पूरे माउंट करने के लिए मिलकर संवाददाता चूहों और इस खंड धुंधला हो जाना, माइक्रोस्कोपी के और इन विवो assays में उपयोग श्वसन तंत्र की सामान्य patterning अंतर्निहित तंत्र के विश्लेषण की सुविधा। यहाँ हम वर्णन कैसे इन तकनीकों सांस की नली के विकास के दौरान WNT सिगनल के विश्लेषण के लिए योगदान दिया।
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
श्वसन तंत्र के विकास उदर endodermal अग्रांत्र 1,2 में Nkx2.1 सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ भ्रूण दिन 9 (E9) द्वारा शुरू की है। इसोफेजियल-सांस की नली ट्यूब जुदाई E11.5 द्वारा mesenchymal ऊतक 3 से घिरे प्रत्येक हल होगा जब नलियों अलग संस्थाओं के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है। WNT सिगनल Wnt2 और Wnt2b का विलोपन के रूप में श्वसन तंत्र के निर्देशन में एक महत्वपूर्ण भूमिका, स्प्लैनकिंक mesenchyme और β-catenin का विलोपन endodermal श्वसन उपकला से फेफड़ों के द्वारा व्यक्त agenesis 4,5 में परिणाम होगा निभाता है। हमारे पिछले अध्ययनों, WLS, सभी Wnt ligands के एक मालवाहक रिसेप्टर मध्यस्थता स्राव की कि विलोपन चुना गया फेफड़ों hypoplasia में endodermal श्वसन तंत्र परिणामों से, फेफड़े संवहनी विकास और सांस की नली mesenchyme 6.7 की गलत patterning में दोष। इन आंकड़ों उपकला-mesenchymal सीआरओ के महत्व का समर्थनएस एस, सेल भेदभाव और विनिर्देश में बात करते हैं, क्योंकि यह भी अन्य अध्ययनों से 8,9 में दिखाया गया है।
फेफड़ों के विकास के शुरुआती दौर के अध्ययन के आनुवंशिक पर निर्भर करता है, इन विट्रो और पूर्व vivo तकनीक है कि हमें बेहतर सांस की पहचान 10-16 ड्राइविंग तंत्र को समझने के लिए अनुमति दी है में। हवा तरल interphase पर पूरे फेफड़ों explant संस्कृतियों का व्यापक रूप से फेफड़े के morphogenesis 10,17,18 शाखाओं में बंटी के प्रारंभिक दौर में विकास के कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। इस पद्धति ऐसी शाखाओं में बंटी morphogenesis के रूप में रूपात्मक परिवर्तन, और जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन के readout के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह विकास की प्रक्रिया के प्रारंभिक दौर के अध्ययन तक सीमित है, के रूप में संस्कृति ही वाहिका 17 के विकास का समर्थन नहीं करता। सांस की नली उपास्थि के विकास अब ऊष्मायन बार इस संस्कृति तकनीक के साथ संगत नहीं किया जा सकता है कि आवश्यकता है।
analyz करने के लिएश्वसन तंत्र के गठन के दौरान WNT सिगनल की ई भूमिका, हम मानक तकनीक ढाल लिया है हमारे भ्रूण पढ़ाई की जरूरतों को पूरा करने के लिए। हम संस्करणों, धुंधला बार, आयल embedding और सांस की नली-फेफड़े के ऊतकों के समाशोधन के लिए समय के लिए प्रसंस्करण साइकिल चालन संशोधित किया है। तकनीक वर्तमान अध्ययन में वर्णित के अनुकूलन का मुख्य लक्ष्य है कि चूहों E14.5 करने के लिए E11 से जगह ले में सांस की नली विकास के प्रारंभिक चरणों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। संवाददाता चूहों लाइन Axin2LacZ विकासशील सांस की नली में mesenchyme Wnt / β-catenin गतिविधि का हम ठीक निर्धारित साइटों का उपयोग करना। हम भी पूरे माउंट सांस की नली ऊतक के लिए लेक्टिन धुंधला प्रक्रिया ढाल लिया है। इस प्रकार, हम mesenchymal condensations कल्पना और साइटों जहाँ उपास्थिजनन जगह ले जाएगा भविष्यवाणी करने में सक्षम थे। पूरे माउंट और WlsShhCre चूहों, उन्नत माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ युग्मित से प्राप्त भ्रूण ऊतक के वर्गों, का धुंधला Wnt टीआरए द्वारा उत्पादित ligands की भूमिका अनावरण करने के लिए हमें की अनुमति दीसांस की नली में patterning cheal उपकला।
श्वसन तंत्र के morphogenesis अंतर्निहित घटनाओं को पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं, विशेष रूप से आयोजित करने एयरवेज के patterning के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं। पिछले अध्ययनों से पूर्व vivo तकनीक है जिसमें विकासशील explants हवा ?…
The authors have nothing to disclose.
हम ऊतकीय प्रक्रियाओं के साथ माइक Muntifering और confocal इमेजिंग के साथ मैट Kofron और गेल Macke की सहायता स्वीकार करते हैं। इस काम आंशिक स्वास्थ्य NHLBI के राष्ट्रीय संस्थान (डी एस के लिए K01HL115447) द्वारा समर्थित किया गया।
Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
NP4O | Life Technologies | 85124 | |
Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
PFA (16%) | EMS | 15710 | |
PBS | Gibco | 70011-044 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
BrDu | Sigma | B5002-5g | |
Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
Permount | Fisher | SP15-500 | |
Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Micro knives | FST | 10318-14 | |
Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
Microtome | Leica | RM2135 | |
Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |