This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
De fleste aktuelle studier av celle- og molekylærbiologi er basert på befolkningsgjennomsnitt. Imidlertid kan viktige biologiske hendelser bli maskert av disse tradisjonelle populasjonsbaserte analyser da små bestander kan spille en stor rolle i biologiske prosesser og sykdom utfallet. Forstå genuttrykk i heterogene populasjoner på celle-nivå kan (og har) føre til relevante biologiske og kliniske innsikter 1,2. Av interesse for embryonale utviklingsstudier, i en større populasjon av celler, stamceller er ofte underrepresentert, noe som gjør det vanskelig å oppdage subtile endringer i genuttrykk som til slutt setter i gang celle skjebne beslutninger 3. Likeledes kan en enkelt celletype har forskjellige ekspresjons-profiler som respons på mikromiljøet 4. For eksempel, bosatt endotelceller i samme organ eller i forskjellige organer (f.eks., Aorta eller nyre) utviser betydelig heterogenitet tross dele felles morphological og funksjonelle egenskaper 5. I tillegg kan kreftcellene fyller samme svulst også ha varierende molekylære profiler eller mutasjoner på celle-nivå 6.
I modellsystemer, har transcriptomics i enkeltceller hell identifisert nye cellepopulasjoner, karakterisert mellomliggende tilstander som oppstår under celledifferensiering, og avslørte differensial cellulære responser på stimuli 7,8,9. Slike innsikter ville ha vært maskert i konvensjonelle befolkningsbaserte studier. Sebrafisk embryo er et enormt lite benyttet kilde til stammen, stamfar, og differensierende celler for å utforske spørsmål om enkelt celle heterogenitet og molekylær regulering av cellulære identiteter under utvikling. Deres svært stereotype, ex vivo utvikling og enkel genetisk manipulering gjør dem til et utmerket modellsystem for denne tilnærmingen 10,11. Spesielt en stor begrensning for tolkning av enkeltcelle gene uttrykk data er at pålitelig identifisering av nye mellomcelle tilstander under utvikling krever svært forsiktig timing av vev samling ni. Dette er nødvendig for å sikre at heterogenitet mellom fangede celler representerer heterogenitet innenfor et vev ved et enkelt tidspunkt i stedet for heterogenitet i genekspresjon presentert av aldersavhengig celledifferensiering. Sammenlignet med mus, kan sebrafisk embryo utvikling være nøyaktig synkronisert på tvers av et stort antall embryoer 12. I tillegg, med ekstra clutch størrelser, sebrafisk embryoer kan brukes som en rik kilde til stamceller og forløperceller.
Denne protokollen beskriver en metode for å isolere celler fra sebrafisk embryo og fange enkeltceller ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig integrert MicroFluidics krets (IFC) chip og autoprep system for QRT-PCR analyse av genuttrykk. Denne protokollen kan raskt overføres til noen høy gjennomstrømming multiplexing analyser inkludert heletranskriptomet sekvensering som tillater mer omfattende analyse av mobilnettet heterogenitet 13. Det gir også flere fordeler til tradisjonelle genuttrykk analyser. Den enkeltcelleisolasjon protokoll gir høy levedyktighet etter FACS, noe som reduserer andelen av kompromitterte celler som inngår i nedstrømsapplikasjoner. Ved å bruke en IFC, kan fanges opp celler observeres direkte å vurdere fangst priser og vurdere celle helse morfologisk. I tillegg er denne protokollen bredt anvendelig på sebrafisk forskersamfunnet, krever bare en merket transgen fisk linje og tilgang til microfluidic celle fangstteknologier.
Som bevis på prinsippet ble enkeltceller avledet fra hjerte progenitorer isolert og tatt opp på en IFC-brikke, og da den relative overflod av hjertedifferensieringsmarkører ble målt ved QRT-PCR. Genekspresjonsanalyser på celle-nivå viser at hjerte forfedre eksistere sammen med sin differentiating avkom. Den innsikt fra encellede profilering av hjertestamfedre kan kaste lys over heterogenitet i genuttrykksmønster blant hjerte stamceller i løpet av virveldyr utvikling, som kan ha vært maskert i tradisjonelle befolkningsbaserte analyser.
Fremgangsmåten som her er beskrevet anvender ekspresjon av et fluorescerende protein under kontroll av en celletype-spesifikk promoter for å berike en populasjon av hjerte progenitorceller fra sebrafisk embryoer for bruk i mikrofluid assistert enkelt celle capture system for å vurdere ekspresjon av et delsett av hjerte gener i enkelt celler. Forutsatt at FACS laser eksitasjons- og emisjons evner er kompatible med fluorofor (er) av valget, kan denne metoden anvendes for en hvilken som helst fluorescerende reporter lin…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Supplies | |||
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for cell dissociation | |||
Double distilled water | N/A | ||
Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
FACS machine | For isolating cells of interest |