Abstract
Le differenze dell'attività di neurotrasmettitori e neuromodulatori, e di conseguenza diverse risposte neurali, si può rinvenire tra animali anestetizzati e sveglio. Pertanto, i metodi che consentono la manipolazione dei sistemi sinaptiche in animali svegli sono necessari al fine di determinare il contributo degli ingressi sinaptici al trattamento neuronale influenzata da anestetici. Qui, presentiamo metodologia per la realizzazione di elettrodi per registrare simultaneamente attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione in topi sveglio. Grazie alla combinazione di queste procedure, abbiamo effettuato iniezioni microiontophoretic di gabazine per bloccare selettivamente i recettori GABA A nei neuroni del collicolo inferiore di topi testa-trattenuto. Gabazine modificato con successo proprietà di risposta neurale come l'area risposta in frequenza e l'adattamento specifico per stimolo. Così, abbiamo dimostrato che i nostri metodi sono adatti per Recording attività singola unità e per sezionare il ruolo dei recettori del neurotrasmettitore specifici in elaborazione uditiva.
La limitazione principale della procedura descritta è il tempo di registrazione relativamente breve (~ 3 ore), che è determinato dal livello di assuefazione dell'animale alle sessioni di registrazione. D'altro canto, più sessioni di registrazione possono essere eseguite nello stesso animale. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre procedure sperimentali utilizzate per manipolare il livello della neurotrasmissione o neuromodulation (come iniezioni sistemici o l'uso di modelli optogenetic), è che l'effetto del farmaco si limita agli ingressi sinaptici locali al neurone bersaglio. Inoltre, la misura fabbricazione di elettrodi permette la regolazione di parametri specifici in base alla struttura neurale e tipo di neurone di interesse (ad esempio la resistenza suggerimento per migliorare il rapporto segnale-rumore delle registrazioni).
Introduction
L'interazione tra l'eccitazione e l'inibizione neuronale è fondamentale per l'elaborazione delle informazioni sensoriali 1. È anche noto che l'anestesia ha un forte impatto sulla dinamica di attivazione corticale e il pattern temporale degli ingressi sinaptici 2,3. Ad esempio, è stato osservato che gli anestetici alterano la durata di risposte visivamente evocati nei neuroni corticali 3,4. Inoltre, il rapporto tra eccitatori e gli ingressi sinaptici inibitori è diverso in animali anestetizzati e svegli 4,5, alterando sia evocata e tassi di attività spontanee 6,7. Misurando le conduttanze sinaptiche, Haider e colleghi hanno scoperto che l'inibizione 4 abbinato eccitazione in ampiezza in anestesia mentre durante la veglia, l'inibizione era più forte di eccitazione. Questi risultati inducono lo sviluppo di procedure sperimentali per studiare l'impatto degli ingressi sinaptici specifiche sulla elaborazione sensoriale in animali svegli.
<p class = "jove_content"> L'espulsione controllato di sostanze neuroattivi cariche applicando piccole iniezioni di corrente (dell'ordine di nA) è stato ampiamente utilizzato per studiare il contributo degli ingressi sinaptici e il ruolo dei recettori delle cellule putativi in elaborazione sensoriale 8-13 . Questa tecnica, nota come microiontophoresis, consente l'applicazione di farmaci in prossimità del neurone registrato, che contribuisce ad un rapido effetto e confinato. Questa procedura è più adatto per studiare effetti locali di sostanze neuroattivi, rispetto all'effetto diffusa suscitata da altre manipolazioni sperimentali come iniezioni sistemiche, microdialisi o l'uso di tecniche optogenetic. Di solito, una configurazione degli elettrodi piggy-back 14,15 viene utilizzato per registrare contemporaneamente il neurone bersaglio e fornire i sostanze neuroattivi di interesse. È costituita da un elettrodo di registrazione collegato a una pipetta multibarrel che trasporta le sostanze neuroattivi. Modifiche del oProcedura riginal descritta da Havey e Caspary 14 sono state attuate. Ad esempio, un elettrodo