Abstract
Verschillen in de activiteit van neurotransmitters en neuromodulatoren, en bijgevolg verschillende neurale respons, is beschikbaar tussen verdoofde en wakkere dieren. Daarom werkwijzen waardoor het manipuleren van synaptische systemen in wakkere dieren vereist om de bijdrage van synaptische inputs neuronale verwerking beïnvloed door verdoving bepalen. Hier presenteren we methode voor de constructie van elektroden gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit registreren en meerdere neuroactieve stoffen vrijkomt de nabijheid van de opname locaties wakkere muizen. Door het combineren van deze procedures, voerden we microiontophoretic injecties van gabazine om selectief blokkeren GABA A-receptoren in neuronen van de colliculus inferior van het hoofd ingetogen muizen. Gabazine succes gemodificeerde neurale respons eigenschappen, zoals de frequentierespons gebied en stimulus-specifieke afstemming. Zo tonen we dat onze methoden geschikt voor recording enkele eenheid activiteit en voor het ontleden van de rol van specifieke neurotransmitter receptoren in auditieve verwerking.
De belangrijkste beperking van de beschreven procedure is relatief kort is (~ 3 uur), die wordt bepaald door het niveau van gewenning van de dieren aan de opnames. Anderzijds kunnen meerdere opnames worden uitgevoerd in hetzelfde dier. Het voordeel van deze techniek andere experimentele procedures gebruikt om het niveau van neurotransmissie of neuromodulatie (zoals systemische injectie of het gebruik van optogenetic modellen) te manipuleren, dat het effect van het geneesmiddel beperkt tot de lokale synaptische ingangen naar het doel neuron. Bovendien is de maat vervaardiging van elektroden maakt aanpassing van specifieke parameters volgens de neurale structuur en type neuron plaats (zoals de punt weerstand ter verbetering van de signaal-ruisverhouding van de opnamen).
Introduction
Het samenspel van neurale excitatie en inhibitie van fundamenteel belang is voor de verwerking van zintuiglijke informatie 1. Het is ook bekend dat verdoving een sterke invloed op de dynamiek van corticale activatie en tijdspatroon van synaptische inputs 2,3. Zo is waargenomen dat anesthetica verandert de duur van visueel opgewekte responsen in corticale neuronen 3,4. Bovendien is de verhouding tussen de prikkelende en remmende synaptische inputs is anders in verdoofde en wakkere dieren 4,5, het veranderen van zowel opgeroepen en spontane activiteit tarieven 6,7. Door het meten van de synaptische conductances, Haider en collega's 4 vonden dat remming geëvenaard excitatie in amplitude onder verdoving, terwijl tijdens het wakker zijn, remming sterker dan excitatie was. Deze bevindingen prompt de ontwikkeling van de experimentele procedures om de impact van specifieke synaptische ingangen op sensomotorische integratie in wakkere dieren te bestuderen.
<p class = "jove_content"> De gecontroleerde uitstoot van geladen neuro-actieve stoffen door het aanbrengen van kleine stroom injecties (in de orde van nA) is uitgebreid gebruikt om de bijdrage van synaptische inputs en de rol van vermeende cel receptoren in sensorische verwerking 8-13 bestuderen . Deze techniek, bekend als microiontophoresis, wordt de toepassing van geneesmiddelen in de nabijheid van de opgenomen neuron, wat bijdraagt tot een snel en beperkt effect. Deze werkwijze is geschikt voor het bestuderen van lokale effecten van neuro-actieve stoffen, in vergelijking met de wijdverspreide effect veroorzaakt door andere experimentele manipulaties zoals systemische injecties, microdialyse of het gebruik van optogenetic technieken. Meestal wordt een piggy-back elektrode configuratie 14,15 gebruikt om tegelijkertijd het doel neuron opnemen en leveren de neuro-actieve stoffen van belang. Het bestaat uit een registratie-elektrode verbonden met een pipet multibarrel dat neuroactieve stoffen draagt. Modificaties van de original procedure beschreven door Havey en Caspary 