We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.
الاختلافات في نشاط الناقلات العصبية وneuromodulators، والاستجابات العصبية المختلفة وبالتالي، يمكن العثور بين الحيوانات تخدير ومستيقظا. لذلك، يطلب من أساليب تتيح التلاعب في أنظمة متشابك في الحيوانات المستيقظة من أجل تحديد مساهمة مدخلات متشابك لمعالجة الخلايا العصبية تتأثر التخدير. هنا، نقدم منهجية لبناء أقطاب لتسجيل وقت واحد النشاط العصبية خارج الخلية والافراج عن المواد neuroactive متعددة في المنطقة المجاورة للمواقع تسجيل في الفئران مستيقظا. من خلال الجمع بين هذه الإجراءات، أجرينا حقن microiontophoretic من gabazine لمنع انتقائي مستقبلات GABA ألف في الخلايا العصبية للأكيمة أدنى من الفئران ضبط النفس الرأس. Gabazine تعديل بنجاح خصائص استجابة العصبية مثل منطقة استجابة التردد والتكيف التحفيز محددة. وبالتالي، علينا أن نبرهن على طرقنا هي مناسبة لrecordinز النشاط وحدة واحدة ولتشريح دور المستقبلات العصبية المحددة في المعالجة السمعية.
القيد الرئيسي للإجراءات المنصوص مدة التسجيل قصيرة نسبيا (~ 3 ساعة)، والتي يتم تحديدها من قبل مستوى التعود من الحيوان إلى تسجيل الدورات. من ناحية أخرى، تسجيل جلسات متعددة لا يمكن أن يؤديها في نفس الحيوان. وميزة هذه التقنية على الإجراءات التجريبية الأخرى المستخدمة لمعالجة مستوى العصبي أو تعديل العمليات العصبية (مثل الحقن النظامية أو استخدام نماذج علم البصريات الوراثي)، هو أن تأثير الدواء يقتصر على مدخلات متشابك المحلية إلى الخلايا العصبية المستهدفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العرف تصنيع أقطاب يسمح تعديل معايير محددة وفقا للهيكل العصبي ونوع من الخلايا العصبية من الفائدة (مثل مقاومة نصيحة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء من التسجيلات).
التفاعل بين الإثارة العصبية وتثبيط أمر أساسي لمعالجة المعلومات الحسية 1. ومن المعروف أيضا أن التخدير له تأثير قوي على ديناميات تفعيل القشرية ونمط الزمني للمدخلات متشابك 2،3. على سبيل المثال، فقد لوحظ أن التخدير يغير مدة الردود أثار بصريا في الخلايا العصبية القشرية 3،4. وعلاوة على ذلك، فإن النسبة بين مثير ومدخلات متشابك المثبطة مختلفة في الحيوانات تخدير ومستيقظا 4،5، وتغيير كل من أثار ومعدلات النشاط العفوي 6،7. عن طريق قياس المواصلة متشابك، وجدت حيدر وزملاؤه 4 أن تثبيط مطابقة الإثارة في السعة تحت التخدير بينما أثناء اليقظة، وتثبيط أقوى من الإثارة. هذه النتائج ستدفع تطوير الإجراءات التجريبية لدراسة تأثير مدخلات متشابك محددة بشأن معالجة الحسي في الحيوانات مستيقظا.
<وقد استخدمت الطبقة ص = "jove_content"> وطرد رقابة من المواد neuroactive التي يتقاضاها تطبيق الحقن الحالية صغيرة (بناء على أمر من غ) على نطاق واسع لدراسة مساهمة مدخلات متشابك ودور مستقبلات الخلايا المفترضة في معالجة الحسي 8-13 . هذه التقنية، المعروفة باسم microiontophoresis، تسمح للتطبيق المخدرات في محيط الخلايا العصبية المسجلة، مما يساهم في التأثير السريع والمحصورة. هذا الإجراء هو أكثر ملاءمة لدراسة الآثار المحلية من المواد neuroactive، مقارنة مع تأثير واسع النطاق التي تسببها التلاعب التجريبية أخرى مثل الحقن النظامية، microdialysis أو استخدام تقنيات علم البصريات الوراثي. عادة، يتم استخدام التكوين القطب أصبع الظهير 14،15 لتسجيل وقت واحد الخلايا العصبية المستهدفة وتسليم المواد neuroactive من الفائدة. وهو يتألف من القطب تسجيل تعلق على ماصة multibarrel الذي يحمل المواد neuroactive. تعديلات سوقد تم تنفيذ الإجراء riginal التي وصفها Havey وكاسباري 14. على سبيل المثال، التنغستن القطب، بدلا من كوب واحد، ويمكن استخدامها لتسجيل النشاط العصبي 16. الطرق التي تم نشرها مسبقا لتصنيع أقطاب التنغستن 17،18 تنطوي على ثلاث خطوات عامة: النقش كهربائيا من النصائح سلك التنغستن، عزل الزجاج، وتعديل التعرض طرف لتلبية متطلبات التسجيل.حقل مثيرة للاهتمام وطارئة في علم الأعصاب السمعية هو دراسة التحفيز محدد التكيف (SSA 19). SSA هو انخفاض معين في الاستجابة العصبية للأصوات المتكررة التي لا التعميم إلى أصوات أخرى، ونادرا ما قدمت. أهمية SSA تكمن في دوره المحتمل بوصفه آلية العصبية كشف الانحراف الكامن في الدماغ السمعي، وكذلك من الممكن إلى المترابطة الخلايا العصبية لعنصر عدم تطابق السلبية الراحل السمعية أثار المحتملين 20،21. SSA سccurs من IC تصل إلى القشرة السمعية 19،22-24. وقد تجلى GABA A تثبيط بوساطة ليكون بمثابة آلية السيطرة على منطقة أفريقيا جنوب الصحراء 7،16،25، التي ثبت أيضا أن تتأثر التخدير 26. هنا نقدم البروتوكول الذي يجمع بين الأساليب المذكورة سابقا لتسجيل نشاط وحدة واحدة من الخلايا العصبية IC قبل وأثناء تطبيق خصم الانتقائي لل-receptors GABA (أ) في الفئران مستيقظا. أولا، نحن تصف صناعة أقطاب كهربائية أصبع الظهير والقادم، والأساليب الجراحية والتسجيل. لاختبار فعالية إطلاق المخدرات، قارنا مجال تقبلا فضلا عن مستوى منطقة أفريقيا جنوب الصحراء من الخلايا العصبية IC قبل وأثناء طرد microiontophoretic من gabazine.
وmicroiontophoresis المواد neuroactive في الحيوانات المستيقظة هي تقنية قوية لتحقيق وتشريح دور مدخلات متشابك محددة على نشاط الخلايا العصبية واحدة 40،41. الأهم من ذلك، هذا الإجراء يسمح بتحديد تأثير الناقلات العصبية وneuromodulators على الدوائر العصبية دون أي تشويش محتمل من التخدير. ه?…
The authors have nothing to disclose.
هذا المشروع تم تمويله من قبل MINECO يمنح BFU201343608 ف وPSI2013-49348-EXP، ومنحة SA343U14 JCYL لتمويل MSM وMRC الأساسية لARP. عقدت YAA على CONACYT (216106) وزمالة سبتمبر
Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |