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Neuroscience

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Published: May 21, 2016 doi: 10.3791/53914
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,4
1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León, University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research, University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine, University of Salamanca

Abstract

Las diferencias en la actividad de los neurotransmisores y neuromoduladores, y por consiguiente diferentes respuestas neuronales, se pueden encontrar entre los animales anestesiados y despierto. Por lo tanto, se requieren métodos que permiten la manipulación de los sistemas de sinápticas en animales despiertos con el fin de determinar la contribución de entradas sinápticas con el procesamiento neuronal no afectado por los anestésicos. A continuación, presentamos metodología para la construcción de electrodos para registrar simultáneamente la actividad neuronal extracelular y liberar varias sustancias neuroactivos en las proximidades de los sitios de grabación en ratones despiertos. Mediante la combinación de estos procedimientos, se realizó inyecciones microiontophoretic de gabazine para bloquear selectivamente los receptores GABA A en las neuronas del colículo inferior de los ratones de cabeza-restringido. Gabazine modificado correctamente las propiedades de respuesta neural, como la zona de respuesta de frecuencia y adaptación a estímulos específicos. De este modo, se demuestra que nuestros métodos son adecuados para recording actividad de una sola unidad y para disecar el papel de los receptores de neurotransmisores específicos en el procesamiento auditivo.

La principal limitación del procedimiento descrito es el tiempo de grabación relativamente corto (~ 3 hr), que se determina por el nivel de habituación del animal a las sesiones de grabación. Por otra parte, múltiples sesiones de grabación se puede realizar en el mismo animal. La ventaja de esta técnica sobre otros procedimientos experimentales utilizados para manipular el nivel de la neurotransmisión o neuromodulación (tales como inyecciones sistémicas o el uso de modelos optogenética), es que el efecto del fármaco se limita a las entradas sinápticas locales a la neurona diana. Además, la costumbre-fabricación de electrodos permite el ajuste de los parámetros específicos de acuerdo con la estructura neural y el tipo de neurona de interés (tales como la resistencia de punta para mejorar la relación señal-ruido de las grabaciones).

Introduction

La interacción de la excitación neuronal y la inhibición es fundamental para el procesamiento de la información sensorial 1. También se sabe que la anestesia tiene un fuerte impacto sobre la dinámica de la activación cortical y el patrón temporal de entradas sinápticas 2,3. Por ejemplo, se ha observado que los anestésicos alteran la duración de las respuestas evocadas visualmente en las neuronas corticales 3,4. Además, la relación entre excitatorios e inhibitorios entradas sinápticas es diferente en animales anestesiados y despiertos 4,5, alterando tanto evocados y las tasas de actividad espontánea 6,7. Mediante la medición de las conductancias sinápticas, Haider y sus colegas encontraron que la inhibición 4 emparejado en amplitud de excitación bajo anestesia mientras que durante la vigilia, la inhibición fue más fuerte que la excitación. Estos hallazgos impulsan el desarrollo de procedimientos experimentales para estudiar el impacto de las entradas sinápticas específicas en el procesamiento sensorial en animales despiertos.

<clase p = "jove_content"> La eyección controlada de sustancias neuroactivos cargadas mediante la aplicación de pequeñas inyecciones de corriente (del orden de nA) se ha utilizado ampliamente para estudiar la contribución de las entradas sinápticas y la función de los receptores de las células tumorales en el procesamiento sensorial 8-13 . Esta técnica, conocida como microiontophoresis, permite la aplicación de medicamentos en la vecindad de la neurona registrada, que contribuye a un efecto rápido y confinado. Este procedimiento es más adecuado para el estudio de los efectos locales de sustancias neuroactivos, en comparación con el efecto generalizado provocada por otras manipulaciones experimentales, tales como inyecciones sistémicas, microdiálisis o el uso de técnicas de optogenética. Por lo general, una configuración de electrodos de lengüeta de la 14,15 se utiliza para registrar simultáneamente la neurona diana y entregar las sustancias neuroactivos de interés. Se compone de un electrodo de registro conectado a una pipeta de tubos múltiples que transporta las sustancias neuroactivos. Las modificaciones de la juntariginal procedimiento descrito por Havey y Caspary 14 se han implementado. Por ejemplo, un electrodo de tungsteno, en lugar de uno de vidrio, se pueden utilizar para registrar la actividad neural 16. Métodos publicados anteriormente para la fabricación de electrodos de tungsteno 17,18 involucran tres pasos generales: grabado electrolítico de las puntas de alambre de tungsteno, el aislamiento de vidrio, y el ajuste de la exposición de punta para satisfacer las necesidades de grabación.