14 zijn uitgevoerd. Bijvoorbeeld kan een wolfraamelektrode, in plaats van een glas is, worden gebruikt om de neurale activiteit 16 opnemen. Eerder gepubliceerde werkwijzen voor de bereiding van wolfraamelektroden 17,18 omvatten drie algemene stappen: elektrolytisch etsen van wolfraam tips, glas isolatie en afstelling van de blootstelling tip vastgestelde eisen voldoen.Een interessante en opkomende veld in auditieve neurowetenschappen is de studie van de stimulus-specifieke aanpassing (SSA 19). SSA is een specifieke verlaging van de neurale respons op herhaalde geluiden die niet generaliseren naar andere zelden gepresenteerd geluiden. Het belang van SSA ligt in de mogelijke rol als neurale mechanisme onderliggende afwijking detectie in de auditieve hersenen, evenals een mogelijke neuronale correlaat van de late mismatch negatieve component van de auditieve evoked potential 20,21. SSA occurs van de IC tot aan de auditieve cortex 19,22-24. Een GABA gemedieerde inhibitie is aangetoond om als gain control mechanisme SSA 7,16,25, die ook is aangetoond dat beïnvloed door verdoving 26. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschreven werkwijzen gecombineerd voor het opnemen van een enkele eenheid activiteit van IC neuronen voor en tijdens het aanbrengen van een selectieve antagonist van de GABAA-receptoren in wakkere muizen. Ten eerste beschrijven we de vervaardiging van piggy-back elektroden en vervolgens de chirurgische en opname methoden. Om te testen op de werkzaamheid van geneesmiddelafgifte vergeleken we het receptieve veld en het niveau van SSA IC neuronen voor en tijdens de microiontophoretic uitgeworpen gabazine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd bij de Universiteit van Salamanca met de goedkeuring van de uitgevoerd en met behulp van methoden die voldoen aan de normen van de Universiteit van Salamanca Animal Care Committee evenals de normen van de Europese Unie (Richtlijn 2010/63 / EU) voor het gebruik van dieren in de neurowetenschappen onderzoek.
1. Tungsten Elektroden
Opmerking: De vervaardiging wolfraamelektroden is gebaseerd op de originele techniek Merrill Ainsworth en 27 en Ainsworth et al 28 beschreven en uitgevoerd met de inrichting van een werkstation in Bullock et al 17 beschreven...
- Single-unit extracellulaire activiteit van neuronen IC opnemen, gebruikt u elektroden met een tip impedantie van 1,5-2,5 MQ. Hier worden de bij de vervaardiging wolfraamelektrode stappen slechts kort beschreven omdat een gedetailleerde beschrijving is te vinden in de hierboven genoemde referenties.
- Plaats wolfraam draden in een custom-built alignmentgereedschap (Figuur 1A) te helpen te snijden op de gewenste lengte. Het uitlijngereedschap bestaat uit 30 mm (25 G) gelijmd parallel in 2 mm intervallen, met een stop aan een uiteinde de lengte van de draden aan ~ 40 mm beperken. Bevestig voorzichtig de losse eindjes van de draden met plakband, en snijd de rest van de draad met sterke schaar.
- Trek voorzichtig van de band om de wolfraam draden van de uitlijning gereedschap te verwijderen, om ervoor te zorgen dat alle draden verbonden blijven aan de tape. Rol de tape op een gepolijste koperen vijzel (Figuur 1B, C), die de draden stevig tegen de as, zodat er een goede elektrische verbinding.
- Sluit de spindel met een 5 rpm motor in het werkstation, en dompel de uitstekende draad tips in een etsoplossing (KNO 2, 90 g per 80 ml). Hoek spilas 45 ° ten opzichte van het oppervlak van de etsoplossing. Dompel de draad tips, zodat ~ 1/3 van de draden contact op met de oplossing.
- immErse een koolstof staaf elektrode in de etsbad om het circuit te sluiten. Gebruik een veer koperdraad borstel om de ets levering van toepassing op de spindel as, terwijl de spindel draait. Stel de stroom die door de elektroden en de etsoplossing tot 250 mA afgelopen. Stop de tip etsen wanneer de huidige daalt tot 200 mA. De draad tips zullen worden geëtst in zeer fijne punten.
