Abstract
Les différences dans l'activité des neurotransmetteurs et neuromodulateurs, et par conséquent différentes réponses neuronales, peut être trouvée entre les animaux anesthésiés et éveillés. Par conséquent, des méthodes permettant la manipulation des systèmes synaptiques chez les animaux éveillés sont nécessaires afin de déterminer la contribution des entrées synaptiques pour le traitement neuronal affecté par les anesthésiques. Ici, nous présentons une méthodologie pour la construction d'électrodes pour enregistrer simultanément l'activité neuronale extracellulaire et libèrent des substances neuroactives multiples au voisinage des sites d'enregistrement des souris éveillées. En combinant ces méthodes, nous avons effectué des injections de microiontophoretic gabazine pour bloquer sélectivement les récepteurs GABA A dans les neurones de colliculus inférieur des souris frontales retenue. Gabazine modifié avec succès des propriétés de réponse neuronaux tels que la zone de réponse en fréquence et adaptation spécifique stimulus. Ainsi, nous démontrons que nos méthodes sont appropriées pour recording activité d'une seule unité, et pour disséquer le rôle des récepteurs spécifiques de neurotransmetteurs dans le traitement auditif.
La principale limitation de la procédure décrite est le temps d'enregistrement relativement courte (~ 3 h), ce qui est déterminé par le niveau d'accoutumance de l'animal à des sessions d'enregistrement. D'autre part, plusieurs sessions d'enregistrement peuvent être réalisées dans le même animal. L'avantage de cette technique par rapport à d'autres procédures expérimentales utilisées pour manipuler le niveau de neurotransmission ou neuromodulation (par exemple sous forme d'injections systémiques ou l'utilisation de modèles optogénétiques), est que l'effet du médicament est confinée aux entrées synaptiques locales au neurone cible. En outre, l'usage, la fabrication d'électrodes permet un réglage de paramètres spécifiques en fonction de la structure neuronale et le type de neurone d'intérêt (telles que la résistance de pointe pour améliorer le rapport signal sur bruit des enregistrements).
Introduction
L'interaction de l' excitation neuronale et l' inhibition est fondamentale pour le traitement de l' information sensorielle 1. Il est également connu que l' anesthésie a un fort impact sur la dynamique de l' activation corticale et la structure temporelle des entrées synaptiques 2,3. Par exemple, il a été observé que les anesthésiques modifient la durée des réponses visuelles évoquées dans les neurones corticaux 3,4. En outre, le rapport entre excitateurs et entrées synaptiques inhibitrices est différent chez les animaux anesthésiés et éveillés 4,5, modifiant à la fois évoqués et les taux d'activité spontanée 6,7. En mesurant les conductances synaptiques, Haider et ses collègues 4 ont trouvé que l' inhibition appariés excitation en amplitude sous anesthésie alors que pendant l' éveil, l' inhibition était plus forte que l' excitation. Ces résultats incitent le développement de procédures expérimentales pour étudier l'impact des entrées synaptiques spécifiques sur le traitement sensoriel chez les animaux éveillés.
