Summary

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Published: March 12, 2016
doi:

Summary

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Abstract

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Introduction

La mayoría de los estudios actuales de la biología celular y molecular se basan en promedios de la población. Sin embargo, importantes eventos biológicos pueden estar enmascarados por estos análisis tradicionales basados ​​en la población ya que las poblaciones de menor importancia pueden desempeñar un papel importante en los procesos biológicos y evolución de la enfermedad. La comprensión de la expresión de genes en poblaciones heterogéneas a nivel de una sola célula puede (y tiene) conducir a conocimientos biológicos y clínicos 1,2. De interés para los estudios de desarrollo embrionario, en una población mayor de células, las células progenitoras son a menudo poco representados, por lo que es difícil de detectar cambios sutiles en la expresión de genes que inician en última instancia, las decisiones del destino celular 3. Del mismo modo, un solo tipo de células puede tener diferentes perfiles de expresión en respuesta a la microambiente 4. Por ejemplo, las células endoteliales residentes en el mismo órgano o en diferentes órganos (por ejemplo., Aorta o riñón) presentan una heterogeneidad significativa a pesar de compartir morp comúncaracterísticas hological y funcionales 5. Además, las células cancerosas que pueblan el mismo tumor también pueden tener diversos perfiles moleculares o mutaciones en el nivel de células individuales 6.

En los sistemas modelo, transcriptómica en células individuales ha identificado con éxito nuevas poblaciones de células, que se caracteriza estados intermedios que se producen durante la diferenciación celular, y puso de manifiesto las respuestas celulares a los estímulos diferenciales 7.8.9. Estas ideas se han enmascarado en los estudios convencionales basados ​​en la población. embriones de pez cebra son una fuente tremendamente infrautilizados del tallo, células progenitoras, y diferenciación de las células para explorar cuestiones de la heterogeneidad de células individuales y la regulación molecular de identidades celulares durante el desarrollo. Su altamente estereotipada, ex vivo el desarrollo y la facilidad de manipulación genética ellas un excelente sistema modelo para este enfoque 10,11 hacen. En concreto, una limitación importante a la interpretación de un solo gen celulardatos de correo expresión es que la identificación fiable de los nuevos estados intermedios de células durante el desarrollo requiere mucho cuidado el momento de la recogida de tejidos 9. Esto es necesario para asegurar que la heterogeneidad entre las células capturadas representa heterogeneidad dentro de un tejido en un solo punto de tiempo en lugar de la heterogeneidad en la expresión génica presentado por la diferenciación de células dependiente de la edad. En comparación con los ratones, el desarrollo del embrión de pez cebra se puede sincronizar con precisión a través de un gran número de embriones 12. Además, con tamaños grandes de embrague, embriones de pez cebra se pueden utilizar como una fuente abundante de células madre y progenitoras.

Este protocolo describe un método para aislar células de embriones de pez cebra y la captura de células individuales utilizando un chip y Autoprep sistema disponible comercialmente circuito microfluídica integrado (IFC) para el análisis de la expresión génica QRT-PCR. Este protocolo puede ser rápidamente transferible a ningún ensayos de alto rendimiento, incluyendo toda la multiplexaciónsecuenciación del transcriptoma que permite un análisis más exhaustivo de la heterogeneidad celular 13. También ofrece varias ventajas a los ensayos de expresión génica tradicionales. El protocolo de aislamiento de células individuales se obtiene una alta viabilidad después de FACS, lo que disminuye la proporción de células comprometidas que se incluyen en las aplicaciones posteriores. Mediante el uso de un CFI, células capturadas pueden ser observados directamente para evaluar las tasas de captura y evaluar la salud de células morfológicamente. Además, este protocolo es ampliamente aplicable a la comunidad de investigación pez cebra, que sólo requiere una línea de peces transgénicos etiquetados y el acceso a las tecnologías de captura de células de microfluidos.

Como prueba de principio, se aislaron células individuales derivadas de progenitores cardíacos y capturados en un chip IFC, y luego la abundancia relativa de marcadores de diferenciación cardíaco se midió mediante qRT-PCR. análisis de la expresión génica a nivel de células individuales demuestra que los progenitores cardíacos coexisten con su differeprogenie ntiating. El conocimiento que se obtiene a partir de perfiles de una sola célula de células progenitoras cardíacas puede arrojar luz sobre la heterogeneidad en los patrones de expresión génica entre células progenitoras cardiacas durante el desarrollo de vertebrados, que puede haber sido enmascarado en los análisis tradicionales basados ​​en la población.

Protocol

Este protocolo requiere el uso de vivo, el pez cebra adultos para producir embriones. Los embriones se cosechan para la recogida de tejidos. Es esencial para obtener la aprobación de ética apropiadas juntas de revisión para llevar a cabo este experimento. 1. obtener embriones por etapas El día antes del experimento, preparar sana pez cebra, adulto para la cría. Coloque un macho y una hembra en lados opuestos de una clara divisoria en un tanque de cría. Repita 1,1 p…

Representative Results

Como prueba de principio, la expresión génica se evaluó para explorar la dinámica de diferenciación durante el desarrollo cardíaco. En el pez cebra, surgen progenitores cardíacos de una población mesodérmico de células que migran a la anterior mesodermo de la placa lateral donde se fusionan para formar el tubo lineal corazón. Antes de la fusión, progenitores cardíacos comienzan a expresar el factor de transcripción nkx2.5 (NK2 homeobox 5), que se cree que es el pri…

Discussion

El método descrito en este documento utiliza la expresión de una proteína fluorescente bajo el control de un promotor específico de tipo celular para enriquecer una población de células progenitoras cardíacas a partir de embriones de pez cebra para su uso en sistema de captura única célula asistida de microfluidos para evaluar la expresión de un subconjunto de genes cardiacos en solo Células. A condición de que las capacidades de FACS de excitación láser y emisión son compatibles con el fluoróforo (s) de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).

Materials

Supplies
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20 For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 mL GeneMate C-3261-1
40 um cell strainer Biobasic SP104151
35 mm culture dish Falcon 351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer Falcon 352235
P1000 and tips Rainin 17005089
P20 and tips Rainin 17005091
IFC chip manufacturer's protocol Fluidigm 100-6117 Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette VWR 14673-010 For transferring embryos
Adult wild type zebrafish N/A We used AB line
Adult transgenic zebrafish N/A We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water N/A
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
NaCl FisherScientific S271-3 make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl Sigma Aldrich P5405 make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3 Sigma Aldrich S6014 make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15 Gibco 21083-027
FBS FisherScientific 03-600-511 Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE Life Technologies 12605-010 Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax Genlantis T200100 Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional) Sigma P5147
L/D Dye – Sytox Blue Life Technologies S34857 Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue Gibco 15250-061
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4 Life Technologies Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5 Life Technologies Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7 Life Technologies Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc Life Technologies Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1 Life Technologies Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit Fluidigm 100-5319 Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM Life Technologies 4458237 Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water Corning 46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) Fluidigm 100-5757 IFC plate for small cells
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine Fluidigm 100-5477 For IFC plate use
Hemocytometer  Sigma Aldrich Z359629 For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope For assessing single cell digestion
FACS machine For isolating cells of interest

References

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Cite This Article
Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53877, doi:10.3791/53877 (2016).

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