- Pass een geslepen draad door een vlam aan een vet en lijmresten te verwijderen. Leg de draad (stomp uiteinde eerst) in een borosilicaatglas capillair (1,5 mm OD, 0,86 mm ID) met zijn ondereinde geblokkeerd met boetseerklei. Klem de pipet verticaal boven en onder. Trek de pipet met een verwarmingsspiraal (diameter 5 mm, diepte 5 mm) en een zwevende zuiger. Aangezien de draad naar beneden wordt getrokken door het gewicht van de plunjer het gesmolten glas vormt een zeer fijne laag omheen.
- Het glazen die de punt aan de punt van de elektrode met behulp van een gesmolten kraal natrium-tetraborzuur. Aan de korrel te vormen, mengen de natriumtetraboraat (~ 0,25 g) met een kleine hoeveelheid water (~ 0,5 ml) en langzaam plaats het op een verwarmingselement, totdat het smelt in een kraal ~ 2 mm in diameter. De temperatuur van het verwarmingselement wordt bestuurd door een potentiometer. Plaats de kraal en verwarmingselement op een aan de tafel vast manipulator arm, en verplaats het totdat de kraal is gericht onder de microscoop bij een lage vergroting.
- Zet de met glas overdekte draad aan een dia en plaats het onder de microscoop. Beweeg de dia met het podium knoppen totdat de tip en tetraborzuur kralen zijn in focus. Verhit de kraal, totdat het iets smelt, en steek de draad tip ~ 10 - 15 urn. Schakel de verwarming potentiometer af. Als de kraal afkoelt, trekt hij samen en het glas van de punt van de elektrode te verwijderen, waardoor de onderliggende wolfraam. De wolframelektrode is klaar voor gebruik.
2. Multibarrel Glass Pipette Manufacturing
- Bescherm de uiteinden van de meervoudigeglazen vat haarvaten (vijf vaten in H-configuratie) met krimpkous, om een betere grip op de trekker klemmen mogelijk te maken en breuk te voorkomen, en plaats een in de verticale puller.
- Om tip lengte van ~ 15 mm te verkrijgen, zet de trekker op de volgende parameters: Warmte: 84, Sub magneet kracht: 49, Main magneet kracht: 38. Fine-tunen van deze parameters afhankelijk van de configuratie, als na het veranderen van de verwarmingselement.
- Trek de capillaire twee pipetten met tips afgesloten verkrijgen. Monteer een pipet op een dia met behulp van boetseerklei en breek de pipetpunt onder de microscoop tot de buitendiameter is ~ 20 - 30 urn, met behulp van fijne schaar of tang, of de platte kant van een scalpel. Als de gebroken rand te ruw, verfijnen met de tetraboraat kraal techniek in stap 1.7 beschreven.
- Plaats een wolfraamelektrode (uit deel 1) in een houder gemaakt met een 20 G naald aan het einde van een 3-as miniature micropositioner geplaatst op de microscoop herte. Behulp van een tang, buig het uiteinde van de elektrode 5-10 °, ~ 30 mm van de punt.
- Onder de microscoop, zorgvuldig af te stemmen de wolframelektrode over de multibarrel tip. Eenmaal uitgelijnd, laat de elektrode totdat hij de multibarrel, passend in de groef tussen de twee bovenste vaten. Schuif de punt van de elektrode tot het uitsteekt ~ 15 - 20 urn afstand van de punt van de multibarrel. Maak de hoek tussen de elektrode en het multibarrel zo klein mogelijk om een betere hechting te verkrijgen en een dunnere ensemble.
- Breng een druppeltje licht kleefstof ~ 5 mm van de tips. Zorg ervoor dat de lijm niet de punt te bereiken om te voorkomen dat het blokkeren van de multibarrel kanalen.
- Genezen van de lijm met behulp van een blauw licht LED-lamp. Herhaal de lijm application / uitharden indien nodig, voor betere hechting.
- Verplaats de microscoop podium zachtjes tot het einde van de wolfraam elektrode wordt vrijgelaten uit de houder. Verwijder de piggy-back ensemble van de glijbaan.
- wikkel the middengedeelte van het rail-elektrode in een kort stuk krimpkous en toepassen snelle uitharding epoxy geschikt voor glas voor de wolfraamelektrode verder vast aan de multibarrel.
3. Geneesmiddelen voor Microiontophoresis
Opmerking: De geneesmiddelen voor microiontophoresis moet een elektrische lading wanneer opgelost in water. Controleer de literatuur of de drug plaats geschikt voor deze procedure. Hier is de procedure voor gabazine, een antagonist van de GABAA-receptor, beschreven.