Un campo interesante y emergente de la neurociencia auditiva es el estudio de la adaptación-estímulo específico (SSA 19). SSA es una disminución específica en la respuesta neuronal a los sonidos repetitivos que no se generaliza a otros sonidos, rara vez se presentan. La importancia de la SSA reside en su papel potencial como una detección de la desviación subyacente mecanismo neural en el cerebro auditivo, así como un posible correlato neuronal para el componente de desajuste negatividad tardía del potencial evocado auditivo 20,21. SSA occurs de la IC hasta la corteza auditiva 19,22-24. GABA A inhibición mediada ha sido demostrada para actuar como un mecanismo de control de ganancia en SSA 7,16,25, que también se ha demostrado a ser afectados por la anestesia 26. Aquí se presenta un protocolo que combina los métodos descritos anteriormente para el registro de la actividad de una sola unidad de neuronas IC antes y durante la aplicación de un antagonista selectivo de los receptores GABA A en ratones despiertos. En primer lugar, se describe la fabricación de electrodos de piggy-back y el próximo, los métodos quirúrgicos y de grabación. Para probar la eficacia de la liberación del fármaco, se comparó el campo receptivo, así como el nivel de la SSA de las neuronas del CI antes y durante la eyección de microiontophoretic gabazine.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en la Universidad de Salamanca con la aprobación y el uso de métodos que se ajusten a las normas de la Universidad de Cuidado de Animales de Salamanca, así como las normas de la Unión Europea (Directiva 2010/63 / UE) para el uso de animales en la investigación en neurociencias.

1. Los electrodos de tungsteno

Nota: La fabricación de electrodos de tungsteno se basa en la técnica original descrito en Merrill y Ainsworth 27 y Ainsworth et al 28 y realiza utilizando la configuración de estación de trabajo se describe en Bullock et al 17...

  1. Para grabar una sola unidad de actividad extracelular de las neuronas IC, utilizar electrodos con una impedancia de punta de 1.5 a 2.5 mO. Aquí, las etapas implicadas en la fabricación de electrodos de tungsteno se describen sólo brevemente, ya que una descripción detallada se encuentra en las referencias mencionadas anteriormente.
  2. Coloque los cables de tungsteno en una alineación hecha a la medidaherramienta (Figura 1A) para ayudarles a cortar a la longitud deseada. La herramienta de alineación consta de 30 agujas (25 g) pegados en paralelo a intervalos de 2 mm, con una parada en uno de los extremos para limitar la longitud de los cables a ~ 40 mm. adjuntar con cuidado los extremos sueltos de los cables con cinta adhesiva, y cortar el resto del alambre con tijeras fuertes.
  3. Tire suavemente de la cinta a fin de eliminar los alambres de tungsteno de la herramienta de alineación, asegurándose de que todos los cables de permanecer unidos a la cinta. Enrollar la cinta sobre un husillo de latón pulido (Figura 1 B, C), que sostiene los cables firmemente contra el husillo así que hay una buena conexión eléctrica.
  4. Conectar el husillo a un motor de 5 rpm en la estación de trabajo, y sumergir la punta de alambre que sobresalen en una solución de ataque (KNO 2, 90 g por cada 80 ml). Ángulo del eje de husillo 45 ° respecto a la superficie de la solución de decapado. Sumergir la punta de alambre de modo que ~ 1/3 de los hilos de contacto de la solución.
  5. ImmErse un electrodo de varilla de carbono en el baño de ataque químico para cerrar el circuito. Use un cepillo de cobre trenzado de resorte para aplicar el suministro de grabado al eje del husillo con el husillo está girando. Ajustar la corriente que pasa a través de los electrodos y la solución de ataque a 250 mA. Detener el ataque químico de punta cuando la corriente cae a 200 mA. Las puntas de los alambres serán grabados en puntos muy finos.
  6. Pasar un alambre afilado través de una llama para eliminar cualquier residuo de grasa y el adhesivo. Coloque el cable (extremo romo primero) en un capilar de vidrio de borosilicato (1,5 mm de diámetro exterior, 0,86 mm de diámetro) con su extremo inferior bloqueado con plastilina. Sujetar la pipeta en posición vertical en la parte superior e inferior. Tirar de la pipeta usando una bobina de calentamiento (diámetro 5 mm, la profundidad de 5 mm) y un émbolo de suspensión. Como el cable se tira hacia abajo por el peso del émbolo, el vidrio fundido forma una capa muy fina alrededor de ella.
  7. Retire el cristal que cubre la punta en la punta del electrodo con la ayuda de un cordón fundido de sodiotetraborato. Para formar el talón, mezclar el tetraborato de sodio (~ 0,25 g) con una pequeña cantidad de agua (~ 0,5 ml) y lentamente colocarlo en un elemento de calentamiento, hasta que se funde en un cordón ~ 2 mm de diámetro. La temperatura del elemento de calentamiento es controlado por un potenciómetro. Coloque el talón y el elemento calefactor en un brazo manipulador fijo a la mesa, y moverlo hasta que el talón se centra en el microscopio a bajo aumento.
  8. Fije el cable de cubierta de vidrio a una diapositiva y colocarla bajo el microscopio. Mover la diapositiva con los mandos de la etapa hasta que la punta y el talón tetraborato están en foco. Calentar el talón hasta que se derrita un poco, e inserte la punta del alambre ~ 10 - 15 micras. Girar el potenciómetro de calefacción apagado. A medida que el grano se enfría, se contrae y se eliminará el vaso de la punta del electrodo, exponiendo el tungsteno subyacente. El electrodo de tungsteno está listo para usar.

2. Fabricación de tubos múltiples de cristal de la pipeta

  1. Proteger los extremos de la múltiplecapilares de vidrio barril (cinco cañones en H-configuración) con un tubo de aislamiento, para permitir un mejor agarre de las mordazas del extractor y evitar que se rompan, y colocar una en el extractor vertical.
  2. Para obtener longitudes de punta de ~ 15 mm, fijar el extractor para los siguientes parámetros: calor: 84, imán Sub vigor: 49, la fuerza del imán principal: 38. Ajustar estos parámetros de acuerdo con la configuración en particular, así como después de cambiar el elemento de calefacción.
  3. Tire del capilar para obtener dos pipetas con las puntas ocluidas. Montar una pipeta en un portaobjetos utilizando plastilina y romper la punta de la pipeta en el microscopio hasta que el diámetro exterior es de ~ 20 - 30 micras, usando tijeras o pinzas finas, o la parte plana de un bisturí. Si el borde roto es demasiado áspero, refinarlo mediante la técnica de tetraborato de cuentas se describe en el paso 1.7.
  4. Colocar un electrodo de tungsteno (de la sección 1) en un soporte hecho con una aguja 20 G en el extremo de un microposicionador miniatura 3-eje montado en el ciervo microscopiomi. El uso de pinzas, doblar el extremo del electrodo de 5-10 °, ~ 30 mm de la punta.
  5. Bajo el microscopio, alinee con cuidado el electrodo de tungsteno sobre la punta de tubos múltiples. Una vez alineado, baje el electrodo hasta que hace contacto con la de tubos múltiples, encajando en la ranura entre los dos barriles superiores. Deslizar la punta del electrodo hasta que sobresalga ~ 15-20 m de distancia de la punta de la de tubos múltiples. Hacer que el ángulo entre el electrodo y la de tubos múltiples lo más pequeño posible para obtener una mejor unión y un conjunto más delgado.
  6. Aplique una pequeña gota de luz curable adhesivo ~ 5 mm de distancia de la punta. Tenga cuidado de que el pegamento no alcanza la punta para evitar el bloqueo de los canales de tubos múltiples.
  7. Curar el pegamento con una lámpara de luz LED azul. Repetir la aplicación del pegamento / curado si es necesario, para una mejor unión.
  8. Mover la platina del microscopio suavemente hasta que el extremo del electrodo de tungsteno se libera de su soporte. Retire el conjunto de lengüeta de la de la diapositiva.
  9. envolver THe sección media del electrodo de lengüeta de la en una longitud corta de tubo termorretráctil y aplicar rápido apropiado de curado de epoxi para el vidrio para asegurar aún más el electrodo de tungsteno a la de tubos múltiples.

3. Medicamentos para Microiontophoresis

Nota: Los fármacos utilizados para microiontophoresis deben tener una carga eléctrica cuando se disuelve en agua. Compruebe la literatura para ver si el fármaco de interés es apropiado para este procedimiento. Aquí, el procedimiento para gabazine, un antagonista del receptor GABA A, se describe.