di tungsteno, invece di un vetro, può essere utilizzato per registrare l'attività neurale 16. Metodi precedentemente pubblicati per la fabbricazione di elettrodi di tungsteno 17,18 coinvolgono tre fasi generali: incisione elettrolitica di consigli filo di tungsteno, vetro isolante, e la regolazione dell'esposizione punta a soddisfare i requisiti di registrazione.Un campo interessante ed emergente nel campo delle neuroscienze uditivo è lo studio di adattamento specifiche stimolo (SSA 19). SSA è una diminuzione specifica nella risposta neurale a suoni ripetitivi che non generalizzano ad altri suoni, raramente presentati. L'importanza di SSA risiede nel suo ruolo potenziale di rilevamento devianza sottostante meccanismo neurale nel cervello uditivo, così come una possibile correlato neuronale per la componente tardiva disallineamento negatività uditivo potenziali evocati 20,21. SSA occurs dalla IC fino alla corteccia uditiva 19,22-24. GABA A inibizione mediata ha dimostrato di agire come un meccanismo di controllo di guadagno su SSA 7,16,25, che è stato anche dimostrato di essere colpiti da anestesia 26. Qui vi presentiamo un protocollo che combina i metodi descritti in precedenza per registrare l'attività singola unità di neuroni IC prima e durante l'applicazione di un antagonista selettivo dei recettori GABA A nei topi sveglio. In primo luogo, si descrive la fabbricazione di elettrodi piggy-back e il prossimo, i metodi chirurgici e di registrazione. Per verificare l'efficacia di rilascio del farmaco, abbiamo confrontato campo recettivo così come il livello di SSA di neuroni IC prima e durante l'espulsione microiontophoretic di gabazine.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso l'Università di Salamanca, con l'approvazione di, e con metodi conformi alle norme del, l'Università del comitato Animal Care Salamanca, nonché le norme dell'Unione europea (direttiva 2010/63 / UE) per l'uso degli animali nella ricerca neuroscientifica.
1. elettrodi di tungsteno
Nota: La fabbricazione di elettrodi di tungsteno è basato sulla tecnica originale descritta in Merrill e Ainsworth 27 e Ainsworth et al 28 e eseguita utilizzando la configurazione workstation descritto in Bullock et al 17...
- Per registrare una sola unità di attività extracellulare dei neuroni IC, usare elettrodi con impedenza punta di 1,5-2,5 MW. Qui, le fasi coinvolte nella produzione di elettrodi di tungsteno sono descritti solo brevemente, poiché una descrizione dettagliata è riportata nei riferimenti sopra citati.
- Mettere fili di tungsteno in un allineamento su misurautensile (Figura 1A) assistere tagliandoli alla lunghezza desiderata. Lo strumento di allineamento consiste di 30 aghi (25 G) incollati in parallelo ad intervalli di 2 mm, con una sosta ad una estremità per limitare la lunghezza dei fili a ~ 40 mm. Fissare accuratamente le estremità dei fili con nastro adesivo, e tagliare il resto del filo con le forbici forti.
- Tirare leggermente dal nastro al fine di rimuovere i fili di tungsteno dallo strumento di allineamento, facendo in modo che tutti i fili rimangono attaccati al nastro. Rotoli il nastro su un fuso ottone lucido (Figura 1B, C), che tiene i fili saldamente contro il mandrino per cui vi è un buon collegamento elettrico.
- Collegare il mandrino ad un motore 5 giri nella stazione di lavoro, e immergere le punte fili sporgenti in una soluzione di incisione (KNO 2, 90 g per 80 ml). Angolo mandrino dell'asse 45 ° rispetto alla superficie della soluzione di attacco. Immergere le estremità dei fili in modo che ~ 1/3 dei fili di contatto della soluzione.
- ImmERSE un elettrodo dell'asta del carbonio nel bagno di attacco per chiudere il circuito. Utilizzare un pennello treccia di rame molla di applicare la fornitura di attacco al mandrino mentre il mandrino è in rotazione. Regolare la corrente che viene fatta passare attraverso gli elettrodi e la soluzione di attacco a 250 mA. Interrompere l'incisione punta quando la corrente scende a 200 mA. Le punte di filo verranno incisi in punti molto sottili.