- Filter gedestilleerd water met behulp van een 0,2 um spuit filter om het water te steriliseren en te beveiligen die geen opgeloste stoffen. Bereid ~ 1000 ul van 20 mM gabazine met behulp van deze gedestilleerd water.
- De pH van de verdunning tot 4 met 0,2 urn gefiltreerd NaOH met een fijn-tip pH-elektrode.
- Bewaar 100-200 ul fracties bij -20 ºC. Ontdooi op de dag van de opname. Die dag, voordat het dier is bedwingened, vul de vaten (3-5 pl) van de multibarrel elektrode met de drugs, met behulp van een 100 ul injectiespuit voorzien van een flexibele plastic naald.
4. Chirurgie en Headpost Implantatie
- Voeren experimenten in twee mannelijke CBA / J muizen (Mus musculus) met gewichten van 27 en 30 g. Volg chirurgische en registratie procedures van Bryant en collega's 29, Portfors en medewerkers 30-32 en Duque en Malmierca 26.
- In de dagen voor de operatie, omgaan met de dieren wennen ze aan de opname kamer doordat ze vrij te verkennen. Voer 3 sessies per dag, elk van ten minste 30 min. Zo zullen de dieren rustiger en comfortabel tijdens de opnamen.
- Verdoven de muis onder toepassing van een mengsel van ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) intramusculair geïnjecteerd. Met deze dosis het dier diep onder narcose voor ongeveer 1 uur. Geef aanvullende doses van één third van de initiële dosis nodig.
- Plaats het dier op een verwarmingsdeken ingesteld op een temperatuur van 38 ± 1 ° C te handhaven en stabiliseren kop van het dier in een stereotaxisch frame door twee oor bars en een hapje bar. Wees voorzichtig niet om het trommelvlies met het oor bars doorboren.
- Bescherm de ogen door een druppel oftalmische gel.
- Scheer de hoofdhuid met een schaar en toepassen povidonjood de huid te ontsmetten.
- Met behulp van een scalpel, maak dan een incisie over de middellijn aan de schedel bloot te leggen en terug te trekken het beenvlies over de pariëtale en de meer rostrale deel van de occipitale botten.
- Lijm een lichtgewicht duralumin headpost (gewicht ~ 0,65 g, lengte 30 mm, figuur 2A) met een ronde en vlakke ondergrond (5 mm diameter) op de schedel. Lijm een zilveren draad naar het midden van de headpost verlaten van zijn uiteinden vrij. De zilverdraad wordt gebruikt als de referentie-elektrode voor de elektrofysiologische opname.
- Breng een dun laagje light kleefstof op de schedel en de basis van de headpost. Wacht 10 seconden en plaats de headpost over de rostrale gedeelte van de pariëtale botten, over de middellijn.
- Voor een effectieve bonding sterkte, licht genezen van de lijm met behulp van een blauwe lichtbron voor 20 sec.
- Boor drie gaten rond en achter de aanzet van de headpost met een boormachine en een kleine boor.
- Plaats twee horloge schroeven (~ 2 mm lengte) in de gaten te gebruiken als extra contactpunten tussen de schedel en de headstage dienen. De schroeven vereisen 1½ draait om een goede pasvorm te bereiken. Test de schroeven met een tang om ervoor te zorgen dat ze niet los.
- Steek de punt van de zilveren grond draad in het derde gat en zorg ervoor dat de contacten van de dura. Breng een kleine druppel waterbestendig cyanoacrylaat lijm op de draad aan de schedel te binden.
- Apply-licht genezen van composiet om de band van de headpost met de schedel te versterken. De bodem van de headpost, het lage deel van de zilverdraad,en de schroeven, en let niet te verlengen achter lambda, om de toegang mogelijk te maken tijdens het opnemen. Genezen met behulp van een blauw licht bron.
- Trekken de spieren aan de achterkant van de nek nabij de aanhechting aan de schedel. Met een kleine trephine (2,35 mm diameter), boor een rond venster net onder lambda hechtdraad en lateraal van de middellijn, om de inferior colliculus (IC) bloot. Wanneer de grenzen los, trek de bekleding bot met fijne pincet. Als bloeden optreedt, spoel met koud steriele zoutoplossing om het te stoppen.