  1. Filtro de agua destilada usando un filtro de jeringa de 0,2 micras para esterilizar el agua y asegurar que no contiene solutos. Preparar ~ 1.000 l de 20 mM gabazine utilizando esta agua destilada.
  2. Ajustar el pH de la dilución a 4 con 0,2 m NaOH filtrada con ayuda de un electrodo de pH de punta fina.
  3. Almacenar 100 - 200 ml de alícuotas a -20 ºC. Descongelar el día de la grabación. Ese día, antes de que el animal es refrenared, llenar los barriles (3-5 mu l) del electrodo de tubos múltiples con las drogas, usando una microjeringa 100 l provista de una aguja de plástico flexible.

4. La cirugía y la implantación Headpost

  1. Realizar experimentos en los dos ratones CBA / J machos (Mus musculus) con pesos de 27 y 30 g. Siga los procedimientos quirúrgicos y de grabación de Bryant y colegas 29, Portfors y colaboradores 30-32, y el Duque y 26 Malmierca.
  2. En los días previos a la cirugía, manejar los animales y habituarse a la cámara de grabación por lo que les permite explorar libremente. Realizar 3 sesiones por día, cada una duración de al menos 30 minutos. De esta manera los animales será más tranquilo y cómodo durante las grabaciones.
  3. Anestesiar al ratón usando una mezcla de ketamina (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) inyectado por vía intramuscular. Con esta dosis el animal está profundamente anestesiado por alrededor de 1 hora. Administrar dosis suplementarias de uno third de la dosis inicial como sea necesario.
  4. Colocar el animal sobre una manta de calefacción regulado para mantener una temperatura de 38 ± 1 ºC y estabilizar la cabeza del animal en un marco estereotáxico mediante el uso de dos barras de oído y una barra de bocado. Tenga cuidado de no perforar la membrana timpánica con las barras de oído.
  5. Proteger los ojos mediante la aplicación de una gota de gel oftálmico.
  6. Afeitarse el cuero cabelludo con unas tijeras y aplicar povidona yodada para desinfectar la piel.
  7. El uso de un bisturí, hacer una incisión en la línea media para exponer el cráneo y retraer el periostio que cubre el parietal y la parte más rostral de los huesos occipitales.
  8. Pegar un headpost ligero duraluminio (peso ~ 0,65 g, longitud 30 mm, Figura 2A) con una ronda y la base plana (5 mm de diámetro) en el cráneo. Pegar un alambre de plata para el medio de la headpost dejando sus extremos libres. El alambre de plata se utiliza como el electrodo de referencia para el registro electrofisiológico.
  9. Aplicar una capa delgada de ligadhesivo ht-curable en el cráneo y la base de la headpost. Espere 10 segundos y colocar el headpost sobre el área rostral de los huesos parietales, a lo largo de la línea media.
  10. Para una fuerza de unión efectiva, la luz curar el adhesivo usando una fuente de luz azul durante 20 segundos.
  11. Perforar tres agujeros alrededor y detrás de la base del headpost usando un taladro eléctrico y una broca pequeña.
  12. Coloque dos tornillos de reloj (~ 2 mm de longitud) en los orificios perforados para servir como puntos de contacto adicionales entre el cráneo y el cabezal de la platina. Los tornillos requieren 1½ vueltas para conseguir un ajuste perfecto. Prueba de los tornillos con fórceps para asegurarse de que no están sueltos.
  13. Inserte la punta del cable de tierra plata en el tercer hoyo asegurándose de que haga contacto con la duramadre. Aplique una pequeña gota de agua del pegamento de cianoacrilato resistente a unir el cable al cráneo.
  14. Aplicar compuesta fotopolimerizable para reforzar el vínculo de la headpost con el cráneo. Cubrir la base de la headpost, la parte baja del alambre de plata,y los tornillos, con cuidado de no se extienden detrás de lambda, para permitir el acceso durante la grabación. Curar usando una fuente de luz azul.
  15. Retraer el músculo en la parte posterior del cuello cerca de su inserción en el cráneo. Usando un pequeño trépano (2,35 mm de diámetro), perforar una ventana redonda justo debajo de sutura lambda y lateral a la línea media, para exponer el colículo inferior (IC). Cuando las fronteras están sueltos, tire hacia arriba del hueso que cubre con unas pinzas finas. Si se produce una hemorragia, enjuague con solución salina estéril fría para detenerlo.
  16. Hacer un pequeño muro (~ 1 mm de ancho y ~ 1 mm de altura) alrededor de la ventana con el compuesto y fotopolimerice ella.
  17. Cubrir el cráneo expuesto y muscular con un ungüento antibiótico. A continuación, humedecer la superficie expuesta de la IC con solución salina estéril y se cubre con vaselina, llenando el pozo generada después de hacer la pared alrededor de la ventana de grabación.
  18. Inyectar subcutáneamente buprenorfina (0,03 mg / kg, se diluyó 1:10 en solución salina estéril) como analgésico.
  19. Mantener al animal en tque el calentamiento de la manta hasta que se despierta y se vuelve a su jaula de la vivienda para recuperarse de la cirugía durante tres días antes de las sesiones de grabación. alojamiento de los animales en jaulas vivienda rat's individuales para evitar que sus compañeros de jaula limpieza de la jalea y la headpost toque la cubierta de metal de la red. Coloque un poco de enriquecimiento en la jaula cuando el animal se encuentra sola. Además, cambiar diariamente el serrín para prevenir la infección y cerciórese de que el animal se recupere correctamente y no muestra ningún signo de malestar. También puedes ver si es vaselina sobre la ventana de grabación proteger el cerebro expuesto.