<p class = "jove_content"> L'éjection contrôlée de substances neuroactifs chargées en appliquant de petites injections de courant (de l'ordre de nA) a été largement utilisée pour étudier la contribution des entrées synaptiques et le rôle des récepteurs cellulaires putatifs dans le traitement sensoriel 8-13 . Cette technique, connue sous le nom microiontophorèse, permet l'application de médicaments dans le voisinage du neurone enregistré, ce qui contribue à un effet rapide et confiné. Cette procédure est plus approprié pour étudier les effets locaux des substances neuroactives, par rapport à l'effet généralisée provoquée par d'autres manipulations expérimentales telles que les injections systémiques, microdialyse ou l'utilisation de techniques optogénétiques. Habituellement, une configuration d'électrode ferroutage 14,15 est utilisé pour enregistrer simultanément le neurone cible et de livrer les substances neuroactifs d'intérêt. Il se compose d'une électrode d'enregistrement fixé à une pipette de multibarrel qui transporte les substances neuroactives. Modifications de l'oprocédure riginal décrite par Havey et Caspary 14 ont été mis en œuvre. Par exemple, une électrode en tungstène, au lieu d'un verre, peut être utilisé pour enregistrer l'activité neuronale 16. Méthodes publiées précédemment pour la fabrication d'électrodes de tungstène 17,18 comportent trois étapes générales: gravure électrolytique de pointes de fil de tungstène, l' isolation en verre, et l' ajustement de l'exposition de pointe pour répondre aux exigences d'enregistrement.Un champ intéressant et émergente en neurosciences auditive est l'étude de l' adaptation spécifique à stimulus (SSA 19). SSA est une diminution spécifique de la réponse neurale aux sons répétitifs qui ne généralisent pas à d'autres sons rarement présentés. L'importance de l' ASS réside dans son rôle potentiel comme un mécanisme neuronal de détection de déviation sous - jacente dans le cerveau auditif, ainsi que d' une éventuelle corrélation neuronale pour la composante non - concordance de la négativité tardive du potentiel évoqué auditif 20,21. SSA occurs de l'IC jusqu'au cortex auditif 19,22-24. GABA A l' inhibition médiée a été démontrée à agir en tant que mécanisme de contrôle de gain sur SSA 7,16,25, qui a également été montré pour être affectés par l' anesthésie 26. Ici , nous présentons un protocole qui combine les méthodes décrites précédemment pour l' enregistrement de l'activité d'une seule unité de neurones de circuits intégrés avant et pendant l'application d'un antagoniste sélectif des récepteurs ai GABA A chez des souris éveillées. Tout d'abord, nous décrivons la fabrication d'électrodes ferroutage et à côté, les méthodes chirurgicales et d'enregistrement. Pour tester l'efficacité de libération du médicament, nous avons comparé le champ récepteur ainsi que le niveau de SSA des neurones IC avant et pendant l'éjection de microiontophoretic gabazine.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées à l'Université de Salamanque avec l'approbation, et en utilisant des méthodes conformes aux normes de l'Université de Animal Care Committee Salamanca, ainsi que les normes de l'Union européenne (directive 2010/63 / UE) l'utilisation des animaux dans la recherche en neurosciences.
1. Tungsten Electrodes
Remarque: La fabrication des électrodes en tungstène est basé sur la technique originale décrite dans Merrill et Ainsworth et 27 Ainsworth et al 28 , et réalisée à l' aide de la configuration du poste de travail décrit dans Bullock et al 17...
- Pour enregistrer une seule unité l'activité extracellulaire de neurones IC, utiliser des électrodes avec une impédance de 1,5 pointe - 2,5 MQ. Ici, les étapes impliquées dans la fabrication des électrodes de tungstène sont décrits brièvement, car une description détaillée se trouve dans les références mentionnées ci-dessus.
- Placez des fils de tungstène dans un alignement sur mesureoutil (figure 1A) pour aider les couper à la longueur désirée. L'outil d'alignement se compose de 30 aiguilles (25 G) collées en parallèle à 2 mm intervalles, avec un arrêt à une extrémité pour limiter la longueur des fils à ~ 40 mm. Fixez soigneusement les extrémités libres des fils avec du ruban adhésif, et couper le reste du fil avec des ciseaux forts.
- Tirez doucement sur la bande afin d'éliminer les fils de tungstène à partir de l'outil d'alignement, en veillant à ce que tous les fils restent attachés à la bande. Rouler la bande sur une broche en laiton poli (figure 1B, C), tenant les fils fermement contre la broche donc il y a une bonne connexion électrique.
- Connectez la broche à un moteur de 5 tours dans le poste de travail, et plongez les pointes de fil en saillie dans une solution de gravure (KNO 2, 90 g par 80 ml). Angle de l'axe de broche 45 ° par rapport à la surface de la solution de gravure. Immerger les pointes des fils de telle sorte que ~ 1/3 des fils contacter la solution.
- ImmErse une électrode à tige de carbone dans le bain d'attaque chimique pour fermer le circuit. Utilisez un ressort tresse de cuivre pinceau pour appliquer l'alimentation de gravure à l'arbre de broche tandis que la broche tourne. Régler le courant qui est passé à travers les électrodes et la solution d'attaque chimique à 250 mA. Arrêtez la pointe de gravure lorsque le courant tombe à 200 mA. Les pointes des fils seront gravés dans des points très fins.
- Passer un fil aiguisé à travers une flamme pour enlever tout résidu de graisse et de l'adhésif. Placer le fil (extrémité franche en premier) dans un capillaire en verre au borosilicate (1,5 mm de diamètre extérieur, 0,86 mm DI) avec son extrémité inférieure bloquée par la pâte à modeler. Fixer la pipette verticalement en haut et en bas. Tirez la pipette en utilisant un serpentin de chauffage (diamètre de 5 mm, profondeur de 5 mm) et un piston suspendu. Comme le fil est tiré vers le bas par le poids du piston, le verre fondu forme une couche très fine autour d'elle.
- Retirez le verre recouvrant la pointe à l'extrémité pointue de l'électrode à l'aide d'un cordon fondu de sodiumtétraborate. Pour former le bourrelet, mélanger le tétraborate de sodium (~ 0,25 g) avec une petite quantité d'eau (~ 0,5 ml) lentement et le placer sur un élément chauffant, jusqu'à ce qu'il fonde dans un bourrelet ~ 2 mm de diamètre. La température de l'élément chauffant est contrôlé par un potentiomètre. Placez le talon et l'élément chauffant sur un bras manipulateur fixé à la table, et le déplacer jusqu'à ce que le bourrelet est concentré sous le microscope à faible grossissement.
- Fixez le fil de verre recouvert d'une lame et le placer sous le microscope. Déplacez le curseur avec les boutons de la scène jusqu'à ce que la pointe et le tétraborate perles sont en discussion. Chauffer le cordon jusqu'à ce qu'il fonde légèrement, et insérez la pointe du fil ~ 10 - 15 um. Tourner le potentiomètre de chauffage hors tension. Comme le bourrelet se refroidit, il se contracte et enlever le verre de la pointe de l'électrode, exposant le tungstène sous-jacente. L'électrode de tungstène est prêt à l'emploi.
Fabrication 2. Multibarrel verre Pipette
- Protéger les extrémités des multiplescapillaires en verre de canon (cinq barils en H-configuration) avec gaine thermo-rétractable, afin de permettre une meilleure adhérence aux pinces de traction et de prévenir la rupture, et placez un dans l'extracteur vertical.
- Pour obtenir des longueurs de ~ 15 mm de pointe, réglez l'extracteur sur les paramètres suivants: Heat: 84, force magnétique Sub: 49, force magnétique principal: 38. Peaufinez ces paramètres en fonction de la configuration particulière, ainsi que après avoir changé la élément chauffant.
- Tirez le capillaire pour obtenir deux pipettes avec les conseils occlus. Monter une pipette sur une lame en utilisant la pâte à modeler et de briser la pointe de la pipette sous le microscope jusqu'à ce que le diamètre extérieur est de ~ 20 - 30 um, en utilisant des ciseaux ou des pinces fines, ou le côté plat d'un scalpel. Si le bord cassé est trop rugueux, l'affiner en utilisant la technique du tétraborate de perles décrit dans l'étape 1.7.
- Placer une électrode en tungstène (de section 1), dans un support réalisé avec une aiguille de 20 G à l'extrémité d'un axe 3 Micropositionneur miniature monté sur le cerf de microscopee. En utilisant des pinces, pliez la fin de l'électrode 5 à - 10 °, ~ 30 mm de la pointe.
- Sous le microscope, aligner soigneusement l'électrode en tungstène sur la pointe de multibarrel. Une fois aligné, abaisser l'électrode jusqu'à ce qu'il contacte le multibarrel, montage dans la rainure entre les deux barils supérieurs. Faites glisser la pointe de l'électrode jusqu'à ce qu'il dépasse ~ 15-20 um loin de la pointe de l'multibarrel. Rendre l'angle entre l'électrode et la multibarrel aussi faible que possible pour obtenir une meilleure adhérence et un ensemble plus mince.
- Appliquer une petite goutte de lumière curable adhésif ~ 5 mm des conseils. Faites attention la colle ne parvient pas à la pointe pour éviter de bloquer les canaux de multibarrel.
- Cure de la colle à l'aide d'une lampe LED lumière bleue. Répétez la colle application / durcissement si nécessaire, pour une meilleure adhérence.
- Déplacer la platine du microscope doucement jusqu'à ce que l'extrémité de l'électrode en tungstène est libéré de son support. Retirez le ferroutage ensemble de la diapositive.