- Een kleine (~ 1 mm breed en ~ 1 mm) wand rond het raam met composiet en licht uithardende het.
- Bedek de blootgestelde schedel en spier met antibiotische zalf. Vervolgens nat het blootgestelde oppervlak van de IC met steriele zoutoplossing en bedekken met vaseline, vullen de put gegenereerd nadat de muur rond het opnamevenster.
- Injecteer subcutaan buprenorfine (0,03 mg / kg, 1:10 verdund in steriele zoutoplossing) als pijnstiller.
- Houd het dier op tHij verhitten deken totdat ontwaakt en terug in de behuizing kooi om te herstellen van een operatie drie dagen voor opnames. Huis dieren in individuele rattennest huisvesting kooi kooi mates te voorkomen schoonmaken van de gelei en de headpost raak de cover metal-grid. Plaats wat verrijking in de kooi wanneer het dier één is gehuisvest. Ook, dagelijks veranderen het zaagsel om infectie te voorkomen en zorgvuldig te controleren dat het dier naar behoren herstelt en geen tekenen van ongemak vertonen. Ook controleren of vaseline is over de opname venster bescherming van de blootgestelde hersenen.
5. Elektrofysiologische opname en Microiontophoresis
- Na herstel, geef de dieren de tijd om te acclimatiseren aan de opname-omgeving en met zijn hoofd tegengehouden. Acclimatiseren het dier door de vaststelling van de headpost aan de houder, terwijl de muis zit op een op maat gemaakte kussens foam weerhouder gesneden zijn lichaamsgrootte (Figuur 2B). Dit zal limdat de bewegingen van de muis en zal bijdragen aan de rust.
- Begin met 10 min sessies en geleidelijk verhogen van de duur tot 120 min. Tijdens de sessie, belonen de dieren met zoete vloeistoffen (gecondenseerde melk, verdund 30:70 in water) bij gegeven intervallen 33. Later, tijdens de opnamesessie, geven dezelfde beloning aan het begin en aan het einde van de sessie of terwijl er geen neuron wordt geïsoleerd.
- Als dier erg voorafgaand is enthousiast om de opname, injecteer de licht kalmerend acepromazine (2 mg / kg, intraperitoneaal). Volgens de neurale systeem van belang, kan de kalmerende invloed op uw resultaten.
- Laat het dier vrij de opname kamer te verkennen voor 5-10 min.
- Plaats lichaam van het dier in het schuim maat kussens demper (figuur 2B).
- Bevestig de headpost aan een houder bevestigd aan het stereotactische frame (figuur 2C). Dit is een goed moment om het dier een vloeistof beloning.
- Cover lichaam van het dier met een katoenen deken losjes vast met behulp van een halve cilinder en plastic plakband.
- Verwijder de vaseline van het opnamevenster en spoel met warm steriele zoutoplossing.
- Record neurale activiteit en iontoforetische toepassing van gabazine.
- Plaats de multibarrel elektrode op de houder, bestuurd door een microdrive en bevestigd aan een micromanipulator.
- Sluit de draden voor het opnemen, met behulp van kleine krokodil clips. De pluspool aan het einde van de wolfraamelektrode en de aardaansluiting aan de zilverdraad dat contact maakt met de dura.
- Plaats een onbeklede zilverdraad in elk vat, zodat men kopcontacten de oplossing en het andere uiteinde toegankelijk is. Sluit de uiteinden van de microiontophoresis apparaat, volgens de instructies van de fabrikant.
- Beweeg de multibarrel elektrode totdat de tip contact maakt met het oppervlak van de hersenen. Solliciteer warm steriele zoutoplossing om de verdroging van th te voorkomene hersenweefsel. Op dat moment pas een retentie stroom (-10 nA voor gabazine, controleer dan de literatuur voor het specifieke geneesmiddel) om lekkage van het geneesmiddel te voorkomen van de punt vat terwijl op zoek naar enkele eenheid activiteit.
- Gebruik standaard technieken voor het isoleren enkel neuron extracellulaire activiteit. Krijgen de frequentierespons gebied (FRA) van het neuron, namelijk de combinatie van frequenties en intensiteiten kunnen oproepen reactie omdat het neuron is gevoelig voor deze geluiden 34-36.
