Abstract
Multiple Sklerose ist vermutlich eine entzündliche Autoimmunerkrankung, die durch Bildung von Läsionen im zentralen Nervensystem (ZNS), die sich in kognitiven und motorischen Beeinträchtigungen charakterisiert ist. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein nützliches Tiermodell der MS, weil es auch durch Bildung von Läsionen im ZNS, motorischen Beeinträchtigungen charakterisiert ist und auch von Autoimmun- und Entzündungsreaktionen angetrieben wird. Einer der EAE - Modellen mit einem Peptid , abgeleitet von dem Myelin - Oligodendrozyten - Protein (MOG) 35-55 in Mäusen induziert. Die EAE Mäuse einen progressiven Krankheitsverlauf zu entwickeln. Dieser Kurs ist in drei Phasen unterteilt: die präklinische Phase (Tag 0 - 9), der Ausbruch der Krankheit (Tag 10 - 11) und der akuten Phase (Tag 12 bis 14). MS und EAE werden durch autoreaktive T-Zellen induziert, die das ZNS infiltrieren. Diese T-Zellen sezer Chemokine und Zytokine, die die Einstellung von weiteren Immunzellen führen. Daher ist die Immunzellverteilung im Rückenmark dährend die drei Krankheitsphasen untersucht. Um den Zeitpunkt der Krankheit hervorheben, an dem die Aktivierung / Proliferation / Anhäufung von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten beginnt, die Immunzellverteilung in Lymphknoten, Milz und Blut wurde ebenfalls bewertet. Darüber hinaus sind die Ebenen der mehreren Cytokinen (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFN & ggr;) in den drei Krankheitsphasen bestimmt, Einblick in die Entzündungsprozesse der Krankheit zu erhalten. Zusammenfassend liefern die Daten, die einen Überblick über das Funktionsprofil von Immunzellen während EAE Pathologie.
Introduction
Multiple Sklerose (MS) und der entsprechenden Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zeigen, Autoimmun neuroinflammation Veränderungen im zentralen Nervensystem (ZNS). Frühe aktive MS und EAE Läsionen werden durch die Anwesenheit von Immunzellen infiltriert gekennzeichnet. Die Ätiologie von MS ist unbekannt, wird aber häufig von autoreaktiven T-Zellen vermittelt beinhalten die Zerstörung des Myelins betrachtet. Diese autoreaktiver T-Zellen sezernieren pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine, die andere Immunzellen anziehen, wie beispielsweise B-Zellen, Monozyten und Neutrophile aus dem Kreislauf. Monozyten differenzieren sich in Makrophagen. Interferon gamma (IFNy) abgesondert von autoreaktiven T-Zelle polarisiert die Makrophagen in pro-inflammatorischen Makrophagen. Die pro-inflammatorischen Makrophagen Freisetzung Zytokine und reaktive Sauerstoffspezies, die Apoptose in Oligodendrozyten fördern. Der Tod der Oligodendrozyten führt zu einer Demyelinisierung. Weiterhin unterscheiden B-Zellen in pLASMA Zellen und Freisetzung Autoantikörper gegen die Myelinscheide, was letztlich zu einer Verschlechterung der Myelin. Der Verlust von Myelin führt zu einer Verschlechterung von Axonen und Nervenzellen und dadurch zur Bildung von Läsionsstellen im ZNS , die das Hauptmerkmal der MS 1 darstellen. In der Peripherie sind T-Zellen und B-Zellen in den Lymphknoten aktiviert, proliferieren sie in der Milz und wandern durch den Kreislauf in das zentrale Nervensystem. Monocyten und Neutrophile proliferieren im Knochenmark und auch durch den Kreislauf in das zentrale Nervensystem zu migrieren.
Leukozytenextravasation aus dem Knochenmark, der Milz und der Lymphknoten in das Blut oder aus dem Blut in das ZNS ist ein mehrstufiger Prozess, der von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich der molekularen Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und von Chemokinen und Chemokinrezeptoren vermittelte Endothel. Die Produktion von Chemokinen durch verschiedene Zelltypen während der Immun reactio induziert werdenn durch Zytokine wie Tumor - Nekrose - Faktor-α (TNF & agr;), IFN & ggr; und Interleukin-6 (IL-6), die anschließend Immunzellen an den Ort der Entzündung 2,3 rekrutiert. Immunzellen, die eine Untergruppe von Chemokin-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, je nach Zelltyp und Migrationspfad zur Entzündungsstelle. Somit CXCR2, CCR1 und CXCR1 auf reifen Neutrophilen im Knochenmark exprimiert werden und Blut 4 und Bindung seiner Liganden, CXCL2, CCL5 oder CXCL6 bzw. aktiviert Neutrophile und fördert ihre Adhäsion an das Endothel und anschließend, um die Migration der Zellen in das Gewebe 5-9. CCL2 und CCL20 anziehen Monozyten und Th1 / Th17 - Zellen 10, die jeweils CCR2 11 und CCR6 12, zum Ausdruck bringen. CCR1 und CCR5, die von verschiedenen Zelltypen exprimiert, einschließlich T - Zellen, Monozyten und Makrophagen 13 binden CCL3, CCL5 und CCL7 und werden während der MS 14 aufreguliert. CXCR3 wird ausgedrückt auf T-Zellen und bindet CCL9, CCL10 undCCL11 15.