- Enveloppez ee section centrale de l'électrode piggy-back dans une courte longueur de thermorétractable tube et appliquer rapidement le durcissement époxy approprié pour le verre pour sécuriser davantage l'électrode en tungstène à l'multibarrel.
3. Médicaments pour microiontophorèse
Remarque: Les médicaments utilisés pour microiontophorèse doivent avoir une charge électrique lorsqu'il est dissous dans l'eau. Vérifiez la littérature pour voir si le médicament d'intérêt est approprié pour cette procédure. Ici, la procédure de gabazine, un antagoniste du récepteur GABA A, est décrit.
- Filtrer l'eau distillée en utilisant un filtre à seringue de 0,2 um pour stériliser l'eau et ne contenant pas d'obtenir des solutés. Préparer ~ 1000 ul de 20 mM gabazine utilisant cette eau distillée.
- Ajuster le pH de la dilution à 4 avec 0,2 um filtrée NaOH en utilisant une électrode de pH à pointe fine.
- Stockez 100 - 200 aliquotes à -20 ºC. Décongeler le jour de l'enregistrement. Ce jour-là, avant que l'animal est retenired, remplir les fûts (3 - 5 ul) de l'électrode de multibarrel avec les médicaments, à l'aide d'une microseringue de 100 pi munie d'une aiguille en matière plastique souple.
4. Chirurgie et Headpost Implantation
- Effectuer des expériences dans deux souris mâles CBA / J (Mus musculus) avec des poids de 27 et 30 g. Suivez les procédures chirurgicales et d' enregistrement de Bryant et ses collègues 29, Portfors et collaborateurs 30-32, et Duque et Malmierca 26.
- Dans les jours avant la chirurgie, la manipulation des animaux et les accoutumer à la chambre d'enregistrement en leur permettant d'explorer librement. Effectuer 3 séances par jour, chacune durant au moins 30 min. De cette façon, les animaux sera plus calme et confortable pendant les enregistrements.
- Anesthésier la souris en utilisant un mélange de kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) injecté par voie intramusculaire. Avec cette dose l'animal est profondément anesthésié pendant environ 1 h. Donner des doses supplémentaires d'un third de la dose initiale si nécessaire.
- Placez l'animal sur une couverture de chauffage réglé pour maintenir une température de 38 ± 1 ° C et de stabiliser la tête de l'animal dans un cadre stéréotaxique en utilisant deux barres d'oreilles et une barre de morsure. Veillez à ne pas percer la membrane tympanique avec les barres d'oreilles.
- Protéger les yeux en appliquant une goutte de gel ophtalmique.
- Rasez le cuir chevelu à l'aide de ciseaux et d'appliquer povidone-iode pour désinfecter la peau.
- L'utilisation d'un scalpel, faire une incision le long de la ligne médiane pour exposer le crâne et se rétracter le périoste couvrant le pariétal et la partie la plus rostrale des os occipital.
- Collez un headpost léger duralumin (poids ~ 0,65 g, longueur 30 mm, la figure 2A) avec une ronde et une base plate (5 mm de diamètre) sur le crâne. Collez un fil d'argent au milieu de la headpost laissant ses extrémités libres. Le fil d'argent sera utilisée comme l'électrode de référence pour l'enregistrement électrophysiologique.
- Appliquer une fine couche de light adhésif durcissable sur le crâne et la base du headpost. Attendre 10 secondes et placez le headpost sur la zone rostrale des os pariétaux, le long de la ligne médiane.
- Pour une force d'adhérence efficace, photopolymériser l'adhésif en utilisant une source de lumière bleue pendant 20 s.
- Percer trois trous autour et derrière la base du headpost en utilisant une perceuse électrique et un petit foret.
- Placez deux vis de la montre (~ 2 mm de longueur) dans les trous percés pour servir de points de contact supplémentaires entre le crâne et le headstage. Les vis nécessitent 1½ tours pour obtenir un ajustement serré. Testez les vis avec une pince pour vous assurer qu'ils ne sont pas desserrés.
- Insérez l'extrémité du fil de terre d'argent dans le troisième trou en vous assurant qu'il contacte la dure-mère. Appliquer une petite goutte d'eau cyanoacrylate résistant à la colle pour lier le fil au crâne.