5. electrofisiológicos de grabación y Microiontophoresis

  1. Después de la recuperación, dé tiempo a los animales para aclimatarse al entorno de grabación y que tiene su cabeza restringido. Aclimatarse al animal mediante la fijación del headpost al titular mientras que el ratón está sentado en un limitador de espuma acolchada a medida tallada a su tamaño corporal (Figura 2B). Esta voluntad limque los movimientos del ratón y contribuirá a su tranquilidad.
  2. Comience con 10 sesiones min y aumentar progresivamente la duración de hasta 120 min. Durante la sesión, recompensar a los animales con líquidos dulces (leche condensada, diluido en agua 30:70) a intervalos determinados 33. Más tarde, durante la sesión de grabación, dará la misma recompensa al comienzo y al final de la sesión o mientras no se aísla de la neurona.
  3. Si el animal está muy excitado antes de la grabación, inyectar la acepromacina sedante suave (2 mg / kg, intraperitoneal). De acuerdo con el sistema neural de interés, el sedante puede afectar a sus resultados.
  4. Deje que el animal explorar libremente la cámara de grabación durante 5 - 10 minutos a.
  5. Coloque el cuerpo del animal en el retenedor de acolchado de espuma hecha a medida (Figura 2B).
  6. Asegurar el headpost a un soporte unido a la estructura estereotáctica (Figura 2C). Este es un buen momento para darle al animal una recompensa líquido.
  7. CoVer el cuerpo del animal con una manta de algodón y apriete ligeramente usando un semicilindro de plástico y cinta adhesiva.
  8. Retire la vaselina desde la ventana de grabación y enjuague con solución salina estéril tibia.
  9. la actividad neuronal registro y la solicitud iontoforética de gabazine.
    1. Coloque el electrodo de tubos múltiples en su soporte, controlado por un microdrive y unido a un micromanipulador.
    2. Conectar los cables para la grabación, el uso de pequeñas pinzas de cocodrilo. Conectar el terminal positivo al final del electrodo de tungsteno, y el terminal de tierra al alambre de plata que hace contacto con la duramadre.
    3. Colocar un alambre de plata sin revestir el interior de cada barril, por lo que uno contactos final, la solución y el otro extremo es accesible. Conecte los extremos al dispositivo microiontophoresis, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    4. Mueva el electrodo de tubos múltiples hasta que la punta contacta con la superficie del cerebro. Aplicar solución salina estéril caliente para evitar la desecación de THtejido cerebral e. En ese momento aplicar una corriente de retención (-10 nA para gabazine, compruebe la literatura para el medicamento en particular) para evitar la fuga del fármaco desde la punta barril, mientras que en busca de la actividad de una sola unidad.
    5. Utilizar técnicas estándar para aislar la actividad extracelular sola neurona. Obtener el área de respuesta de frecuencia (FRA) de la neurona, es decir, la combinación de frecuencias e intensidades capaz de evocar una respuesta porque la neurona es sensible a estos sonidos 34-36.
    6. Elegir dos frecuencias (F1 y F2) que evocan una tasa de disparo similar y patrón. Presentar cada una de las frecuencias de estímulo tan raro y repetitivo bajo el paradigma curioso personaje.
      Nota: En pocas palabras, en el paradigma oddball, una frecuencia (f1) se presenta como el estímulo repetitivo con una alta probabilidad de ocurrencia, mientras que la segunda (f2) es el estímulo desviada rara vez ocurre, intercalados aleatoriamente entre los repetitivas. En una segunda secuencia de bicho raro, el parienteprobabilidades de los dos estímulos se invierten. Detalles del paradigma de estimulación se han descrito previamente 22,37.
    7. Suelte el gabazine desplazando la corriente a valores positivos (10 - Na 20). Obtener de nuevo la FRA y repetir el paradigma curioso personaje bajo la aplicación gabazine. Mantener la expulsión hasta que un efecto visible en la velocidad de disparo se observa; por lo general toma 5-20 min, dependiendo del medicamento en particular, su concentración, y la magnitud de la corriente de expulsión. Repetir el protocolo de grabación para obtener los valores bajo el efecto de la droga.
    8. Detener la inyección mediante la devolución de la corriente a valores de retención. Espere a que el efecto de la droga para lavar mediante el control que la FRA o la respuesta al paradigma curioso personaje vuelve a los valores de control.
      Nota: Las sesiones de grabación pueden durar 2 - 3 horas por día, y deben concluir antes si el animal muestra signos de malestar o dificultades. Tome el líquido recompensa y para abarcar la ch grabaciónAmber con vaselina.