- Far passare un filo affilato attraverso una fiamma per rimuovere eventuali residui di grasso ed adesivo. Posizionare il filo (estremità smussata prima) in un capillare di vetro borosilicato (1,5 mm di diametro, 0,86 millimetri ID) con la sua estremità inferiore bloccato con plastilina. Fissare la pipetta verticalmente in alto e in basso. Estrarre la pipetta utilizzando una bobina di riscaldamento (5 mm di diametro, profondità 5 mm) e uno stantuffo sospesa. Poiché il filo viene tirato dal peso del pistone, il vetro fuso forma una finissima cappotto intorno.
- Rimuovere il vetro che copre la punta alla estremità appuntita dell'elettrodo con l'aiuto di un cordone fuso di sodiotetraborato. Per formare il tallone, mescolare il tetraborato di sodio (~ 0,25 g) con una piccola quantità di acqua (~ 0,5 ml) e lentamente posizionarlo su un elemento riscaldante, finché non si scioglie in un cordone ~ 2 mm di diametro. La temperatura dell'elemento di riscaldamento è controllato da un potenziometro. Posizionare il tallone e resistenza su un braccio manipolatore fisso al tavolo, e spostarla fino al tallone è focalizzata al microscopio a basso ingrandimento.
- Fissare il filo con copertura in vetro a una diapositiva e posizionarlo sotto il microscopio. Spostare la slitta con le manopole di scena fino a quando la punta e tallone tetraborato sono a fuoco. Riscaldare il tallone fino a quando si scioglie un po ', e inserire la punta del filo ~ 10 - 15 micron. Girare il potenziometro riscaldamento spento. Come il tallone si raffredda, si contrae e rimuoverà il vetro dalla punta dell'elettrodo, esponendo il tungsteno sottostante. L'elettrodo di tungsteno è pronto all'uso.
2. multibarrel pipetta di vetro Manufacturing
- Proteggere le estremità del Multicapillari di vetro barile (cinque barili in H-configurazione) con una guaina termoretraibile, per consentire una migliore presa ai morsetti estrattore e prevenire la rottura, e mettono uno in estrattore verticale.
- Per ottenere lunghezze punta di ~ 15 mm, impostare l'estrattore ai seguenti parametri: Heat: 84, Sub forza magnete: 49, principale forza di magnete: 38. Mettere a punto questi parametri a seconda della particolare configurazione, così come dopo la modifica della termosifone.
- Tirare il capillare per ottenere due pipette con le punte occluse. Montare una pipetta su un vetrino utilizzando plastilina e rompere la punta della pipetta al microscopio fino a quando il diametro esterno è ~ 20 - 30 micron, con le forbici o pinze sottili, o la parte piatta di un bisturi. Se il bordo spezzato è troppo ruvida, raffinarlo utilizzando la tecnica tetraborato tallone descritto nel punto 1.7.
- Posizionare un elettrodo di tungsteno (dalla sezione 1) in un supporto realizzato con un ago 20 G al termine di un 3 assi micropositioner miniatura montato sul maschio microscopioe. Utilizzando pinze, piegare l'estremità dell'elettrodo 5 - 10 °, circa 30 mm dalla punta.
- Sotto il microscopio, allineare con cura l'elettrodo di tungsteno sulla punta multibarrel. Una volta allineata, abbassare l'elettrodo finché non tocca la multibarrel, inserendosi nel solco tra le due canne superiore. Far scorrere la punta dell'elettrodo e farlo fuoriuscire ~ 15 - 20 micron dalla punta del multibarrel. Effettuare l'angolo tra l'elettrodo ed il multibarrel più piccolo possibile per ottenere un incollaggio migliore e un insieme più sottile.
- Applicare una piccola goccia di luce-curabili adesivo di ~ 5 mm di distanza dalle punte. Fate attenzione che la colla non raggiunge la punta per evitare di bloccare i canali multibarrel.
- Curare la colla utilizzando una lampada luce blu a LED. Ripetere la colla applicazione / polimerizzazione, se necessario, per una migliore adesione.
- Spostare palco microscopio delicatamente fino alla fine del tungsteno è liberato dal suo supporto. Rimuovere l'ensemble piggy-back dalla diapositiva.
- avvolgere °e sezione centrale dell'elettrodo piggy-back in un breve tratto di tubo termoretraibile e applicare rapidamente adeguato indurimento resina epossidica per il vetro per garantire ulteriormente l'elettrodo di tungsteno al multibarrel.