Eine Hauptstrategie in der MS-Behandlung ist der Abbau von Immunzellen oder die Verhinderung von Immunzellinfiltration in das ZNS. Daher hat die Blockade von spezifischen Chemokinrezeptoren wurde in EAE untersucht. Antagonismus oder genetische Deletion von CCR1 16, 17 CCR2, CCR7 18 oder CXCR2 19 reduziert EAE Pathologie, während Antagonismus oder genetische Deletion von 20 CCR1, CCR5 20 oder 21 CXCR3 hat die Pathologie nicht reduzieren. Daher ist die Expression von spezifischen Chemokinrezeptoren auf Leukozyten entscheidend für die Infiltration des letzteren in das ZNS und bestimmt den Verlauf der EAE.
Die Abreicherung von Immunzellen ist eine wirksame Behandlungsstrategie für MS - Patienten, da infiltriert Immunzellen Cytokine freizusetzen, wie TNFa, IL-6 und IL-1β, welche wiederum, 22 den Entzündungsprozess oder den Abbau von Neuronen fördern. Darüber hinaus auto-reaktiven Th1 Zellen setzen IFNy, die wiederum Makrophagen freizusetzen TNFa, IL-1β und IL-23 stimuliert.
Diese Handschrift beschreibt die Induktion von EAE, die Bestimmung der Immunzellverteilung und die Zytokinkonzentrationen (mRNA) in verschiedenen Geweben in EAE-Mäusen. Die Zellen wurden während des Krankheitsverlaufs zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert eine zeitabhängige Überblick über die entzündlichen Prozesse zu schaffen, die schließlich in der ZNS-Läsion Bildung führen.
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Protocol
ETHIK STATEMENT: Unsere experimentellen Verfahren genehmigt werden von der Ethikkommission des Regierungspräsidiums Darmstadt (Deutschland) und den nationalen und europäischen Vorschriften bestätigen. Alle Anstrengungen wurden unternommen, das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu verringern.
1. EAE Modell
- Die Induktion des EAE-Modell
- Verwenden 10- bis 13-Wochen alten weiblichen 129S4 / SvJae × C57BL / 6-Mäuse zur Induktion von EAE.
- Geben die Mäuse eine subkutane Injektion in die oberen und unteren Rücken des enzephalitogenen MOG 35-55 (Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein) Peptid (200 ug), emulgiert in 200 & mgr; l komplettes Freund`s Adjuvans (CFA) , das 400 & mgr; g Mycobacterium tuberculosis.
Anmerkung: Als negative, nicht-krankheitsauslösenden Scheinkontrolle, unvollständiges Freund'sches Adjuvans Mycobacterium tuberculosis, in der gleichen Menge und dem gleichen Weg kann verwendet werden. - TherENach und nochmals 24 Stunden später, geben die Mäuse eine intraperitoneale Injektion von Pertussis-Toxin (insgesamt 0,2 & mgr; g, verdünnt in 200 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung, PBS). Verwenden Sie unbehandelte Mäuse als Kontrollgruppe, in der Lage sein mit gesunden Tieren erkrankten zu vergleichen.
Anmerkung: Es ist auch möglich, EAE zu induzieren mit 200-300 ug MOG 35-55 Peptid, 300-500 & mgr; g Mycobacterium tuberculosis in CFA und 0,2-0,3 & mgr; g Pertussis - Toxin in einem Volumen von 0,1-0,2 ml pro Injektion. - Ab einer Woche nach der Injektion examine Mäuse täglich auf klinische Symptome (siehe Schritt 1.2.1)
Anmerkung: Der Tag des Krankheitsanfalls variiert in verschiedenen Experimenten, aber unter den in unserem Labor, dies ist etwa Tag 11 und somit hier Tag 14 wird definiert als 3 Tage nach dem Ausbruch der Krankheit. Alle Mäuse in der vorliegenden Studie entwickelten klinischen Symptome.
- Scoring der Mäuse
- Klassifizieren der klinischen Symptome von klinischen Scores wie folgt:0) keine Anzeichen, 0,5) distale Lähmung des Schwanzes, 1) vollständige Lähmung des Schwanzes, 1.5) schlaffer Schwanz und mild Schwäche der Hinterbeine, 2) schlaffer Schwanz und schwere Schwäche der Hinterbeine, 2.5) schlaffer Schwanz und Lähmung ein Hinterbein, 3) schlaffer Schwanz und Lähmung beider Hinterbeine, 3.5) Lähmung beider Hinterbeine und Schwäche eines Vorderschenkel (Mäuse diese Punktzahl zu erreichen wurden eingeschläfert, mit den lokalen ethischen Richtlinien im Einklang).
