Summary

Studeren Wnt Signalering Tijdens patroonvorming van Conducting Airways

Published: October 16, 2016
doi:

Summary

Het gebruik van reporter muizen gekoppeld aan ganse berg en rubriek vlekken, microscopie en in vivo assays vergemakkelijkt de analyse van de onderliggende mechanismen van het normale patroon van de luchtwegen. Hier beschrijven we hoe deze technieken hebben bijgedragen aan de analyse van Wnt signalering gedurende tracheale ontwikkeling.

Abstract

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Introduction

Luchtwegen ontwikkeling wordt geïnitieerd door embryonale dag 9 (E9) met het verschijnen van Nkx2.1 positieve cellen in het ventrale endodermale voordarm 1,2. Slokdarm-tracheatube scheiding zal oplossen door E11.5 wanneer de buizen kunnen worden onderscheiden als afzonderlijke entiteiten, elk omringd door mesenchymale weefsel 3. Wnt signalering speelt een belangrijke rol in de beschrijving van de luchtwegen als deletie van Wnt2 en Wnt2b door de splanchnische mesenchym en verwijdering van β-catenine uit de endodermale luchtwegepitheel expressie resulteert in de longen agenesis 4,5. Onze eerdere studies vastgesteld dat de schrapping van Wls, een lading receptor bemiddelen afscheiding van alle Wnt liganden, uit de endodermale luchtwegen resultaten in long hypoplasie, defecten in de longvaten ontwikkeling en mis-patroonvorming van de tracheale mesenchym 6,7. Deze gegevens ondersteunen het belang van de epitheliale-mesenchymale cross praten celdifferentiatie en specificatie, zoals ook in andere studies 8,9 getoond.

De studie van de vroegste stadia van ontwikkeling van de longen vertrouwt op genetische, in vitro en ex vivo technieken die liet ons toe om beter te begrijpen mechanismen achter de luchtwegen identiteit 10-16. Hele long explantkweken bij Air Liquide interfase op grote schaal gebruikt om de effecten van groeifactoren in een vroege pulmonale vertakkende morfogenese 10,17,18 bestuderen. Hoewel deze methode wordt gebruikt als uitlezing van morfologische veranderingen, zoals vertakkingen morfogenese en genexpressie moduleren, is beperkt tot de studie van de vroege stadia van het ontwikkelingsproces, de cultuur zelf ondersteunt de ontwikkeling van bloedvaten 17. Ontwikkeling van tracheale kraakbeen vereist langere incubatietijden die niet compatibel zijn met deze cultuur techniek kan zijn.

om Analyze de rol van Wnt signalering tijdens luchtwegen vormen, hebben we standaardtechnieken aangepast aan de behoeften van embryonale studies voldoen. We hebben gewijzigd volumes, kleuring tijden, verwerking fietsen voor paraffine inbedding en de timing voor de clearing van tracheale-longweefsel. Het belangrijkste doel van het optimaliseren van de in deze studie beschreven technieken was om de vroegste stadia van tracheale ontwikkeling te analyseren bij muizen die plaatsvinden van E11 naar E14.5. Met behulp van de reporter muizen lijn Axin2LacZ we nauwkeurig bepaalde plaatsen van Wnt / β-catenine activiteit in de ontwikkeling van tracheale mesenchym. We hebben ook aangepast lectine kleuring procedure voor het ganse berg tracheale weefsel. Zo waren we in staat om mesenchymale verdichtingen visualiseren en locaties waar chondrogenese zal plaatsvinden voorspellen. Kleuring van ganse berg en secties van embryonaal weefsel verkregen uit WlsShhCre muizen, gecombineerd met geavanceerde microscopische technieken, konden we de rol van Wnt liganden door de tra onthullenCheal epitheel in tracheale patronen.