Análisis 6. Datos

  1. Medir la FRA antes y durante la inyección gabazine, así como el nivel de SSA.
  2. Cuantificar la fuerza de la respuesta SSA por el índice común-SSA (CSI) y el índice de SSA-frecuencia específica (SI) tal como se describe anteriormente 19,22,23,38,39. La CSI y SI reflejan la diferencia normalizada entre la respuesta neuronal a los estímulos raros y la respuesta a la repetitiva. Positivos valores de CSI y SI indican la respuesta neural (espigas por estímulo) fue superior a raro que a los tonos repetitivos.
  3. Comparar los datos de la condición de control y de eyección de drogas.

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Representative Results

Se registró la actividad de una sola unidad de 4 neuronas bien aisladas del CI. Las relaciones típicas de señal a ruido obtenidos durante las grabaciones extracelulares en ratones despiertos se muestran en la Figura 3B. La Figura 4A muestra el área de respuesta de frecuencia (FRA) de cada neurona antes y durante el bloqueo de la GABA A receptores con gabazine. Se observó un incremento en la intensidad de la respuesta (picos / estímulo), así como una ampliación de la sintonización espectral. El incremento en la respuesta evocada también fue evidente en los histogramas de tiempo peri-estímulo acumulados obtenidos a partir de la respuesta neural a todas las frecuencias e intensidades presentados (Figura 4B).

Uno o dos pares de frecuencias dentro de FRA de la neurona (cruces en la figura 4A) fueron elegidos para ser presentados como sonidos repetitivos o poco comunes en un paradigma de bicho raro, a sTUDY el nivel de la SSA en sus respuestas. Durante dos neuronas ejemplo, las respuestas evocadas de sonido a cada frecuencia (F1 y F2) antes y durante la inyección gabazine se muestran como raster de puntos en la Figura 5A, B. Para las dos neuronas ejemplo, hubo un cambio claro en la respuesta evocada por sonido como se observa en la trama de puntos y PSTHs.

Del mismo modo, el bloqueo local de los receptores GABA A aumentó la respuesta neuronal a la gran mayoría de los tonos raros y repetitivos (Figura 5C) de acuerdo con nuestro estudio previo 16. Se observaron diferentes niveles de la SSA en las respuestas neuronales a f1 y f2, lo que se reflejó en CSI positivo (intervalo de CSI: -0.26 a la 0,43; 0,25 ± 0,23) y los valores del SI (intervalo de IS: -0.41 a la 0,83, 0,25 ± 0,23) . Para la mayoría de los casos, el aumento de la respuesta al tono repetitiva provocó una caída en los índices como se observa en la Figura 5D