2. Herstellung von Einzelzellen für die Durchflusszytometrie-Analyse
Hinweis: Die Antikörpermischung besteht aus 1 ul CD45-Vioblue, 2 ul CD8-eFluor650, 0,5 ul CD11b-eFluor605, 0,5 ul F4 / 80-PE-Cy7, 1 & mgr; l CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 & mgr; l CD11c -AlexaFluor700, 1 ul CD19-APC-H7 und 1 ul Ly6G-APC-Cy7.
Hinweis: Wenn Sie nehmen Blut, Lymphknoten, Milz und Rückenmark dann die Prozedur ist wie folgt: Die Mäuse sind tief mit einer Kombination aus isofl narkotisiertUrane (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht). Weiter, um den Brustkorb zu öffnen, um das Blut mit einem intrakardialer Stick entfernen und die Mäuse intrakardial mit kaltem PBS perfuse. Dann entfernen Sie Knoten die Lymphe von Milz und schließlich das Rückenmark. Wenn Sie die Mäuse nicht intrakardial perfuse müssen dann die Mäuse durch Luxation des Halses unter tiefer Narkose einschläfern.
- Isolation von Splenozyten
- Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht).
- Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol eine Kontamination mit den Haaren zu vermeiden und den Thorax in Längsrichtung zu öffnen, ohne tiefere Gewebe Punktierung mit einer Schere.
- Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23.
Hinweis: Die Milz im linken superior Bauch unter dem Brustkorb befindet. Wenn nur die Milz untersucht werden, dieses Organ kann vor Perfusion entfernt werden, um zu retain alle Zelltypen von Interesse. - Entfernen Sie die Milz und schneiden etwa 1/8 aus und wiegen. Lagern Sie die Probe in PBS auf Eis.
- Quetschen das Milzgewebe durch ein 70 um Mesh Sieb (angeordnet über einem 50 ml Röhrchen), mit dem Kolben einer 2 ml Spritze.
- Waschen Sie das Gitter mit 5 ml PBS. Zentrifuge bei 1.800 × g für 3 min. Das Pellet in 500 & mgr; l Lyse-Lösung.
Hinweis: In dieser Phase kann es notwendig sein, um eine Differentialzelle machen zählen, wenn später eine alternative FACS-Analyseverfahren verwendet wird, das verwendet keine Perlen (siehe Abschnitt 3). - Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) und fügen 500 ul PBS. Zentrifuge für 6 min bei 650 xg bei Raumtemperatur (RT).
- Wiederholen Sie den Waschschritt mit 500 ul PBS. Überstand verwerfen, Zellpellet in 100 ul 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS, fügen Sie 2 ul Fc-Rezeptor-1 (FcRI-) Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln.
- In 13 ul einetibody Mischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 & mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen.
Hinweis: Die Färbeverfahren des Herstellers empfiehlt einen einzigen Wasch, aber zusätzliche Reduzierung der Hintergrundfärbung kann durch gegebenenfalls Wiederholung der Waschschritt ein oder zwei weitere Male erreicht werden. - Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l PBS (oder möglicherweise zur Proteintrennung Laufpuffer, um potenziell Zell Verklumpen zu reduzieren) und überträgt es cytometry Rohr zum Strömungs. Halten Sie Zellen auf Eis.
- Isolierung von Lymphknotenzellen
- Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht).
- Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol und öffnen Sie den Thorax längs einer Schere. Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23.
- Um den Leistenlymphknoten isolieren, entfernen Sie vorsichtig die Haut im Bereich der hallop und wählen Sie die Lymphknoten vorsichtig aus dem Fettgewebe mit einer Pinzette. Wiegen Sie den Leistenlymphknoten und speichern Sie die Probe in PBS auf Eis.
Hinweis: Wir haben Leistenlymphknoten in unseren Studien , weil O`Connor et al. festgestellt , dass eine hohe Zahl von aktivierten Monozyten, Makrophagen, Neutrophile und T - Zellen alle in den Leistenlymphknoten nach EAE Induktions 24 vorhanden waren. - Drücken Sie den Lymphknoten durch einen 70 & mgr; m-Mesh-Sieb (platziert über einen 50-ml-Röhrchen) mit dem Kolben einer 2-ml-Spritze.
- Waschen Sie das Gitter mit 5 ml PBS. Zentrifuge bei 2.400 × g für 8 min. Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln.
- In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 & mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT.
- Überstand verwerfen, Zellpellet in 300 ul PBS (oder einen geeigneten Laufpuffer) und übertragenauf eine Durchflusszytometrie Röhre.
- Isolierung von Blutzellen
- In 50 ul 20 mM HEPES bis 50 & mgr; l Blut (stabilisiert mit EDTA) und fügen 500 ul Lyselösung. Inkubieren für 10 min bei RT und fügen 500 ul PBS. Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen und wiederholen Sie den Waschschritt.
- Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln.
- In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 & mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen, Zellpellet in 300 ul PBS und übertragen es auf die Durchflusszytometrie Röhre.
- Isolation von Rückenmarkszellen
- Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht).
- Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol und öffnen Sie den Thorax längsmit einer Schere. Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23.
- Befeuchten Sie den Schnittbereich auf der Rückseite und machen wieder einen Längsschnitt mit einem Skalpell und entfernen Sie die Haut.