- Kies twee frequenties (F1 en F2), dat een soortgelijke afvuren snelheid en het patroon op te roepen. Presenteer elk van deze frequenties zo zeldzaam en repetitief stimulus onder de oddball paradigma.
Opmerking: In het kort, in het oddball paradigma, één frequentie (f1) wordt voorgesteld als de repetitieve stimulus met een hoge waarschijnlijkheid van optreden, terwijl de tweede (f2) is het zeldzaam voorkomende afwijkende stimulus, willekeurig afgewisseld tussen de repetitieve degenen. In een tweede excentrieke volgorde, de relatievewaarschijnlijkheden van de twee stimuli omgedraaid. Details van de stimulatie paradigma zijn eerder beschreven 22,37. - Maak de gabazine door het verschuiven van de stroom aan positieve waarden (10 - 20 nA). Verkrijgen nogmaals op de FRA en herhaal de excentrieke paradigma onder de gabazine applicatie. Handhaaf het uitwerpen totdat een zichtbaar effect in de vuursnelheid acht wordt genomen; duurt gewoonlijk 5-20 minuten, afhankelijk van het specifieke geneesmiddel, de concentratie en de grootte van de huidige uitwerpen. Herhaal de opnameprotocol de waarden onder het effect van het geneesmiddel te verkrijgen.
- Stop de injectie door terug te keren naar de huidige waarden vasthouden. Wacht tot het effect van het geneesmiddel weg te wassen door het bewaken van het FRA of reactie op de oddball paradigma terug naar controlewaarden.
Opmerking: De opnamesessies kan duren 2-3 uur per dag, en moet eerder worden beëindigd als het dier toont enig teken van ongemak of worstelen. Geef beloning vloeistof en hebben betrekking op de opname chamber met vaseline.
6. Data Analysis
- Meet de FRA voor en tijdens de gabazine injectie en het niveau van SSA.
- Kwantificeren van de sterkte van SSA reactie van het gemeenschappelijk-SSA (CSI) en frequentiespecifieke SSA index (SI) zoals eerder beschreven 19,22,23,38,39. CSI en SI tijdens het genormaliseerde verschil tussen de neuronale reactie op de zeldzame stimulus en de respons op het repetitief. Positieve CSI en SI waarden geven de neurale respons (spikes per stimulus) hoger te zeldzamer dan repetitieve tinten.
- Vergelijk gegevens van de controle en de drug ejectie conditie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We namen de single-eenheid activiteit van 4 goed geïsoleerde neuronen van het IC. Typische signaal-ruisverhouding verkregen bij extracellulaire opnames wakker muizen zijn getoond in Figuur 3B. Figuur 4A geeft de frequentierespons gebied (FRA) van elk neuron voor en tijdens de blokkade van de GABAA-receptoren met gabazine. Een toename in de reactie kracht (spikes / stimulus) en een verbreding van de spectrale tuning waargenomen. De toename in de opgewekte reactie was ook duidelijk in de geaccumuleerde peri-stimulus tijd histogrammen verkregen uit de neurale respons op alle frequenties en intensiteiten gepresenteerd (Figuur 4B).
Eén of twee paren frequenties binnen het FRA neuron doorkruist (figuur 4A) werden gekozen als herhaalde of zeldzame geluiden moeten worden aangebracht excentriek paradigma te sTudy het niveau van SSA in hun antwoorden. Twee bijvoorbeeld neuronen, het geluid opgewekte responsen op elke frequentie (f1 en f2) voor en tijdens de injectie gabazine worden als dot rasters in figuur 5A, B. Voor beide bijvoorbeeld neuronen, was er een duidelijk verschil in het geluid opgewekte reacties zoals waargenomen in de dot raster en PSTHs.