3. Farmaci per Microiontophoresis
Nota: I farmaci utilizzati per microiontophoresis devono avere una carica elettrica quando disciolto in acqua. Controllare letteratura per vedere se il farmaco di interesse è appropriato per questa procedura. Qui, la procedura per gabazine, un antagonista del recettore GABA A, è descritto.
- Filtrare l'acqua distillata con un filtro siringa da 0,2 micron per sterilizzare l'acqua e garantire che non contiene soluti. Preparare ~ 1.000 ml di 20 mm gabazine usando questa acqua distillata.
- Regolare il pH della diluizione a 4 con 0,2 micron filtrata NaOH utilizzando un elettrodo di pH fine-tip.
- Conservare 100 - 200 aliquote microlitri a -20 ° C. Scongelare il giorno della registrazione. Quel giorno, prima che l'animale è frenareed, riempire le botti (3 - 5 microlitri) dell'elettrodo multibarrel con i farmaci, utilizzando una microsiringa da 100 microlitri con ago plastica flessibile.
4. Chirurgia e Headpost impianto
- Effettuare esperimenti in due topi maschi CBA / J (Mus musculus) con pesi di 27 e 30 g. Seguire le procedure chirurgiche e la registrazione di Bryant e colleghi 29, Portfors e collaboratori 30-32, e Duque e Malmierca 26.
- Nei giorni precedenti l'intervento chirurgico, di gestire gli animali e li abituarsi alla camera di registrazione, consentendo loro di esplorare liberamente. Eseguire 3 sessioni al giorno, ciascuna della durata di almeno 30 minuti. In questo modo gli animali sarà più tranquillo e confortevole durante le registrazioni.
- Anestetizzare il mouse usando una miscela di ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) iniettato per via intramuscolare. Con questa dose l'animale è profondamente anestetizzati per circa 1 ora. Dare dosi supplementari di una third della dose iniziale, se necessario.
- Posto l'animale in una termocoperta regolato per mantenere una temperatura di 38 ± 1 ° C e stabilizzare la testa dell'animale in un telaio stereotassico utilizzando due barre orecchio e un bar morso. Fare attenzione a non forare la membrana timpanica con le barre orecchio.
- Proteggere gli occhi applicando una goccia di gel oftalmico.
- Shave il cuoio capelluto con le forbici e applicare iodopovidone per disinfettare la pelle.
- Usando un bisturi, fare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritirare il periostio che copre il parietale e la parte più rostrale delle ossa occipitali.
- Colla un headpost leggero in duralluminio (peso ~ 0,65 g, lunghezza 30 mm, Figura 2A) con un giro e base piatta (diametro 5 mm) sul cranio. Colla un filo d'argento per mezzo della headpost lasciando sue estremità libera. Il filo di argento viene utilizzato come elettrodo di riferimento per la registrazione elettrofisiologica.
- Applicare uno strato sottile di ligAdesivo HT-induribile sul cranio e la base del headpost. Attendere 10 secondi e posizionare il headpost sopra la zona rostrale delle ossa parietali, lungo la linea mediana.
- Per una resistenza di legame efficace, fotopolimerizzare l'adesivo utilizzando una sorgente di luce blu per 20 sec.
- Praticare tre fori intorno e dietro la base del headpost utilizzando un trapano elettrico e una piccola punta.
- Inserire due viti di orologi (~ 2 mm di lunghezza) nei fori per servire come punti di contatto aggiuntivi tra il cranio e la headstage. Le viti richiedono 1½ giri per ottenere una perfetta aderenza. Testare le viti con pinze per assicurarsi che essi non siano allentati.
- Inserire la punta del filo di terra d'argento nel terzo foro facendo attenzione che i contatti della dura. Applicare una piccola goccia di cianoacrilato resistente colla di acqua per legare il filo al cranio.
- Applicare composito fotopolimerizzabile rinsaldare il vincolo della headpost con il cranio. Coprire la base del headpost, la parte bassa del filo d'argento,e le viti, facendo attenzione a non estendere dietro lambda, per consentire l'accesso durante la registrazione. Cure utilizzando una sorgente di luce blu.