Figura 1
Figura 1. Material para la fabricación de electrodos de tungsteno. Herramienta de alineación (A) de electrodos, con algunos cables de tungsteno en su lugar. La pieza más ligera de la izquierda es una parada para los cables. La punta de tijera indica el lado utilizado como una guía para el corte de los cables a la longitud deseada. (B) eje vacío. (C) del husillo con un lote de electrodos conectados, y que descansa sobre un soporte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 2
Figura 2. Accesorios para grabaciones de ratones despiertos. (A) Headpost. (B) personalizados hechos de contención de espuma acolchada. lugar tél ratón en entre las dos piezas, dejando la cabeza fuera. (C) Modificaciones del marco estereotáxico. El titular headpost (barra superior) asiste durante headpost implantación y restringe la cabeza durante las grabaciones. La pieza para morder (barra inferior) sólo se utiliza durante la implantación headpost. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Ejemplo de grabación en el ratón despierto. (A) área de respuesta de frecuencia de una neurona desde el ratón IC. (B) de formas de onda de los picos registrados a partir de esta neurona. (C, D) del punto de trama y histograma en tiempo peristumulus grabado de esta neurona utilizando un paradigma oddball en las frecuencias indicadas por los puntos en (A). Vuelve a dibujar a partir de datospublicado en Duque y Malmierca 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Efecto del bloqueo de los receptores GABA A en la espectral y temporal propiedades de respuesta. Área de respuesta (A) Frecuencia de los cuatro IC registró neuronas antes y durante la inyección de microiontophoretic gabazine. Las cruces negras en (A) indican las frecuencias elegidas para ser presentado como sonidos raros y repetitivas. (B) Acumulado peri-estímulo histogramas de tiempo de la respuesta neuronal a todas las frecuencias e intensidades presentados para construir el área de respuesta antes y durante la inyección de gabazine. Las barras negras indican la duración del sonido.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Efecto del bloqueo de los receptores GABA A en la respuesta a los sonidos repetitivos y poco comunes. (A, B) rasters de puntos de la respuesta spiking a un par de frecuencias que se presentan como rara (rojo, 10%) y estímulo repetitivo (azul, 90%) antes y durante la aplicación de gabazine. Cada frecuencia se juega en dos secuencias de tal manera que cada uno fue presentado como raro- y repetitivo. El fondo sombreado indica la duración del estímulo. (C). Respuestas de una sola neurona a siete pares de frecuencias que se presentan como la rara y como el sonido repetitivo antes y durante la aplicación de gabazine. (D) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El microiontophoresis de sustancias neuroactivos en animales despiertos es una técnica poderosa para sondar y diseccionar el papel de entradas sinápticas específicas sobre la actividad de las neuronas individuales 40,41. Más importante aún, este procedimiento permite la determinación de los efectos de los neurotransmisores y neuromoduladores en los circuitos neurales sin la interferencia potencial de los anestésicos. Aquí, nos demuestran que la aplicación de gabazine en el CI de los ratones despiertos cambió con firmeza la sintonización de frecuencia (Figura 4A), los patrones de respuesta temporal (Figura 4B) y la SSA (Figura 5).

La principal limitación del procedimiento descrito es el tiempo de grabación relativamente corto (~ 3 hr), que se determina por el nivel de habituación del animal a las sesiones de grabación. Por otra parte, múltiples sesiones de grabación se pueden realizar en el mismo animal. Usando microiontophoresis no está claro hasta qué puntolas sustancias neuroactivos aplicadas se difunden en el tejido circundante. Por lo tanto, un posible efecto sobre la actividad de la red neuronal se puede provocar al afectar no sólo la neurona registrada sino también la glial circundante y células neuronales. Por ejemplo, Candy y sus colegas han demostrado que el 42 ciertas moléculas por iontoforesis entregados, que no se eliminan con rapidez, pueden difundirse hasta 600 micras. En los ratones IC de este rango podría cubrir la mayor parte de la extensión de los cenadores dendríticas pero también afectan a la respuesta neuronal de las células adyacentes. No En resumen, el fármaco liberado por iontoforesis es como se espacialmente restringida como diálisis intracelular de los fármacos, que permite la disección en detalle más fino de las entradas sinápticas a la neurona diana y la prueba de red local procesa 16,43, es más específico que el otro experimental procedimientos usados ​​para manipular el nivel de la neurotransmisión o neuromodulación, tales como inyecciones sistémicas, el uso de técnicas de optogenética, o empujar-pull diálisis.

