto a partir de cotilédones emergente 11 dias após a transformação. B) As raízes são seleccionados com ½ MS Kan meios 50 para cerca de uma semana. Barras cinzentas indicam a posição de dicas de raiz no momento do plaqueamento. C) Exemplo de clonagem esequenciação para determinar mutações no DNA com dois genes alvos diferentes em quatro eventos peludo-raiz diferentes. A caixa cinza indica a sequência alvo GN 20 GG, Δ indica o tipo de mutação, e o número de clones com a mutação indicado. D) Exemplo de electroforese em gel de poliacrilamida para determinar mutações de ADN. Grandes deleções e bandas de heteroduplexes indicar a presença de mutações de ADN nas sequências alvo. Seis de 12 eventos independentes foram marcados como mutantes (Δ). WT, do tipo selvagem de controle; NT, não-modelo de controle. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation subvenção IOS-1025642 (GBM). Agradecemos Maria Harrison para fornecer a tensão ARqua1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