- Schneiden Sie den Lenden Teil der Wirbelsäule aus (die die Hinterbeine innervates) und spülen Sie es mit einer PBS-Spritze das Rückenmark zu extrahieren. Schneiden Sie ca. 1/3 der Lendenwirbel aus, wiegen diese und speichern Sie die Probe in PBS auf Eis.
- Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, 500 & mgr; l Zellablösung Lösung und HBSS (1: 1). In 3 mg / ml Kollagenase A und 1 Einheit / ml DNase I, decollate die Zellen durch wiederholte nach oben und unten Pipettieren und Inkubation für 30 min unter Schütteln bei 37 ° C bei 400 Umdrehungen pro Minute.
Hinweis: Wenn bevorzugt, kann die Zellsuspension durch Dichtegradientenzentrifugation von kontaminierenden Myelin und Zelldebris gelöscht werden, die die Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie Messung verbessern kann, wodurch, Hintergrundautofluoreszenz ein Reduktionsd die Anzahl der Ereignisse, die zu erwerb (siehe Abschnitt 3.5). - Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei RT. Überstand verwerfen, das Pellet in 1 ml 10% fötales Kälberserum (FCS) / Dulbeccos minimal essentiellem Medium (DMEM) und decollate die Zellen erneut durch wiederholte auf und ab Pipettieren.
- Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei RT. Wiederholen Sie den Waschschritt.
- Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml PBS und drücken den Kolben einer 2 ml-Spritze in das Rückenmark durch ein 70 um Mesh Sieb (angeordnet über einem 50 ml Röhrchen).
- Waschen Sie das Gitter mit 4 ml PBS. Zentrifuge bei 1.800 × g für 3 min bei RT. Überstand verwerfen, Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blockierungsreagenz und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln.
- In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 & mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT.
- Überstand verwerfen, suspendieren die Zelle pellet in 500 ul PBS (oder einem geeigneten Laufpuffer) und überträgt es auf die Durchflusszytometrie Röhre.
3. Analyse über Durchflusszytometrie
- Titrieren alle vorher Antikörper optimalen Konzentrationen zu bestimmen , wie durch Olesch et al. 25.
- Verwenden Antikörper-Einfangen Entschädigung Perlen für einfarbige Kompensation Mehrfarbkompensation Matrizen gemäß den Hersteller `s Anweisungen zu erstellen.
- Kontrollieren Sie die Gerätekalibrierung täglich mit speziellen Perlen gemäß den Hersteller `s Anweisungen.
- Unmittelbar vor der Durchflusszytometrie Messung wurden 30 ul absolute Zahl Standard durchflusszytometrischen zu den Zellen hinzu (für die Isolierung siehe Abschnitt 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) absolute Zellzahlen zu bestimmen. Anstelle des Zählens Perlen verwenden, können die Zellen gezählt werden.
- Nehmen Sie Proben (Zellen aus der Milz, Lymphknoten und Blut: 100.000 Ereignisse, Rückenmark: 500.000 Ereignisse) in einem Durchflusszytometer einnd analysieren spezifische Durchflusszytometrie-Software.
- Öffnen Sie die Durchflusszytometrie Software und fügen Sie fcs 3.0-Dateien durch Drücken der Taste "add Samples".
- Öffnen Sie die hinzugefügte Datei mit einem Doppelklick. Stellen Sie die Kanäle für die x- und y-Achse. So wählen Sie die Zellpopulationen von Interesse ein Tor erzeugen (siehe Abbildung 4).
4. Quantitative PCR-Analyse
- Isolierung von mRNA und Transkription in cDNA
- Extrahieren Sie die mRNA von lumbalen Rückenmark (1/3), Milz (1/8) und Leistenlymphknoten durch Phenol-Chloroform und fällt mit Ethanol 26.
- Hierzu homogenisieren das Gewebe in 1 ml Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Mischung für 10 min inkubieren. In 200 ul Chloroform und Inkubation erneut 10 min.
- Nach einem Zentrifugationsschritt (18.000 xg für 15 min bei 4 ° C), waschen Sie die obere wässrige Phase wird mit 500 & mgr; l Isopropanol und Zentrifuge (18000 × g für 8 min bei 4° C).
- Waschen Sie das Pellet mit 500 ul Ethanol und nach einem Zentrifugationsschritt (18.000 xg für 5 min bei 4 ° C), trocknet das Pellet im Vakuum-Konzentrator (5 min bei 30 ° C). Danach das Pellet in 30 ul Wasser.
- Zur Extraktion der mRNA aus Blut, Zentrifuge 500 ul EDTA-stabilisiertes Blut (300 · g 10 min 4 ° C).
- Nehmen den buffy coat, enthält weiße Blutkörperchen und verdünnt in 1 ml Lyse - Lösung (150 mM NH 4 Cl, 100 mM NaHCO 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4).
- Zentrifuge Nach 10 min Inkubation bei RT, die Zellen bei 650 × g für 6 min und danach zweimal waschen mit PBS.
- Extrahieren der mRNA aus weißen Blutkörperchen (WBCs) ein Kit zur RNA-Extraktion unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers.