- Appliquer composite photopolymérisable pour renforcer la liaison du headpost avec le crâne. Couvrir la base du headpost, la partie basse du fil d'argent,et les vis, en faisant attention de ne pas étendre derrière lambda, pour permettre l'accès pendant l'enregistrement. Cure en utilisant une source de lumière bleue.
- Rentrez le muscle à l'arrière du cou près de son insertion sur le crâne. En utilisant un petit trépan (2,35 mm de diamètre), percer une fenêtre ronde juste en dessous de lambda suture et latérale de la ligne médiane, pour exposer le colliculus inférieur (IC). Quand les frontières sont lâches, tirer vers le haut de l'os de couverture avec des pincettes fines. Si le saignement se produit, rincer avec une solution saline stérile à froid pour l'arrêter.
- Faire un petit (~ 1 mm de large et 1 mm de hauteur ~) mur autour de la fenêtre avec composite et lumière guérir.
- Couvrir le crâne exposé et musculaire avec une pommade antibiotique. Ensuite, mouiller la surface exposée de la CI avec une solution saline stérile et recouvrir avec de la gelée de pétrole, le remplissage du puits généré après avoir fait le mur autour de la fenêtre d'enregistrement.
- Injecter par voie sous- cutanée buprénorphine (0,03 mg / kg, après dilution 1:10 dans une solution saline stérile) comme analgésique.
- Gardez l'animal sur til chauffer une couverture jusqu'à ce qu'il se réveille et le retourner à sa cage de logement pour récupérer de la chirurgie pendant trois jours avant les sessions d'enregistrement. animaux maison individuel cage de logement rat's pour empêcher compagnons de cage nettoyer la gelée et la headpost touchent le couvercle métallique-grille. Mettre un peu d'enrichissement dans la cage lorsque l'animal est unique logé. Aussi, changer tous les jours de la sciure de bois pour prévenir l'infection et soigneusement vérifier que l'animal récupère correctement et ne montre aucun signe d'inconfort. Vérifiez également si la gelée de pétrole est sur la fenêtre d'enregistrement protégeant le cerveau exposé.
5. électrophysiologique Enregistrement et microiontophorèse
- Après la récupération, donner le temps de l'animal à acclimater à l'environnement d'enregistrement et ayant son siège retenu. Acclimate l'animal en fixant le headpost au support alors que la souris est assis sur un coussin en mousse restrainer-mesure sculpté à sa taille corporelle (figure 2B). Cette volonté limelle les mouvements de la souris et contribuera à son calme.
- Commencez avec 10 sessions min et augmenter progressivement la durée jusqu'à 120 min. Au cours de la session, récompenser les animaux avec des liquides sucrés (lait concentré, dilué dans de l' eau 30:70) à des intervalles donnés 33. Plus tard, au cours de la session d'enregistrement, donner la même récompense au début et à la fin de la session ou alors qu'aucun neurone est isolé.
- Si l'animal est très excité avant l'enregistrement, injecter le acépromazine doux sédatif (2 mg / kg, intrapéritonéale). Selon le système neuronal d'intérêt, le sédatif peut affecter vos résultats.
- Laissez l'animal explorer librement la chambre d'enregistrement pendant 5 - 10 min.
- Placez le corps de l'animal dans le restrainer rembourrée de mousse sur mesure (figure 2B).
- Fixer le headpost à un support fixé au cadre stéréotaxique (figure 2C). Ceci est un bon moment pour donner à l'animal une récompense liquide.
- Cover le corps de l'animal avec une couverture de coton et vaguement le fixer à l'aide d'un demi-cylindre en plastique et du ruban adhésif.
- Retirez la gelée de pétrole à partir de la fenêtre d'enregistrement et rincer à l'eau chaude salée stérile.
- activité neuronale enregistrement et l'application iontophorétique de gabazine.
- Placer l'électrode de multibarrel sur son support, commandée par un micromoteur et attaché à un micromanipulateur.
- Connecter les fils pour l'enregistrement, en utilisant de petites pinces crocodile. Connecter la borne positive à l'extrémité de l'électrode en tungstène et la borne de masse sur le fil d'argent en contact avec la dure-mère.
- Placer un fil d'argent non revêtue à l'intérieur de chaque cylindre, de sorte que l'un des contacts d'extrémité de la solution et l'autre extrémité est accessible. Branchez les extrémités du dispositif de microiontophorèse, en suivant les instructions du fabricant.
