This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
De flesta av dagens studier av cell- och molekylärbiologi är baserade på medelvärden befolknings. Emellertid kan viktiga biologiska händelser maskeras av dessa traditionella populationsbaserade analyser, eftersom små populationer kan spela viktiga roller i biologiska processer och sjukdomar resultatet. Förstå genuttryck i heterogena populationer vid den enda cellnivå kan (och har) leda till relevanta biologiska och kliniska insikter 1,2. Berör embryonala utvecklingsstudier, i en större population av celler, stamceller är ofta underrepresenterade, vilket gör det svårt att upptäcka subtila förändringar i genuttryck som slutligen initiativ till beslut cell öde 3. På liknande sätt kan en enda cell typ har olika expressionsprofiler som svar på mikromiljön 4. Till exempel, bosatta endotelceller i samma organ eller i olika organ (t ex., Aorta eller njure) uppvisar signifikant heterogenitet trots att dela gemensamma MORPhological och funktionella egenskaper 5. Dessutom kan cancerceller befolka samma tumör också ha varierande molekyl profiler eller mutationer vid den enda cellnivå 6.
I modellsystem har transkriptomik i enstaka celler framgångsrikt identifierat nya cellpopulationer, kännetecknad mellantillstånd som uppstår under celldifferentiering, och avslöjade differential cellulära svar på stimuli 7,8,9. Sådana insikter skulle ha maskerats i konventionella populationsbaserade studier. Zebrafisk embryon är en oerhört underutnyttjade källa stam, stamfader, och differentierande celler för att utforska frågor om en enda cell heterogenitet och molekylär reglering av cellulära identiteter under utveckling. Deras mycket stereotypa, ex vivo utveckling och enkel genetisk manipulation gör dem till en utmärkt modellsystem för detta synsätt 10,11. Närmare bestämt en stor begränsning för tolkning av en enda cell gene uttryck data är att säker identifiering av nya mellancelltillstånd under utveckling kräver mycket noggrann timing av vävnad samling 9. Detta är nödvändigt för att säkerställa att heterogenitet mellan infångade cellerna representerar heterogenitet i en vävnad vid en enda tidpunkt snarare än heterogenitet i genuttryck presenteras av åldersberoende celldifferentiering. Jämfört med möss, kan zebrafisk embryoutveckling exakt synkroniseras över ett stort antal embryon 12. Dessutom, med stora kopplingsstorlekar, zebrafisk embryon kan användas som en rik källa till stam- och stamfaderceller.
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera celler från zebrafisk embryon och fånga enskilda celler med hjälp av en kommersiellt tillgänglig integrerad mikrofluidik krets (IFC) chip och autoprep system för QRT-PCR genexpressionsanalys. Detta protokoll kan vara snabbt överföras till någon hög genomströmning multiplexering analyser inklusive helatranskriptom sekvense som tillåter mer omfattande analys av cell heterogenitet 13. Det finns också flera fördelar för traditionella genuttryck analyser. Den enda cell isolering protokoll ger hög lönsamhet efter FACS, vilket minskar andelen komprometterade celler som ingår i program nedströms. Genom att använda en IFC, kan infångade cellerna observeras direkt för att utvärdera en avskiljningsnivå och bedöma cell hälsa morfologiskt. Dessutom är detta protokoll i stort sett tillämpas på zebrafisk forskarsamhället, som endast kräver en märkt transgen fisk linje och tillgång till mikroflödescell tekniker för avskiljning.
Som bevis på principen, var enskilda celler härledda från hjärt stamceller isoleras och fångas på ett IFC-chip, och sedan den relativa förekomsten av hjärtdifferentieringsmarkörer mättes med QRT-PCR. Genexpressionsanalys vid den enda cellnivå visar att hjärt progenitorceller samexistera med deras differentiating avkomma. Insikten från encelliga profilering av hjärt stamceller kan belysa heterogenitet i genuttryck mönster bland hjärt progenitorceller under ryggrads utveckling, som kan ha maskerats i traditionella populationsbaserade analyser.
Den metod som beskrivs häri använder uttryck av ett fluorescerande protein under kontroll av en celltypsspecifik promotor för att berika en population av hjärt progenitorceller från zebrafisk embryon för användning i mikroflödesassisterad enda cell capture system för bedömning expression av en underuppsättning av hjärt gener i singel celler. Förutsatt att FACS laser excitations- och emissionsförmåga är kompatibla med fluoroforen (er) för val, kan denna metod användas för något fluorescerande reporter…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Supplies | |||
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for cell dissociation | |||
Double distilled water | N/A | ||
Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
FACS machine | For isolating cells of interest |