- Ritrarre muscolo alla nuca vicino al suo inserimento sul cranio. Con un piccolo trapano (2,35 mm di diametro), praticare una finestra rotonda appena sotto lambda di sutura e lateralmente alla linea mediana, per esporre il collicolo inferiore (IC). Quando i confini sono sciolti, tirare su l'osso copertura con le pinzette sottili. In caso di emorragia, sciacquare con soluzione salina sterile a freddo per fermarlo.
- Fai un piccolo (~ 1 mm di larghezza e ~ 1 mm di altezza) muro attorno alla finestra con composito e fotopolimerizzare esso.
- Coprire il cranio esposto e muscolo con pomata antibiotica. Poi, bagnare la superficie esposta del IC con soluzione salina sterile e coprire con vaselina, riempiendo il pozzo generato dopo aver effettuato la parete attorno alla finestra di registrazione.
- Iniettare buprenorfina per via sottocutanea (0,03 mg / kg, diluito 1:10 in soluzione fisiologica sterile) come analgesico.
- Mantenere l'animale su tegli riscaldamento coperta fino a quando non si sveglia e tornare alla sua gabbia abitazioni per recuperare da un intervento chirurgico per tre giorni prima di sessioni di registrazione. animali domestici in gabbia abitazioni rat's individuale per prevenire compagni di gabbia ripulire la gelatina e la headpost toccare il coperchio metallico a griglia. Mettere un po 'di arricchimento nella gabbia quando l'animale è unico ospitato. Inoltre, cambiare ogni giorno la segatura per prevenire l'infezione e controllare attentamente che l'animale recupera correttamente e non mostra alcun segno di disagio. Controllare anche se vaselina è sopra la finestra di registrazione proteggere il cervello esposto.
5. registrazione elettrofisiologica e Microiontophoresis
- Dopo il recupero, dare il tempo di animale per acclimatarsi all'ambiente registrazione e avente la sua testa trattenuto. Acclimatare l'animale fissando la headpost al titolare mentre il mouse è seduto su un dispositivo di immobilizzazione di schiuma imbottita misura scolpito alla sua dimensione del corpo (Figura 2B). Questo lim volontàche i movimenti del mouse e contribuirà alla sua calma.
- Inizia con 10 sessioni minimo e progressivamente aumentare la durata fino a 120 min. Durante la sessione, premiare gli animali con liquidi dolci (latte condensato, diluito in acqua 30:70) ad intervalli di 33. Successivamente, durante la sessione di registrazione, alla stessa ricompensa all'inizio e alla fine della sessione o mentre nessun neurone è isolato.
- Se animale è molto eccitato prima della registrazione, iniettare il acepromazine lieve sedativo (2 mg / kg, intraperitoneale). Secondo il sistema neurale di interesse, il sedativo può influenzare i risultati.
- Lasciate che l'animale liberamente esplorare la camera di registrazione per 5 - 10 minuti.
- Posizionare il corpo dell'animale nel dispositivo di immobilizzazione imbottito in schiuma su misura (Figura 2B).
- Fissare il headpost ad un supporto fissato al telaio stereotassica (Figura 2C). Questo è un buon momento per dare all'animale una ricompensa liquido.
- cover corpo dell'animale con una coperta di cotone e liberamente fissarlo utilizzando un hemicylinder plastica e nastro adesivo.
- Rimuovere la vaselina dalla finestra di registrazione e risciacquare con acqua calda salina sterile.
- attività neurale Record e l'applicazione di iontoforetico gabazine.
- Posizionare l'elettrodo multibarrel al suo titolare, controllata da un microdrive e attaccato ad un micromanipolatore.
- Collegare i fili per la registrazione, utilizzando piccoli morsetti a coccodrillo. Collegare il terminale positivo al terminale dell'elettrodo di tungsteno, e il terminale di terra al filo d'argento che contatti la dura.
- Inserire un filo d'argento non rivestito all'interno di ogni cilindro, quindi una contatti termine la soluzione e l'altra estremità è accessibile. Collegare tali estremità al dispositivo microiontophoresis, seguendo le istruzioni del produttore.