- Führen cDNA-Synthese ein Kit für die cDNA-Synthese einschließlich zufälliger Hexamere gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Verwenden Sie 200 ng mRNA für das CDNEine Synthese.
- Extrahieren Sie die mRNA von lumbalen Rückenmark (1/3), Milz (1/8) und Leistenlymphknoten durch Phenol-Chloroform und fällt mit Ethanol 26.
- Quantitative PCR
- Um die Menge einer spezifischen mRNA zu quantifizieren, verwendet werden 1 & mgr; l cDNA, 1 & mgr; M Vorwärts / Rückwärts - Primer und einen fluoreszierenden DNA - Bindungsfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers 27. Siehe Tabelle 1 für die Sequenzen für die Primer - Sets. Messen Sie die CT-Werte von IL-1β, IL-6, IL-23, IFN & ggr;, TNFa und PPIA (Peptidyl-Prolyl-Isomerase), um eine quantitative PCR-System.
- Zur Bestimmung der relativen mRNA - Expression des Vergleichs CT (cycle threshold) Verfahren 27 verwendet werden .
- Hierzu CT-Werte der Zielgene zu den Expressionsniveaus von PPIA normalisieren , indem der Mittelwert CT-Wert von PPIA vom Zielgen subtrahieren, wie in früheren Studien beschrieben (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Anschließend berechnen die so ΔΔCT-Werte genannt, mit denen, normalisieren die ACt-Werteder Zielgene von EAE Mäuse mit dem Expressionsniveau der Zielgene von unbehandelten Mäusen, wiederum durch den Mittelwert ACt-Wert in der unbehandelten Mäusen aus dem ACt-Wert in EAE Mäuse subtrahieren.
- Um die relative mRNA - Expression des Zielgens zu gewinnen, wird das Verhältnis unter Verwendung der folgenden Formel: 2 - ΔΔct.
- Testen Sie die Spezifität von jedem Primer. Bestimmung der amplifizierten Fragmentgröße unter Verwendung einer 2% igen Agarosegel 31. Die Fragmentgröße ist in Tabelle 1 gezeigt.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die verschiedenen Methoden in diesem Artikel beschrieben. 1) Die Mäuse erhalten eine Injektion von MOG 35-55 Antigen und entwickeln erste klinische Symptome nach 10,7 ± 0,3 Tagen 28. Eine repräsentative Krankheitsverlauf der EAE - Mäusen ist in Abbildung 1. 2) verschiedene Gewebe (Milz, Lymphknoten, Lenden - Rückenmark) und Blut werden von der Kontrolle und EAE Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten während der präklinischen Phase (Tag 2, Tag 4 extrahiert gezeigt 6 Tage), während der Ausbruch der Krankheit (Tag 10) und während der akuten Phase der Krankheit (Tag 12, Tag 14). 3) mRNA - Expressionsprofil von Cytokinen, die EAE - Entwicklung regulieren, wird in den verschiedenen bestimmt Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten während des Krankheitsverlaufs unter Verwendung von quantitativer PCR extrahiert. 4) Einzelzellen aus verschiedenen Geweben extrahiert isoliert sindzu verschiedenen Zeitpunkten während des Krankheitsverlaufs und der Immunzellverteilung bestimmt Durchflusszytometrie verwendet wird.
In der Milz und Lymphknoten-T-Zellen und B-Zellen werden als die prominentesten Zelltyp beobachtet. Im Gegensatz zu den Lymphknoten, der Milz, zusätzlich sind eine hohe Anzahl von Monozyten und Neutrophilen vorhanden. Alle Immunzellen zeigen eine vorübergehende Zunahme in den Lymphknoten während der akuten Phase, während nur Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen und Neutrophile Anstieg in der Milz. Im Blut erhöhen alle Immunzellen transient während der präklinischen Phase. Im lumbalen Rückenmarks, ein krankheitsabhängigen Anstieg in allen Immunzellen beobachtet wird , abgesehen von Monozyten, die vermutlich an Makrophagen nach ihrem Eintritt in das Rückenmark (Abbildung 2) zu differenzieren. CD4 + und CD8 + T - Zellen zeigen vergleichbare Veränderungen in Milz, Lymphknoten und Blut während der verschiedenen Krankheitsverläufen. binOng Zellen , die das Rückenmark zu infiltrieren, wurde der Anstieg der CD4 + -T - Zellen am ausgeprägtesten (Abbildung 3). In Figur 4 ist der Gating-Strategie für die Bestimmung der verschiedenen Zellpopulationen gezeigt. Im einzelnen Zellpopulationen in diesem Manuskript beschrieben wurden wie folgt identifiziert: Monozyten (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c-, CD11b +), Makrophagen (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD11c-, CD11b +, F4 / 80hi), Neutrophile (CD45hi, CD3-, CD11b +, Ly6G +), dendritische Zellen (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c +), B-Zellen (CD45hi, CD3, CD19 +), T-Zellen (CD45hi, CD3 +) , CD4 + T-Zellen (CD45hi, CD3 +, CD4 +) und CD8 + T-Zellen (CD45hi, CD3 +, CD8 +). Die Zahl der Zellen werden auf die Menge an Gewebe (Gewicht der Milz, Lymphknoten, lumbale Rückenmark) oder dem Blutvolumen bezogen, wodurch die absolute Zellzahl widerspiegelt. Es ist jedoch möglich, die Zelltypen als Prozentsatz der Gesamtzellen gemessen auszudrücken.
