Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Summary

Apresentamos métodos para a construção de eletrodos para registrar simultaneamente a atividade neural extracelular e liberar múltiplas substâncias neuroativas nas proximidades dos locais de registro em camundongos acordados. Esta técnica permite a análise detalhada de entradas sinápticas locais putativas para o neurônio de interesse.

Abstract

Diferenças na atividade de neurotransmissores e neuromoduladores e, consequentemente, diferentes respostas neurais, podem ser encontrados entre os animais anestesiados e acordado. Assim, os métodos que permitem a manipulação de sistemas sinápticas em animais acordados são necessários a fim de determinar a contribuição de entradas sinápticas neuronais de processamento afectada pelos anestésicos. Aqui, nós apresentamos metodologia para a construção de eléctrodos para gravar, simultaneamente, actividade neuronal extracelular e libertar várias substâncias neuroactivos na vizinhança dos locais de gravação em ratos despertos. Ao combinar estes procedimentos, foram realizadas injeções microiontophoretic de gabazine para bloquear seletivamente receptores GABA _A em neurônios do colículo inferior de ratos conteve-cabeça. Gabazine modificado com sucesso as propriedades da resposta neural, tais como a área de resposta a frequência e adaptação específica do estímulo. Assim, demonstra-se que os nossos métodos são adequados para recording atividade de unidade única e para dissecar o papel dos receptores de neurotransmissores específicos no processamento auditivo.

A principal limitação do processo descrito é o tempo de gravação relativamente curto (~ 3 h), o qual é determinado pelo nível de habituação do animal para as sessões de gravação. Por outro lado, várias sessões de gravação pode ser realizada no mesmo animal. A vantagem desta técnica em relação a outros procedimentos experimentais utilizados para manipular o nível da neurotransmissão ou neuromodulação (tais como injecções sistémicas ou a utilização de modelos optogenetic), é que o efeito do fármaco está confinada às entradas sinápticas locais para o neurónio alvo. Além disso, o costume-fabricação de eléctrodos permite o ajuste dos parâmetros específicos de acordo com a estrutura neural e tipo de neurónio de interesse (tais como a resistência de ponta para melhorar a relação sinal-ruído dos registos).

Introduction

A interacção da excitação neural e inibição é fundamental para o processamento da informação sensorial ^1. Sabe-se também que a anestesia tem um forte impacto sobre a dinâmica de activação cortical e do padrão temporal de entradas sinápticas ^2,3. Por exemplo, tem-se observado que os anestésicos alterar a duração das respostas visuais evocados nos neurónios corticais ^3,4. Além disso, a relação entre as entradas excitatórios e inibidores sinápticas é diferente em animais anestesiados e desperto ^4,5, alterando ambos evocados e as taxas de actividade espontânea ^6,7. Ao medir as condutâncias sinápticas, Haider e colega....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados na Universidade de Salamanca com a aprovação, e usando métodos em conformidade com as normas de uma Universidade do Comitê Animal Care Salamanca, bem como as normas da União Europeia (Directiva 2010/63 / UE) para o uso de animais em pesquisas de neurociência.

1. eléctrodos de tungsténio

Nota: O fabrico de eléctrodos de tungsténio baseia-se na técnica original descrita na Merrill e Ainsworth ²⁷ e Ainsworth et al ²⁸ e realizada usando a configuração de estação de trabalho descrita no Bullock et al, ^17...

1. Para gravar a atividade ex....

Results

Registramos a atividade-única unidade de 4 neurônios bem isoladas do IC. As relações típicas de sinal-para-ruído obtidos durante gravações extracelulares em ratos despertos são mostrados na Figura 3B. A Figura 4A mostra a área da resposta de frequência (FRA) de cada neurónio, antes e durante o bloqueio do _receptor GABA _A receptores com gabazine. Observou-se um aumento na força da resposta (picos / estímulo), bem como um alargamento .......

Discussion

O microiontophoresis de substâncias neuroativos em animais acordados é uma técnica poderosa para sondar e dissecar o papel de entradas sinápticas específicas sobre a atividade de neurônios individuais ^40,41. Mais importante ainda, este procedimento permite a determinação do impacto dos neurotransmissores e neuromoduladores nos circuitos neurais sem o potencial de interferência de anestésicos. Aqui, demonstramos que a aplicação de gabazine no IC de ratos acordados robustamente mudou a sintonia de frequência

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fio de tungstênio	Harvard Apparatus LTD	33-0099	0.005 polegadas x 3 polegadas
Capilar de vidro borosilicato	Harvard Apparatus LTD	30-0053	Parede padrão de borosilicato sem filamento, 1,5 mm OD, 0,86 mm ID, 100 mm de comprimento
Capilares de vidro multibarril	Instrumentos de Precisão Mundial	5B120F-4	Capilar de 5 cilindros, 4 polegadas de comprimento, 1,2 mm OD, com filamento
Diaplus	DiaDent	2001-2101	Adesivo fotopolimerizável, usado para prender o eletrodo de tungstênio à pipeta multibarril de vidro
G-Bond	GC Corporation	2277	Adesivo fotopolimerizável, usado para prender o espigão ao crânio do animal
Carisma	Heraeus Kulzer	66000087	Compósito fotopolimerizável, usado para reforçar a ligação do espigão com o crânio
Araldit Cristal	Ceys	, usado para fixar ainda mais a fixação do eletrodo de tungstênio à pipeta multibarril de vidro
			Incluindo bombas de iontoforese IP-2 (uma para cada canal de administração de medicamentos) e um módulo de equilíbrio
Extrator de pipetas de vidro multibarril	Lâmpada LED Narishige	Modelo PE-21
	Technoflux	CV-215	5 W, 430-485 nm
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	Agulha plástica flexível, 34 AWG
Imalgene	Merial		Cetamina, 100 mg/mL
Rompun	Bayer		Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531	Sigma	S106	Prepare ~ 1000µ l de 20 mM de gabazina em água destilada e ajustar o pH para 4