- Spostare l'elettrodo multibarrel finché la punta la superficie del cervello. Applicare calda salina sterile per prevenire l'essiccazione di the tessuto cerebrale. A quel punto applicare una corrente di ritenzione (-10 nA per gabazine, controllare la letteratura per la particolare farmaco) per evitare perdite del farmaco dalla punta barile, mentre alla ricerca di attività singola unità.
- Utilizzare le tecniche standard per isolare singolo neurone attività extracellulare. Ottenere l'area risposta in frequenza (FRA) del neurone, cioè la combinazione di frequenze ed intensità capaci di evocare una risposta perché il neurone è sensibile a questi suoni 34-36.
- Scegli due frequenze (F1 e F2) che evocano un tasso di fuoco simile e modello. Presentare ciascuna di queste frequenze di stimolo come rara e ripetitivo sotto il paradigma oddball.
Nota: Brevemente, nel paradigma oddball, una frequenza (f1) si presenta come stimolo ripetitivo con un'alta probabilità di accadimento, mentre il secondo (f2) è lo stimolo deviante raramente si verificano, intervallati in modo casuale tra quelli ripetitivi. In una seconda sequenza eccentrico, la relativaprobabilità dei due stimoli sono invertiti. Dettagli del paradigma di stimolazione sono stati descritti in precedenza 22,37. - Rilasciare il gabazine spostando la corrente a valori positivi (10 - 20 nA). Ottenere di nuovo la FRA e ripetere il paradigma oddball sotto l'applicazione gabazine. Mantenere l'espulsione fino a quando un effetto visibile nella frequenza di scarica si osserva; esso solitamente 5 - 20 min, a seconda del particolare farmaco, la sua concentrazione, e la grandezza della corrente di espulsione. Ripetere il protocollo di registrazione per ottenere i valori sotto l'effetto del farmaco.
- Interrompere l'iniezione con il ritorno della corrente ai valori di ritenzione. Attendere l'effetto del farmaco per lavare via controllando che la FRA o la risposta al paradigma oddball torna ai valori di controllo.
Nota: Le sessioni di registrazione può durare 2-3 ore al giorno, e si dovrebbe porre termine prima, se l'animale mostra alcun segno di disagio o difficoltà. Dare liquido ricompensa e coprire il cap di registrazioneambrato con vaselina.
Analisi 6. Dati
- Misurare la FRA prima e durante l'iniezione gabazine così come il livello di SSA.
- Quantificare la forza della risposta SSA dall'indice comune SSA (CSI) e l'indice SSA specifica frequenza (SI) come descritto in precedenza 19,22,23,38,39. Il CSI e SI riflettono la differenza normalizzata tra la risposta neuronale alla rara stimolo e la risposta al ripetitivo. Valori positivi CSI e SI indicano la risposta neurale (picchi per stimolo) è risultata maggiore di rara rispetto ai toni ripetitivi.
- Confrontare i dati dalla condizione di controllo ed espulsione della droga.
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Representative Results
Abbiamo registrato l'attività singola unità di 4 neuroni ben isolate della IC. Tipici rapporti segnale-rumore ottenuti durante le registrazioni extracellulari in topi svegli sono mostrati in Figura 3B. Figura 4A mostra l'area risposta in frequenza (FRA) di ogni neurone prima e durante il blocco del GABA A recettori con gabazine. È stato osservato un incremento nella forza risposta (picchi / stimolo) e un ampliamento della sintonizzazione spettrale. L'incremento della risposta evocata era evidente anche negli istogrammi tempo peri-stimolo accumulati ottenuti dalla risposta neurale a tutte le frequenze ed intensità presentato (Figura 4B).
Uno o due coppie di frequenze all'interno del neurone FRA (croci in figura 4a) sono stati scelti per essere presentati come suoni ripetitivi o rari in un paradigma oddball, a sTUDY il livello di SSA nelle loro risposte. Per due neuroni esempio, il suono risposte evocati per ogni frequenza (F1 e F2) prima e durante l'iniezione gabazine sono mostrati come raster punti in figura 5A, B. Per i due neuroni esempio, c'è stato un netto cambiamento nella risposta audio-evocata come osservato nel dot raster e PSTHs.