- Déplacer l'électrode de multibarrel jusqu'à ce que les contacts de pointe, la surface du cerveau. Appliquer une solution saline stérile chaude pour éviter le dessèchement des ee tissu cérébral. À ce moment appliquer un courant de rétention (-10 nA pour gabazine, consultez la documentation pour le médicament en particulier) pour éviter les fuites de la drogue à partir de la pointe du cylindre tout en recherchant une activité unitaire.
- Utiliser des techniques standard pour isoler seul neurone activité extracellulaire. Obtenir la zone de réponse en fréquence (FRA) du neurone, soit la combinaison de fréquences et d' intensités capables d'évoquer une réponse , car le neurone est sensible à ces sons 34-36.
- Choisissez deux fréquences (f1 et f2) qui évoquent une cadence de tir similaire et le motif. Présenter chacune de ces fréquences stimulus rare et répétitif sous le paradigme oddball.
Note: En bref, dans le paradigme oddball, une fréquence (f1) est présenté comme le stimulus répétitif avec une probabilité d'occurrence élevée, tandis que la seconde (f2) est le stimulus déviant se produisent rarement, entrecoupés au hasard parmi ceux répétitifs. Dans une deuxième séquence excentrique, le rapportprobabilités des deux stimuli sont inversés. Détails du paradigme de stimulation ont été décrites précédemment 22,37. - Relâchez le gabazine en déplaçant le courant à des valeurs positives (10 - 20 nA). Obtenir à nouveau la FRA et répéter le paradigme oddball sous l'application de gabazine. Maintenir l'éjection jusqu'à ce qu'un effet visible dans la cadence de tir est observé; il faut généralement 5 à 20 minutes, en fonction du médicament particulier, de sa concentration et l'intensité du courant d'éjection. Répéter le protocole d'enregistrement pour obtenir les valeurs sous l'effet du médicament.
- Arrêtez l'injection en retournant le courant à des valeurs de rétention. Attendez que l'effet de la drogue pour se laver en surveillant que la FRA ou de la réponse au paradigme oddball retourne aux valeurs témoins.
Remarque: Les sessions d'enregistrement peuvent durer 2 - 3 heures par jour, et devrait être terminée plus tôt si l'animal présente des signes d'inconfort ou de difficulté. Donnez liquide de récompense et de couvrir le ch d'enregistrementambre avec de la vaseline.
Analyse 6. Données
- Mesurer la FRA avant et pendant l'injection de gabazine ainsi que le niveau de l'Afrique subsaharienne.
- Quantifier la force de la réponse SSA par l'indice commun SSA (CSI) et l'indice SSA fréquence spécifique (SI) comme décrit précédemment 19,22,23,38,39. L'ICS et SI correspondent à la différence normalisée entre la réponse neuronale au stimulus rare et la réponse à l'une répétitive. Les valeurs CSI et SI positives indiquent la réponse neurale (pointes par stimulus) était plus élevé à rare que de tons répétitifs.
- Comparer les données de l'état de la commande et de la drogue éjection.
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Representative Results
Nous avons enregistré l'activité d'une seule unité de 4 neurones bien isolées de l'IC. Le rapport signal à bruit typiques obtenues lors des enregistrements extracellulaires chez les souris éveillés sont représentés sur la figure 3B. La figure 4A montre la zone de réponse en fréquence (FRA) de chaque neurone avant et pendant le blocage du récepteur GABA A gabazine avec les récepteurs. Un incrément dans la force de réaction (pics / de stimulation), ainsi qu'un élargissement de la mise au point du spectre a été observée. L'augmentation de la réponse évoquée était également évidente dans les histogrammes de temps péri-stimulus accumulées obtenues à partir de la réponse neuronale à toutes les fréquences et les intensités présentés (figure 4B).
Une ou deux paires de fréquences dans la FRA du neurone (croix dans la figure 4A) ont été choisis pour être présentés comme des sons répétitifs ou rares dans un paradigme oddball, à sTudy le niveau de l'Afrique subsaharienne dans leurs réponses. Pour deux neurones exemple, les réponses sonores évoqués à chaque fréquence (f1 et f2) avant et pendant l'injection de gabazine sont présentés comme rasters de points dans la figure 5A, B. Pour les deux neurones par exemple, il y avait un changement clair dans la réponse sonore évoquée comme observé dans la trame de points et PSTHs.