Ook de lokale blokkade van de GABA A-receptoren verhoogde de neuronale respons op de meeste zeldzame en repetitieve tonen (figuur 5C) in overeenstemming met onze eerdere studie 16. Verschillende SSA waargenomen in de neurale reacties op f1 en f2, wat tot uiting kwam in positieve CSI (CSI interval: -0,26 tot 0,43, 0,25 ± 0,23) en SI waarden (SI interval: -0,41 tot 0,83, 0,25 ± 0,23) . Voor de meeste gevallen, de toegenomen respons op het repetitieve geluid veroorzaakte een daling van de indices zoals waargenomen in Figuur 5D
Figuur 1 voor de vervaardiging van wolfraamelektroden. (A) elektrode alignment tool, met een aantal wolfraam draden op zijn plaats. Hoe lichter stuk aan de linkerkant is een halte voor de draden. De schaar tip geeft de zijde gebruikt als leidraad voor het snijden van de draden op de gewenste lengte. (B) Lege spil. (C) Spindel met een partij van elektroden, en rust op een houder. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
Figuur 2. Accessoires voor Awake Muizen Recordings. (A) Headpost. (B) Custom-made kussens schuim weerhouder. plaats tHij muis in tussen beide stukken, buiten laat de kop. (C) Wijzigingen in de stereotaxische frame. De headpost houder (bovenste balk) assisteert tijdens headpost implantatie en weerhoudt het hoofd tijdens de opnames. De beet stuk (onderste balk) wordt alleen gebruikt tijdens de headpost implantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Voorbeeld van een opname in de Wakkere Muis. (A) Frequentie gebied van een neuron van de muis IC. (B) De golfvormen van de pieken opgenomen van het neuron. (C, D) Dot raster en peristumulus-time histogram opgenomen naar het neuron via excentriek paradigma bepaalde frequentie aangegeven door de stippen in (A). Hertekend van datagepubliceerd in Duque en Malmierca 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Effect van de blokkade van de GABA A-receptoren op de Spectral en Temporal Response Properties. (A) Frequentie gebied van de vier IC opgenomen neuronen voor en tijdens de injectie van microiontophoretic gabazine. De zwarte kruizen in (A) geven de frequenties gekozen worden gepresenteerd als zeldzame en repetitief geluid. (B) verzameld peri-stimulus tijd histogrammen van de neurale respons op alle frequenties en intensiteiten gepresenteerd aan de antwoordgebied construct voor en tijdens de injectie van gabazine. De zwarte balken geven het geluid duur.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Effect van de blokkade van GABA A-receptoren op het antwoord op Repetitive en Rare geluiden. (A, B) Dot rasters van de spiking reactie op een paar frequenties gepresenteerd als zeldzaam (rood, 10%) en repetitieve stimulus (blauw, 90%) voor en tijdens het aanbrengen van gabazine. Elke frequentie wordt gespeeld in twee sequenties zodanig dat ieder werd voorgesteld als zeldzaam- en repetitief. De gearceerde achtergrond geeft de duur van de stimulus. (C). Één neuron reacties op zeven paren frequenties voorgesteld als zeldzaam en de repetitieve geluid voor en tijdens het aanbrengen van gabazine. (D) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De microiontophoresis van neuro-actieve stoffen in wakkere dieren is een krachtige techniek sonderen en ontleden de rol van specifieke synaptische ingangen van de activiteit van enkele neuronen 40,41. Nog belangrijker, deze procedure maakt de bepaling van het effect van de neurotransmitters en neuromodulatoren op neurale circuits zonder de mogelijke storing van anesthetica. Hier laten we zien dat de toepassing van gabazine in de IC van wakkere muizen krachtig heeft de frequentie tuning (figuur 4A), de temporele respons patronen (figuur 4B) en de SSA (figuur 5).
De belangrijkste beperking van de beschreven procedure is relatief kort is (~ 3 uur), die wordt bepaald door het niveau van gewenning van de dieren aan de opnames. Anderzijds kunnen meerdere opnames worden uitgevoerd op hetzelfde dier. Met behulp van microiontophoresis Het is onduidelijk hoe verde toegepaste neuroactieve stoffen diffunderen in het omringende weefsel. Daarom kan een mogelijk effect op neuronale netwerkactiviteit worden opgewekt door die niet alleen de opgenomen neuron maar ook het omringende gliale en neuronale cellen. Bijvoorbeeld, snoep en collega's 42 hebben aangetoond dat bepaalde iontoforetisch afgegeven moleculen, die niet snel worden verwijderd, kunnen diffunderen tot 600 urn. In de muizen IC Er reeks meeste van de omvang van de dendritische cilinders omvatten, maar beïnvloeden ook de neuronale respons van aangrenzende cellen. Samengevat, het vrijgemaakt geneesmiddel door iontoforese wordt niet ruimtelijk beperkt intracellulaire drug dialyse, die de ontleding van fijnere details van de synaptische ingangen naar het doel neuron en testen van lokale netwerk kunnen verwerkt 16,43 is specifieker dan andere experimentele procedures gebruikt om het niveau van neurotransmissie of neuromodulatie, zoals systemische injectie, het gebruik van optogenetic technieken of push-pul manipulerenl dialyse.
