Summary

En kombineret 3D manipuleret væv<em> In vitro</em> /<em> I Silico</em> Lunge Tumor Model for Forudsigelse Drug Effektivitet i specifikke mutations baggrunde

Published: April 06, 2016
doi:

Summary

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Abstract

I den foreliggende undersøgelse, vi kombinerede en in vitro 3D lungetumor model med en in silico model til at optimere forudsigelser af lægemiddel respons baseret på en specifik mutationel baggrund. Modellen er genereret på en decellulariseret porcint stillads, der gengiver vævsspecifikke karakteristika med hensyn ekstracellulære matrix sammensætning og arkitektur, herunder basalmembranen. Vi standardiseret en protokol, der tillader kunstig tumorvæv generation inden for 14 dage, herunder tre dages medicinsk behandling. Vores artikel indeholder flere detaljerede beskrivelser af 3D udlæsning screening teknikker som bestemmelse af spredning indeks Ki67 farvning s, apoptose fra supernatanter af M30-ELISA og vurdering af epitelial til mesenkymale overgang (EMT), som er nyttige redskaber til evaluering af effektiviteten af terapeutiske forbindelser. Vi kunne vise i forhold til 2D kultur en reduktion af spredning i vores 3D-tumor model, der er vedrøed til den kliniske situation. Trods af denne lavere proliferation, modellen forudsagte EGFR -targeted drug reaktioner korrekt i overensstemmelse med biomarkør status som vist ved sammenligning af lunge carcinoma cellelinier HCC827 (EGFR -mutated, KRAS vildtype) og A549 (EGFR vildtype, KRAS – muteret) behandlet med tyrosin-kinase-inhibitor (TKI) gefitinib. For at undersøge drug reaktioner af mere avancerede tumorceller, vi induceret EMT ved langtidsbehandling med TGF-beta-1 som vurderet ved vimentin / pan-cytokeratin immunfluorescensfarvning. En strøm-bioreaktor blev anvendt til at justere kultur til fysiologiske betingelser, hvilket forbedrede væv generation. Desuden viser vi integrationen af narkotika reaktioner på gefitinib behandling eller TGF-beta-1 stimulation – apoptose, spredning indeks og EMT – ind i en boolesk i silico model. Desuden har vi forklare, hvordan narkotika reaktioner af tumorceller med en bestemt mutations baggrund og tællererstrategies mod modstand kan forudsiges. Vi er overbeviste om, at vores 3D in vitro tilgang især med sin i silico udvidelse giver en ekstra værdi for præklinisk narkotika-test i mere realistiske forhold end i 2D cellekultur.

Introduction

Den farmaceutiske industri står over for høje opgivelsesprocent på op til 95% inden for kræftbehandling i det kliniske fase forårsager enorme omkostninger 1-5. En af grundene til dette underskud er, at i øjeblikket effekten af ​​potentielle nye forbindelser vurderes i store screeninger på 2D cellekulturer af kræft cellelinjer eller i dyremodeller. Dyremodeller har en højere kompleksitet, men der er afgørende forskelle mellem mus og mænd 6,7. I det sidste årti, har 3D kræftmodeller ved hjælp af forskellige metoder er genereret til at bygge bro mellem 2D kultur cancer cellelinjer og en kompleks in vivo tumor 6,8,9. Virkningen af 3D-miljø på celledifferentiering og også på signalering er blevet vist i adskillige undersøgelser år siden (f.eks. Ved Mina Bissell) 10,11. I dag, mange 3D-cellekultur modeller er til rådighed, såsom kugleformede kulturer, hydrogeler eller mikrofluide chips 12-16. Selvom THESe modeller øge kompleksiteten sammenlignet med konventionelle 2D dyrkningssystemer, de for det meste mangler et væv mikromiljø, der vides at have tumor-understøttende påvirkninger samt påvirkninger lægemiddeleffektivitet.