in LYMph-Knoten, wird die Expression von IL-23 mRNA transient während der präklinischen Phase erhöht, wohingegen die Expression von IL-6 mRNA in einer krankheitsabhängigen Weise erhöht. In der Milz, IL-6 und IL-23-mRNA-Expression erhöht transient in der präklinischen Phase, während beim Einsetzen der Krankheit, IL-1β-mRNA-Expression erhöht wird. Im Blut wird die Expression von TNF & agr; mRNA in einer krankheitsabhängigen Weise erhöht. In der lumbalen Rückenmark, TNFa, IL-1β und IFNy Anstieg während der akuten Phase, während IL-6 wird während der Beginn Phase (Abbildung 5) nach oben reguliert.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Arbeitsablauf für die Induktion und Immunologische Bewertung von EAE. 1) EAE in Mäusen induziert zur Entwicklung von klinischen Symptomen führt. Klinische Symptome sind Klassifivon klinischen Scores ed, wie folgt: 0) keine Anzeichen, 0,5) distale Lähmung des Schwanzes, 1) vollständige Lähmung des Schwanzes, 1.5) schlaffer Schwanz und mild Schwäche der Hinterbeine, 2) schlaffer Schwanz und schwere Schwäche der Hinterbeine , 2.5) schlaffer Schwanz und Lähmung eines Hinterbein, 3) schlaffer Schwanz und Lähmung beider Hinterbeine. Die Anzahl der Mäuse in der Figur gezeigt , verwendet , betrug 7. Die Figur wurde von Barthelmes modifiziert worden et al. 28. 2) Die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten während des Krankheitsverlaufs geopfert werden, Milz, inguinalen Lymphknoten, Blut und Lendenrückenmark extrahiert und einzelne aus diesen Geweben isolierten Zellen. 3) Immunzellverteilung in verschiedenen Geweben, wie mittels Durchflusszytometrie bestimmt. 4) mRNA - Expression für verschiedene Zytokine in den verschiedenen Geweben, wie durch quantitative PCR bestimmt. Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen dieser fild.
Abbildung 2:. Immune Cell Distribution, bestimmt durch FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) Analyse in Milz, Lymphknoten, Blut und Rückenmark - Proben von EAE Mäuse bei verschiedenen Krankheitsstadien Im Experiment gezeigt, war die Anzahl der Mäuse pro Gruppe 2 - 10. die Verteilung von Neutrophilen / Monozyten im Blut und Neutrophilen / Makrophagen im Rückenmark sind angepasst und modifiziert von Barthelmes et al . 28. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: CD4 + T - Zellen und CD8
Abbildung 4: Gating - Strategie für Durchflusszytometrie Analyse von T - Zellen, B - Zellen, Neutrophile, Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagen von Spinal Cord von EAE Mäuse an Tag 12.) ein Grundstück von SSC / CD45 aus allen Zellen. Gate:. CD45 + Zellen B) Eine grafische Darstellung von FSC-H / FSC-W von CD45 + Zelles. Gate: Einzelzellen C) Ein Plot von SSC-A / FSC-A aus einzelnen Zellen.. Gate: lebende Zellen. D) Eine grafische Darstellung von FSC-H / CD3 aus lebenden Zellen. Gate: CD3 + und CD3 - Zellen E) Eine graphische Darstellung der CD4 / CD8 von CD3 + Zellen.. Gate: CD4 + CD8 - (CD4 + T - Zellen) und CD4 - CD8 + (CD8 + T - Zellen) F) Eine grafische Darstellung von CD19 und Ly6G / CD11b von CD3 - Zellen.. Gate: CD19 + CD11b - Zellen (B - Zellen), Ly6G + CD11b + Zellen (Neutrophile) und CD19 - Ly6G - Zellen G) Ein Plot von CD11c / CD11b - Zellen aus CD19 - Ly6G - Zellen. Tor CD11c + Zellen (dendritische Zellen ) und CD11c - Zellen H) Eine graphische Darstellung der SSC / F4 / 80 fr.om CD11c - Zellen. Gate: F4 / 80 - Zellen (Monozyten) und F4 / 80 + Zellen (Makrophagen). Eine repräsentative Darstellung von 9 gezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 5: Cytokinprofil (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFN & ggr;) in Proben von EAE Mäuse bei verschiedenen Krankheitsstadien A) Lymphknoten, B) Milz, C) Blut und D) des Rückenmarks. die mRNA-Expressionsniveaus wurden normalisiert propyl-Isomerase A (PPIA) peptidische und wurden unter Verwendung des mRNA-Ebene von unbehandelten Mäusen des gleichen Alters ermittelt. Messungen wurden dreifach durchgeführt. Die Anzahl der Mäuse pro Gruppe war 2 - 3. Ergebnisse sind als Mittelwert ± standard Fehler (SEM). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Gen | Vorwärts- | umkehren | Bruchstückgröße (Bp) | ||||
| IL-1β | CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA | CCGACAGCACGAGGCTTT | 76 | ||||
| IL-6 | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | 76 | ||||
| IL-23 | GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC | GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA | 127 | ||||
| IFNy | CACGGCACAGTCATTGAAAGC | CACCATCCTTTTGCCAGTTCC | 118 | ||||
| TNFa | TGACAAGCCTGTAGCCCACG | GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC | 178 | ||||
| PPIA | GCTGGACCAAACACAAACGG | GCCATTCCTGGACCCAAAAC | 144 | ||||
Tabelle 1: Primer - Paare.