De tip diameter van het glazen pipetten en de omvang van de retentie en injectiestromen zijn sleutelfactoren volgen om niet-specifieke drugs lekkage in het weefsel te vermijden. De lage injectiestromen (van de orde van tientallen nA) beperken de verspreiding van het geneesmiddel voor opname van neuronen dicht bij elkaar. Bijvoorbeeld drie van de vier neuronen als voorbeeld (neuronen 1-3) werden opgenomen langs hetzelfde spoor met afstanden van 16 en 800 urn tussen hen. Ondanks de korte afstand van 16 urn tussen neuron 1 en 2, een duidelijk andere reactie van neuron 2 werd waargenomen (Figuur 4).
Sommige alternatieven voor de voorgestelde piggy-back configuratie zijn eerder gebruikt. Een daarvan bestaat uit het gebruik van één van de multibarrel pipetten voor het opnemen, in plaats van een afzonderlijke elektrode. Hoewel de constructie van de ensembles minder ingewikkeld in dit geval zijn er nadelen. First, worden alle kanalen dezelfde openingsdiameter aan het uiteinde, die niet optimaal zijn voor zowel opname als medicijnafgifte bedraagt. Ook de uitstekende elektrode tip in de piggy-back configuratie voorkomt schade aan de doelcel waarschijnlijk veroorzaakt door het bredere uiteinde van de multibarrel. Het tweede alternatief is het gemeenschappelijke gebruik van één vat glazen pipetten voor het opnemen 15,44 plaats wolfraamelektroden. Glazen elektroden zijn gemakkelijk te produceren om de vereiste afmetingen, maar hebben de neiging om verstoppen tijdens lange opnames of wanneer diep reizen in de hersenen, dus in onze ervaring wolframelektroden bieden meer betrouwbare opnames. Bovendien, door gebruik wolfraamelektroden is het mogelijk elektrolytische laesie produceren om de opname locaties lokaliseren zonder verdere histologische ingewikkelde procedures vereist wanneer een neuraal tracer injectie wordt gebruikt 45. Het gebruik van multibarrel glazen pipetten maakt de afgifte van meervoudige agonisten en / of antagonisten dicht bij de opnameplaats, hetgeen een enorm voordeel wanneer de interactie tussen neurotransmittersystemen op sensomotorische integratie wordt onderzocht.
De in het onderhavige protocol beschreven voor de vervaardiging van de rail-elektroden procedures mogelijk maken registrerende elektroden produceren volgens de specifieke eisen van het experiment en de eigenschappen van het betreffende gebied van interesse op een systematische, maar aangepaste wijze. Bovendien worden de materialen voor de fixatie headpost gewoonlijk in de tandheelkunde zodat ze gemakkelijk beschikbaar. Zo is de kritische stappen in het protocol zijn de dieren gewenning en het etsen van de wolfraamelektroden, die de belangrijkste factoren die bijdragen aan goed geïsoleerde neuronen en stabiele elektrofysiologische opnames. Algemeen is deze techniek relatief eenvoudig, economisch en betrouwbaar als middel om de huid van diverse neuro-actieve stoffen op één of meerdere eenheid neuronale activiteit in wakkere bestuderen hoofd-ingetogen muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de MINECO verleent BFU201343608-P en PSI2013-49348-EXP, en de JCYL subsidie SA343U14 aan MSM en MRC basisfinanciering aan ARP. YAA hield een CONACyT (216.106) en een fellowship september.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
References
- Harris, K. D., Thiele, A.
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
- Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
- Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
- Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
- Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
- Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
- Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
- Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
- Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
- Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
- Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
- Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
- Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
- Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
- Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
- Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
- Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
- Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
- Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
- Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
- Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
- von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
- Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
- Merrill, E. G., Ainsworth, A.
- Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
- Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
- Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
- Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
- Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
- Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
- Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
- Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
- Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
- Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
- Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
- LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).