Protocol

De dieren werden gehuisvest in pathogeenvrije omstandigheden. De muizen werden behandeld volgens de protocollen door CCHMC Institutional Animal Care en gebruik Comite (Cincinnati, OH USA) goedgekeurd. Muizen gebruikt tijdens deze studies werden een gemengde achtergrond gehandhaafd. 1. hele berg X-galactosidase kleuring Euthanaseren zwangere vrouw op E11.5 naar E14.5 door CO 2 inhalatie. Plaats dieren in CO 2 kamer, laad de kamer met CO 2. Handhavin…

Representative Results

Wnt / β-catenine activiteit Whole mount Lac-Z kleuring werd gedetecteerd in tracheale-longweefsel van embryo geïsoleerd uit reporter Axin2 Lac -Z muizen 11. Sites van kleuring geven Wnt / β-catenine-activiteit. Analyse van de secties van de hele berg kleuring vastgesteld dat Wnt / β-catenine-activiteit aanwezig is in het mesenchym van de luchtpijp en in mesenchym van de perifere re…

Discussion

Gebeurtenissen achter de morfogenese van de luchtwegen worden niet volledig begrepen, met name de voor de patroonvorming van de geleidende luchtwegen processen. Eerdere studies hebben ex vivo technieken, waarbij de ontwikkeling van explantaten worden gekweekt in de lucht-vloeistof interfase of ingebed in Matrigel 21,22 benut. Deze studies hebben aangetoond hoe groeifactoren de patroonvorming van de ontwikkeling trachea en de vorming van tracheale kraakbeen beïnvloeden. Een beperking van deze studies…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij erkennen de hulp van Mike Muntifering en Matt Kofron met confocale beeldvorming en Gail Macke met histologische procedures. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 DS).

Materials

Anti Sox9 ab. Millipore AB5535 1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab. Santa Cruz Sc-20095 1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab. Sigma A5228 1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:400, mouse
Anti Brdu ab. Abcam AB1893 1:200, sheep
Anti Brdu ab. Santa Cruz Sc-32323 1:4k, mouse
PNA Lectin Sigma L 7381
Secondary antibodies Life technologies Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6 Sigma P8131
K4Fe(CN)6 Sigma-Aldrich P3289
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272
NaDOC Life Technologies 89905
NP4O Life Technologies 85124
Alcian Blue 8GX Sigma A-3157
Fisher brand super-frost plus Fisher 12-550-15
PFA (16%) EMS 15710
PBS Gibco 70011-044
Fetal Calf Serum Sigma 11K413
Blocking reagent Invitrogen Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu Sigma B5002-5g
Vectashield mounting medium Vector labs H-1000
Permount Fisher SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen Fisher C-0250-GR
Biopsy cassettes Premiere BC0109 Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1% Sigma N3020
Citric acid Sigma C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma S4641-1Kg
Trizma hydrochloride Sigma T5941-500G
Xylene Pharmco-AAPER 399000000
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Micro knives FST 10318-14
Dumont #5 ceramic coated FST 11252-50
Dumont #5CO FST 11295-20
Dumont # 5 FST 91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES Thermo Fisher
Microtome Leica RM2135
Nikon i90 Nikon Wide field microscope
NikonA1Rsi Nikon Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. 
Leica MS 16 FA Leica Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss Zeiss Automated fluorescence microscope
Leica Application suite Leica Leica imaging software
NIS Nikon Nikon imaging software
IMARIS Bitplane Imaging processing software

References

  1. Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
  3. Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
  4. Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
  5. Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
  6. Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
  7. Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
  8. Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
  9. Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
  10. Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
  11. Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
  12. Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
  13. Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
  14. Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
  15. Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
  16. Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
  17. Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
  18. Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  19. Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
  20. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  21. Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
  22. Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
  23. Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  25. Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
  26. Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
  27. Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).

Play Video

Cite This Article
Snowball, J., Ambalavanan, M., Sinner, D. Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways. J. Vis. Exp. (116), e53910, doi:10.3791/53910 (2016).

View Video