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Discussion
Die EAE - Modell hier beschrieben hat die meiste Aufmerksamkeit als ein Modell der MS empfangen und in die Prüfung therapeutischer Strategien für MS 32 routinemäßig eingesetzt. Die Maus-Krankheit zeigt viele klinische und histologische Merkmale der MS und wird durch die Induktion von Autoimmunität zu neuronale Antigene verursacht. Die Sensibilisierung gegen Myelin-Antigene ist mit Blut-Hirn-Schranke Dysfunktion assoziiert und dadurch Immunzellinfiltration in das ZNS. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Immunzellen in der akuten Phase vorübergehend in den Lymphknoten zu erhöhen. Milz-T-Zellen und B-Zellen zu verringern in der vorklinischen Phase der Krankheit. Blut, T-Zellen, B-Zellen, dendritischen Zellen und Monozyten erhöhen vorübergehend in der präklinischen Phase, während Neutrophilen erhöhen krankheitsabhängig in Umlauf. Schließlich im Rückenmark, eine Zunahme in Immunzellen nachweisbar ist (Abbildung 2). Diese Daten zeigen, dass T-Zellen und B-Zellen aus der Milz wandern, der wirkt,ein Reservoir für diesen Zellen in die Lymphknoten, wo sie aktiviert werden und proliferieren. Anschließend wandern sie über den Kreislauf in das Rückenmark. Neutrophile, Monozyten und dendritischen Zellen, zum anderen wandern die aus dem Knochenmark durch die Zirkulation in das ZNS.
Unsere Daten zeigen, dass im Rückenmark, IFNy, TNFa und IL-1β werden in einer krankheitsabhängig geregelt, wohingegen IL-6 transient zu Beginn der Erkrankung hochreguliert ist. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass EAE Pathologie von Th1 und Th17 Zellen angetrieben wird. Th1 - Zellen freizugeben IFNy, die wiederum Makrophagen freizusetzen TNFa und IL-1β 33 aktiviert. Darüber hinaus ist IL-6 bekannt Differenzierung von Th1 und Th17 - Zellen zu treiben und dadurch die Entwicklung von EAE 34 fördern.
Der Tag der Beginn der klinischen Symptome und der Schwere der Erkrankung in Mäusen EAE variabel. Basierend auf unserer Erfahrung gibt es mehrere rEasons dafür. Mäuse ausgesetzt Stress während der präklinischen Phase zeigen eine reduzierte Schwere der Erkrankung und eine Verzögerung bei Beginn der Erkrankung. Das Gehäuse der Mäuse beeinflusst auch die Schwere von EAE als auch den Tag des Einsetzens. Kürzlich wurde gezeigt , dass die commensal microbiota von Mäusen die Entwicklung von EAE 35 und verschiedenen Gehäuse Situationen beeinflussen können die microbiome beeinflussen und dadurch die Pathologie EAE. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, immer frisch zubereitet Pertussis-Toxin zu verwenden. Pertussis-Toxin schädigt die Blut-Hirn-Schranke, die eine Voraussetzung für die Entwicklung von EAE ist. Verwenden Sie keine emulgiert MOG 35-55 Peptid nach dem Ablaufdatum. Das Alter der Mäuse beeinflusst auch EAE Pathologie. So gibt es einige Regeln, die erfüllt werden sollten, ein reproduzierbares EAE-Modell zu generieren. Verwenden Sie im Alter von Mäusen zwischen 10 und 13 Wochen und Mäuse vom gleichen Lieferanten, falls möglich. Wenn die Mäuse von einem externen Lieferanten bestellt werden, damit die Mäuse für zwei akklimatisierenWochen im Tierhaus. Behandeln Sie die Mäuse sanft vor EAE Induktion, so dass sie mit der Handhabung gewöhnen. Vermeiden Sie unnötige Handhabung nach EAE Induktion. Geben Sie die Mäuse, die mit Nahrung und Wasser, das sie leicht, sobald sie zeigen klinische Symptome zu erreichen. Wenn die Mäuse mit einem Medikament zu behandeln sind, ist es am besten, es in die Nahrung oder Trinkwasser zu mischen, zu vermeiden Stress Effekte Verwechselung. Wenn eine Sonde oder eine Injektion für die Arzneimittelverabreichung notwendig ist, ist es wichtig, die gleiche Route für das Fahrzeug zu verwenden.