Analogamente, il blocco locale dei recettori GABA A aumentato la risposta neuronale per la grande maggioranza dei toni rare e ripetitive (Figura 5C) in accordo con il nostro studio precedente 16. Sono stati osservati diversi livelli di SSA nelle risposte neurali alla F1 e F2, che si è riflesso in positivo CSI (intervallo di CSI: -0.26 a 0.43, 0.25 ± 0.23) e valori SI (intervallo di Sis: -0.41 a 0.83, 0.25 ± 0.23) . Per la maggior parte dei casi, l'aumento della risposta al tono ripetitivo causato un calo tali indici come osservato nella Figura 5D
Figura 1. Il materiale per la fabbricazione di tungsteno elettrodi. Strumento di allineamento (A) elettrodo, con alcuni fili di tungsteno a posto. Il pezzo più leggero sulla sinistra è una fermata per i fili. La punta forbice indica il lato utilizzato come guida per il taglio dei fili alla lunghezza desiderata. (B) del mandrino vuoto. (C) Mandrino con una serie di elettrodi collegati, e che poggia su un supporto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Accessori per le registrazioni Mouse sveglio. (A) Headpost. (B) Su ordine imbottito restrainer schiuma. luogo tegli mouse tra i due pezzi, lasciando la testa fuori. (C) Le modifiche al telaio stereotassico. Il titolare headpost (barra in alto) assiste durante headpost impianto e trattiene il capo durante le registrazioni. Il pezzo morso (barra inferiore) viene utilizzato solo durante l'impianto headpost. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Esempio di registrazione del mouse sveglio. (A) superficie di risposta in frequenza di un neurone dal mouse IC. (B) Le forme d'onda dei picchi rilevati da questo neurone. (C, D) Dot raster e peristumulus istogramma in tempo registrato da questo neurone utilizzando un paradigma oddball alle frequenze indicate dai punti in (a). Ridisegnato dai datipubblicato nel Duque e Malmierca 26. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Effetto del blocco del GABA A recettori sulla spettrali e temporali proprietà di risposta. (A) Frequenza zona risposta dei quattro IC registrato neuroni prima e durante l'iniezione microiontophoretic di gabazine. Le croci nere (A) indicano le frequenze scelti da presentare come suoni rare e ripetitive. (B) accumulato peri-stimolo istogrammi tempo della risposta neurale per tutte le frequenze ed intensità presentati per costruire l'area risposta prima e durante l'iniezione di gabazine. Le barre nere indicano la durata del suono.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Effetto del blocco del GABA A recettori presenti sulla risposta a suoni ripetitivi e rare. (A, B) raster Dot della risposta spiking ad una coppia di frequenze presentati come rara (rosso, 10%) e di stimolo ripetitivo (blu, 90%) prima e durante l'applicazione di gabazine. Ogni frequenza è giocato in due sequenze in modo tale che ciascuno di essi è stato presentato come rare- e ripetitivo. Lo sfondo ombreggiato indica la durata dello stimolo. (C). Risposte di singoli neuroni a sette coppie di frequenze presentati come il raro e come il suono ripetitivo prima e durante l'applicazione di gabazine. (D) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il microiontophoresis di sostanze neuroattivi in animali svegli è una tecnica potente per sondare e sezionare il ruolo degli ingressi sinaptici specifici per l'attività di singoli neuroni 40,41. Ancora più importante, questa procedura permette di determinare l'impatto dei neurotrasmettitori e neuromodulatori su circuiti neurali senza l'interferenza potenziale di anestetici. Qui, dimostriamo che l'applicazione gabazine nel IC di topi svegli robusta cambiato la frequenza di sintonizzazione (Figura 4A), i modelli di risposta temporale (Figura 4B) e la SSA (Figura 5).