De même, le blocus locale des GABA A a augmenté les récepteurs de la réponse neuronale à la grande majorité des tons rares et répétitifs (Figure 5C) en accord avec notre étude précédente 16. Différents niveaux de SSA ont été observées dans les réponses neuronales à f1 et f2, qui est reflété en positif CSI (intervalle CSI: -0,26 à 0,43, 0,25 ± 0,23) et les valeurs SI (intervalle SIs: -0,41 à 0,83, 0,25 ± 0,23) . Pour la plupart des cas, l'augmentation de la réponse à la tonalité répétitive a provoqué une chute de ces indices comme observé sur la figure 5D
Figure 1. Matériel pour la fabrication de tungstène Électrodes. Outil d'alignement (A) des électrodes, avec des fils de tungstène en place. Le morceau plus léger sur la gauche est un arrêt pour les fils. La pointe de ciseaux indique le côté utilisé comme un guide pour couper les fils à la longueur désirée. (B) broche vide. (C) de la broche avec un lot d'électrodes attachées, et reposant sur un support. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Accessoires pour enregistrements Souris Awake. (A) Headpost. (B) Sur mesure rembourrée restrainer en mousse. Lieu til la souris entre les deux pièces, en laissant la tête à l' extérieur. (C) Les modifications apportées au cadre stéréotaxique. Le porte-headpost (barre du haut) aide pendant headpost implantation et retient la tête pendant les enregistrements. La pièce de morsure (barre inférieure) est utilisée uniquement lors de l'implantation de headpost. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Exemple d'enregistrement dans la souris Awake. (A) de la zone d'un neurone de la IC souris Réponse en fréquence. (B) Waveforms des pointes enregistrées à partir de ce neurone. (C, D) Dot raster et histogramme peristumulus-temps enregistré à partir de ce neurone en utilisant un paradigme oddball aux fréquences indiqué par les points (A). Redessiné à partir de donnéespublié dans Duque et Malmierca 26. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Effet de la Blocus du GABA A sur les récepteurs de la spectrale et temporelle des propriétés de réponse. (A) Fréquence zone des quatre circuits intégrés de réponse enregistré neurones avant et pendant l'injection de microiontophoretic gabazine. Les croix noires (A) indiquent les fréquences choisies pour être présentées comme des sons rares et répétitives. (B) Cumul péri-stimulus histogrammes de temps de la réponse neuronale à toutes les fréquences et intensités présentées pour construire la zone de réponse avant et pendant l'injection de gabazine. Les barres noires indiquent la durée du son.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Effet de la Blocus de GABA A des récepteurs sur la réponse aux sons répétitifs et rares. (A, B) des trames de point de la réponse de dopage à une paire de fréquences présentées comme rares (rouge, 10%) et le stimulus répétitif (bleu, 90%) avant et pendant l'application de gabazine. Chaque fréquence est joué dans deux séquences telles que chacun a été présenté comme rare- et répétitif. Le fond grisé indique la durée du stimulus. (C). Réponses unique neurone à sept paires de fréquences présentées comme rares et que le son répétitif avant et pendant l'application de gabazine (D) . S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La microiontophorèse des substances neuroactifs chez les animaux éveillés est une technique puissante pour sonder et de disséquer le rôle des entrées synaptiques spécifiques sur l'activité des neurones isolés 40,41. Plus important encore, cette procédure permet de déterminer l'impact des neurotransmetteurs et neuromodulateurs sur les circuits neuronaux sans l'interférence potentielle des anesthésiques. Ici, nous démontrons que l'application de gabazine dans le IC de souris éveillée robuste changé le réglage de fréquence (figure 4A), les profils de réponse temporelle (figure 4B) et l'Afrique subsaharienne (Figure 5).