For at løse dette problem, vi genereret en 3D-tumor model baseret på en biologisk stillads kaldet SISmuc (lille-tarm-submucosa + slimhinde), der er afledt af en decellulariseret porcin jejunum. Derved vævsarkitekturen og vigtige bestanddele af ECM såsom forskellige kollagener samt basalmembranen struktur bevares 17. Denne unikke egenskab er afgørende for tumormodel generation af karcinomer, der opstår fra epitel og omfatter omkring 80% af faste tumorer. Endvidere er proliferationshastighed i vores væv-manipuleret tumormodel reduceret i forhold til de kunstigt høje opnået i 2D kultur. Som spredning er en vigtig parameter i vurderingen af ​​narkotika effekt, er narkotika testning aktiveret i vores model i mere ensbetingelser til in vivo tumorer 17.

For at vurdere potentialet i vores model til at forudsige biomarkør-afhængige narkotika effekt korrekt, vi her præsentere data for to forskellige lungekræft cellelinier, der adskiller sig i deres EGFR -biomarker status. Denne mutationsstatus er begyndt at blive bestemt rutinemæssigt i NSCLC patienter. Målrettede behandlinger med TKI'er såsom EGFR inhibitor gefitinib mod tumorer, der bærer en aktiverende EGFR mutation viser overlegne resultater sammenlignet med dem med platinbaseret kemoterapi 18-21.

Vi har etableret flere read-out teknikker, der er relevante for at vurdere sammensatte effekt. Desuden efter TGF-beta-1 stimulation er vi i stand til at undersøge sammensatte handlinger i tumorceller, der startede EMT proces, der menes at være et vigtigt skridt i malign transformation 22,23, og som er forbundet til narkotika resistance 24.

3D tumor model tillader overvågning celle-specifikke reaktioner på målrettede behandlinger, kemoterapi eller narkotika kombinationer med gode kontraster. For yderligere at styrke og fremskynde lægemiddel-screening og at møde modstand, dette suppleret med en i silico simulering. Baseret på et par eksperimenter, kan tumorrespons forudsiges i silico om resultatet for en bred vifte af lægemidler og deres kombinationer.

Protocol

1. To-dimensional (2D) Celledyrkning Kommercielt få tumorcellelinie HCC827 (DSMZ). Kultur lungen adenocarcinomacellelinie HCC827 (EGFR muteret, KRAS vildtype) i RPMI-1640 suppleret med 20% FCS. Skift medium hver 2 – 3 dage. Split cellerne to gange om ugen. Celler anvendes indtil passagen 20 er nået. Kommercielt få tumorcellelinie A549 (DSMZ). Kultur den lungecarcinom-cellelinje A549 (EGFR vildtype, KRAS muteret) i RPMI-1640 suppleret med 10% FCS. Udfør kulture…

Representative Results

På grundlag af den SISmuc scaffold (figur 2A til C), vi etableret et standardiseret operativsystem protokol for produktion, stimulering og behandling af en 3D tumor testsystem (figur 2D). Denne model muliggør bestemmelse af proliferationsindekset og kvantificering af apoptose ved hjælp af M30-ELISA som vist i figur 1 og figur 3. Figur 3 viser repræsentative H & E farvning af A549 og HCC827 modell…

Discussion

Vi har etableret en kombineret in vitro / in silico tumor testsystem til biomarkør-styret behandling forudsigelser. In vitro model evaluerer forskellige vigtige aspekter af sammensatte handlinger såsom ændringer af tumorcelleproliferation og apoptose på en specifik mutationel baggrund, der også kan simuleres i silico 17. Her præsenteres den standardiserede protokol for 3D tumor model generation og sammensatte test herunder kvantificering af proliferation og apoptose og etabler…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning blev sponsoreret af Center for Tværgående Clinical Research (IZKF, tilskud BD247) fra University Hospital i Würzburg og Bayern Fit-programmet (tildelt Heike Walles).

Materials

Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ This software was used for drawing the network.
citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. 
citrate buffer working solution in house production 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal calf serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4 % (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37°C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

References

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. . . Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , (2013).
  28. . . BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Play Video

Cite This Article
Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

View Video