La limitazione principale della procedura descritta è il tempo di registrazione relativamente breve (~ 3 ore), che è determinato dal livello di assuefazione dell'animale alle sessioni di registrazione. D'altro canto, più sessioni di registrazione possono essere eseguite sullo stesso animale. Utilizzando microiontophoresis Non è chiaro fino a che puntole sostanze neuroattivi applicate diffondono nel tessuto circostante. Pertanto, un possibile effetto sull'attività di rete neuronale può essere provocato da incidere non solo sulla neurone registrato ma anche la gliali circostante e cellule neuronali. Ad esempio, Candy e colleghi 42 hanno dimostrato che alcune molecole iontophoretically consegnati, che non sono rapidamente rimosse, possono diffondersi fino a 600 micron. Nei topi IC questa gamma coprirebbe la maggior parte della portata dei mandrini dendritiche non influenzare anche la risposta neuronale delle cellule adiacenti. Non In sintesi, il farmaco rilasciato da ionoforesi è spazialmente limitato la dialisi farmaco intracellulare, che consente la dissezione in dettaglio più fine degli ingressi sinaptici al neurone bersaglio e di prova di rete locale processi 16,43, è più specifico di altri sperimentale procedure utilizzate per manipolare il livello di neurotrasmissione o neuromodulazione, come iniezioni sistemiche, l'uso di tecniche optogenetic, o push-pull dialisi.
Il diametro della punta delle pipette di vetro e l'ampiezza delle correnti di ritenzione e di iniezione sono fattori fondamentali per monitorare in modo da evitare perdite di farmaco non specifico nel tessuto. Le basse correnti di iniezione (dell'ordine delle decine di nA) limitano la diffusione del farmaco permettono la registrazione dei neuroni vicini l'uno all'altro. Ad esempio, tre dei quattro neuroni utilizzati come esempi (neuroni 1 - 3) sono stati registrati sulla stessa pista con distanze di 16 e 800 micron tra loro. Nonostante la breve distanza di 16 micron tra il neurone 1 e 2, una risposta nettamente diverso neurone 2 è stato osservato (Figura 4).
Alcune alternative alla configurazione piggy-back proposto sono stati utilizzati in precedenza. Uno di questi consiste nell'utilizzo di una delle pipette multibarrel per la registrazione, invece di un elettrodo separato. Mentre la costruzione degli insiemi è meno complicato in questo caso, ci sono svantaggi. First, tutti i canali avrà lo stesso diametro di apertura sulla punta, che può non essere ottimale per la registrazione e la somministrazione di farmaci. Inoltre, la punta dell'elettrodo sporgente nella configurazione piggy-back previene i danni alla cellula bersaglio probabilmente causato dalla punta più larga del multibarrel. La seconda alternativa comune è l'uso di pipette di vetro singolo barile per registrare 15,44 invece di elettrodi di tungsteno. Elettrodi di vetro sono facili da produrre le dimensioni richieste, ma tendono ad intasarsi durante lunghe registrazioni o quando si viaggia in profondità nel cervello, in modo nei nostri elettrodi esperienza tungsteno forniscono registrazioni più affidabili. Inoltre, utilizzando elettrodi di tungsteno è possibile produrre lesioni elettrolitica per localizzare i siti di registrazione, senza le procedure istologiche ulteriormente elaborati richiesti durante un'iniezione tracciante neuronale viene utilizzato 45. L'uso di pipette di vetro multibarrel permette il rilascio di molteplici agonisti e / o antagonisti molto vicino alla registrazionesito, che è un enorme vantaggio quando l'interazione tra sistemi neurotrasmettitoriali sull'elaborazione sensoriale è in fase di studio.
Le procedure descritte nel presente protocollo per la fabbricazione degli elettrodi piggy-back rendono possibile la produzione di elettrodi di registrazione secondo i requisiti specifici dell'esperimento e delle caratteristiche dell'area bersaglio di interesse in modo sistematico, eppure modo personalizzato. Inoltre, i materiali per la fissazione headpost sono convenzionalmente utilizzati in odontoiatria modo che siano facilmente disponibili. Così, i passaggi critici nel protocollo sono l'assuefazione animale e l'attacco degli elettrodi di tungsteno, che sono i principali fattori che contribuiscono ai neuroni ben isolate e registrazioni elettrofisiologiche stabili. In generale, questa tecnica è relativamente semplice, economica ed estremamente affidabile come mezzo per studiare il ruolo di molteplici sostanze neuroattivi sull'attività neuronale singola o più unità in sveglio, testa-topi trattenuto.
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Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato dalla MINECO concede BFU201343608-P e PSI2013-49348-EXP, e la concessione SA343U14 JCYL al finanziamento di base MSM e MRC di ARP. YAA tenuto una CONACYT (216106) e una borsa di studio settembre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
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