La principale limitation de la procédure décrite est le temps d'enregistrement relativement courte (~ 3 h), ce qui est déterminé par le niveau d'accoutumance de l'animal à des sessions d'enregistrement. D'autre part, plusieurs sessions d'enregistrement peuvent être exécutés sur le même animal. Utilisation de microiontophorèse On ne sait pas dans quelle mesureles substances neuro-actives appliquées diffusent dans le tissu environnant. Par conséquent, un effet possible sur l'activité du réseau de neurones peut être obtenue en affectant non seulement le neurone enregistré mais aussi les cellules gliales environnantes et des cellules neuronales. Par exemple, Candy et ses collègues 42 ont montré que certaines molécules iontophorèse livrées, qui ne sont pas éliminés rapidement, peuvent diffuser jusqu'à 600 um. Chez les souris IC cette gamme couvrirait la majeure partie de l'étendue des tonnelles dendritiques, mais affectent également la réponse neuronale des cellules adjacentes. En résumé, le médicament libéré par iontophorèse est pas spatialement restreinte comme intracellulaire dialyse de la drogue, ce qui permet la dissection en détail plus fine des entrées synaptiques au neurone cible et le test de réseau local traite 16,43, il est plus précis que d' autres expérimentale les procédures utilisées pour manipuler le niveau de neurotransmission ou neuromodulation, telles que les injections systémiques, l'utilisation de techniques optogénétiques ou push-pull dialyse.
Le diamètre de la pointe des pipettes de verre et de l'ampleur des courants de rétention et d'injection sont des facteurs clés pour la surveillance afin d'éviter les fuites de médicaments non spécifiques dans le tissu. Les faibles courants d'injection (de l'ordre de dizaines de nA) limitent la propagation du médicament permettant l'enregistrement des neurones proches les uns des autres. Par exemple, trois des quatre neurones utilisés comme exemples (neurones 1 - 3) ont été enregistrées le long de la même piste avec des distances de 16 à 800 um entre eux. En dépit de la faible distance de 16 pm entre les neurones 1 et 2, une réponse nettement différent du neurone 2 a été observée (figure 4).
Certaines solutions de rechange à la configuration ferroutage proposée ont été utilisés précédemment. L'une d'elles consiste en l'utilisation d'un des pipettes multibarrel pour l'enregistrement, au lieu d'une électrode séparée. Alors que la construction des ensembles est moins compliqué dans ce cas, il y a des inconvénients. First, tous les canaux auront le même diamètre d'ouverture à la pointe, ce qui peut ne pas être optimale pour l'enregistrement et la délivrance de médicaments. En outre, la pointe de l'électrode en saillie dans la configuration ferroutage évite d'endommager la cellule cible probablement causée par la pointe plus large de la multibarrel. La seconde alternative commune est l'utilisation de pipettes en verre à canon unique pour l' enregistrement 15,44 au lieu d'électrodes en tungstène. électrodes de verre sont faciles à fabriquer aux dimensions requises, mais ont tendance à obstruer pendant les longs enregistrements ou lorsque vous voyagez en profondeur dans le cerveau, dans nos électrodes expérience de tungstène fournissent des enregistrements plus fiables. En outre, en utilisant des électrodes en tungstène , il est possible de produire une lésion électrolytique pour localiser les sites d'enregistrement, sans que des procédures élaborées en outre histologiques requises lors d' une injection de traceur de neurones est utilisé 45. L'utilisation de pipettes de verre multibarrel permet la libération de plusieurs agonistes et / ou antagonistes très proches de l'enregistrementsite, ce qui constitue un avantage considérable lors de l'interaction entre les systèmes de neurotransmetteurs dans le traitement sensoriel est à l'étude.
Les procédures décrites dans le présent protocole pour la fabrication des électrodes ferroutage permettent de produire des électrodes d'enregistrement en fonction des besoins spécifiques de l'expérience et des caractéristiques de la zone cible d'intérêt d'une manière systématique, mais de manière personnalisée. En outre, les matériaux pour la fixation du headpost sont classiquement utilisés en dentisterie afin qu'ils soient facilement disponibles. Ainsi, les étapes critiques dans le protocole sont les habituation des animaux et la gravure des électrodes en tungstène, qui sont les principaux facteurs qui contribuent à des neurones bien isolées et des enregistrements électrophysiologiques stables. Dans l'ensemble, cette technique est relativement simple, économique et très fiable comme un moyen d'étudier le rôle de plusieurs substances neuroactifs sur l'activité neuronale unique ou multi-unité éveillé, BANDEAUXsouris sobres.
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Acknowledgments
Ce projet a été financé par le MINECO accorde BFU201343608-P et PSI2013-49348-EXP, et la subvention SA343U14 JCYL au financement MSM et MRC noyau pour ARP. YAA a tenu une CONACyT (216106) et une bourse septembre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
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