El diámetro de la punta de las pipetas de vidrio y la magnitud de las corrientes de retención y de inyección son factores clave para controlar con el fin de evitar la fuga de fármaco no específica en el tejido. Las bajas corrientes de inyección (del orden de decenas de nA) limitar la propagación de la droga que permite la grabación de las neuronas cerca uno del otro. Por ejemplo, tres de los cuatro neuronas utilizadas como ejemplos (neuronas 1 - 3) se registraron a lo largo de la misma pista con distancias de 16 y 800 micras entre ellos. A pesar de la corta distancia de 16 m entre neurona 1 y 2, una respuesta claramente diferente de la neurona 2 se observó (Figura 4).

Algunas alternativas a la configuración de lengüeta de la propuesta se han utilizado anteriormente. Una de ellas consiste en el uso de una de las pipetas de tubos múltiples para el registro, en lugar de un electrodo separado. Si bien la construcción de los conjuntos es menos complicado en este caso, hay inconvenientes. abetost, todos los canales tendrá el mismo diámetro de la abertura en la punta, que puede no ser óptima para la grabación y administración de fármacos. Además, la punta del electrodo que sobresale en la configuración de lengüeta de la previene el daño a la célula diana probablemente causado por la punta más ancha de la de tubos múltiples. La segunda alternativa común es el uso de pipetas de vidrio de un solo cañón para el registro de 15,44 en lugar de los electrodos de tungsteno. Los electrodos de vidrio son fáciles de fabricar a las dimensiones requeridas, sino que tienden a obstruir durante las grabaciones largas o cuando se viaja profundamente en el cerebro, por lo que en nuestros electrodos de tungsteno proporcionan experiencia grabaciones más fiables. Por otra parte, mediante el uso de electrodos de tungsteno que es posible producir lesión electrolítica para localizar los sitios de registro, sin que los procedimientos histológicos más elaborados requeridas cuando se usa una inyección de trazador neural 45. El uso de pipetas de vidrio de tubos múltiples permite la liberación de múltiples agonistas y / o antagonistas muy cerca de la grabaciónsitio, que es una gran ventaja cuando la interacción entre los sistemas de neurotransmisores en el procesamiento sensorial está en estudio.

Los procedimientos descritos en el presente protocolo para la fabricación de los electrodos piggy-back hacen posible la producción de electrodos de registro de acuerdo con los requisitos específicos del experimento y de las características de la zona diana de interés de una manera sistemática, sin embargo, de manera personalizada. Además, los materiales para la fijación headpost se utilizan convencionalmente en la odontología por lo que son fácilmente disponibles. Por lo tanto, los pasos críticos en el protocolo son la habituación de los animales y el grabado de los electrodos de tungsteno, que son los principales factores que contribuyen a las neuronas bien aisladas y registros electrofisiológicos estables. En general, esta técnica es relativamente simple, económico y muy fiable como un medio para estudiar el papel de múltiples sustancias neuroactivos sobre la actividad neuronal de una o varias unidades en despierto, cabeza-ratones contenida.

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Acknowledgments

Este proyecto fue financiado por el MINECO otorga BFU201343608-P y PSI2013-49348-CAD, y la subvención a la financiación SA343U14 JCYL HSH y MRC núcleo de ARP. YAA llevó a cabo una CONACyT (216.106) y una beca-SEP-.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire Harvard Apparatus LTD 33-0099 0.005 inches x 3 inches
Borosilicate glass capillary  Harvard Apparatus LTD 30-0053 Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long
Multibarrel glass capillaries  World Precision Instruments 5B120F-4  5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament
Diaplus DiaDent 2001-2101 Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette
G-Bond GC Corporation 2277 Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull
Charisma Heraeus Kulzer 66000087 Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull
Araldit Cristal Ceys 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette
Heating blanket Cibertec RTC1
Stereotactic frame Narishige SR-6N Modified for mice
Microiontophoretic device Harvard Apparatus LTD Neurophore BH-2 Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module
Multibarrel glass pipette puller Narishige Model PE-21
LED lamp Technoflux CV-215 5 W, 430-485 nm
MicroFil World Precision Instruments MF34G-5 Flexible plastic needle, 34 AWG
Imalgene Merial Ketamine, 100 mg/mL
Rompun Bayer Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531 Sigma S106 Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4

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Neurociencia número 111, adaptación auditivo-estímulo específico colículo inferior gabazine la inhibición área de respuesta de frecuencia multibarrels electrodo de tungsteno entradas sinápticas
Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake
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