Neben dem primären progressiven EAE-Modell hier beschrieben, rezidivierend-remittierender EAE-Modellen gibt es auch. Die verschiedenen Krankheitsverlauf wird durch die Verabreichung von verschiedenen Antigenen in verschiedenen Mausstämmen induziert. Somit ist die Anwendung von MOG 35-55 in Mausstämmen, wie C57BL / 6, SV129, B10, NOD und Biozzi - Mäuse führt zu einer primären progressive Erkrankung Form. Interessanterweise unterscheidet sich der Tag des Beginns in den verschiedenen Mausstämmen. WohingegenC57BL / 6, SV129 und B10 - Mäuse entwickeln erste klinische Symptome von etwa Tag 11 bis 12, Biozzi Mäuse zeigen erste klinische Symptome nach 21 Tagen 36. In einer früheren Studie wurde gezeigt , dass 129S4 / SvJae × C57BL / 6 - Hybride zeigen erste klinische Symptome von etwa Tag 11 28. Die Injektion von Proteolipidprotein (PLP) , 131 bis 151 führt in SJL - Mäuse zur Induktion einer rezidivierend-remittierender Krankheitsverlauf 37. Die beste EAE-Modell zu verwenden, wird auf den Fokus der Forschung ab. Wenn also der Rückfall Phase von Interesse ist, sollte der Rückfall-remittierender Modell während eingesetzt werden, wenn Krankheitsbeginn liegt der Schwerpunkt sollte die progressive Modell verwendet werden. Wenn die Rolle eines spezifischen Proteins im EAE-Modell untersucht werden, unter Verwendung von Knock-out-Mäusen, ist es wichtig zu beachten, dass nicht alle Stämme verwendet werden können, EAE zu induzieren und möglicherweise Rückkreuzens des Knock-out-Belastung auf ein sensibler Stamm notwendig.
Die drei am häufigsten verwendeten types von Tiermodellen von MS (1) Autoantigen induzierte EAE; (2) viral spontan, chronische demyelinisierende Erkrankung induziert, und (3) Toxin-induzierte Demyelinisierung 38. EAE - Modelle werden durch die Induktion von Entzündungen und Autoimmunreaktionen durch die Anwendung einer autoantigenen Peptids wie Myelin - Oligodendrozyten - Protein oder Proteolipidprotein 38 gekennzeichnet. Spontaneous EAE entwickelt in transgenen Mäusen , die ein T - Zell - Rezeptor gegen ein Peptid des Myelin - Oligodendrozyten - Protein 39 überexprimieren. viral-induzierte chronische Entzündung, einem neurotrophen Infektion des zentralen Nervensystems zu induzieren, kann beispielsweise induziert werden, mit Theiler`s murine encephalomyelitis virus. Zellen , die mit dem Virus infiziert werden sowohl von T - Zellen und humoralen Reaktion und führen dadurch zu einer chronischen Demyelinisierung 40,41 angegriffen. Toxin-induzierte Demyelinisierung kann beispielsweise mit dem Kupfer Chelator Cuprizon 42 induziert werden. Dieses Modell führt speziell auf demyeliNation, weil Cuprizon greift die Oligodendrozyten und führt damit zur Aktivierung von Astrozyten und Mikroglia, während entzündliche Prozesse nur eine geringe Rolle spielen. Nach Freigabe des Toxins werden neue Oligodendrozyten erzeugt und eine neue Myelinscheide gebildet wird. Die Verwendung dieser drei Modelle, in komplementärer Weise ermöglicht Auswertung von Arzneimittelwirkungen auf verschiedene Aspekte der Pathogenese von MS, da die Modelle in Bezug auf entzündliche und Immun-und demyelinisierenden Prozessen unterscheiden. In EAE und der Virus-induzierten Modell, Entzündungen und Autoimmunprozesse in erster Linie um die Krankheit treiben, während in der Toxin-induzierten Modell, demyelinisierende und remyelinisierende Prozesse sind vorherrschend. Für die präklinische Prüfung von potenziellen Medikamenten für MS-Behandlung, mindestens drei Modelle, ein Toxin-induzierten Modell, einem Rückfall-remittierender EAE und eine primäre progressive EAE oder eine viral-induzierten Modell sollte die Wirksamkeit des Medikaments zu verifizieren.
Das Modell EAE beschrieb ihree können einen weiteren Einblick in den Mechanismus der Entwicklung der MS-ähnlichen Krankheitsprozess, Identifizierung wichtiger zellulärer Treiber der Krankheit, wie Th1, Th17 und B - Zellen zu gewinnen 43,44 verwendet werden. Je besser das Verständnis der Entzündungs- und Immun bei der Entwicklung von MS beteiligt Prozesse und der Prozesse, die Förderung und die Läsionen lösen, desto wahrscheinlicher ist es, dass neue Behandlungsstrategien entwickelt werden können.
Dennoch hat die EAE-Modell hier beschrieben lediglich einige Eigenschaften gemeinsam mit MS, und verfügt über ein paar deutliche Unterschiede aus der menschlichen Krankheit. Der bekannteste Unterschied ist, dass MS-Patienten häufig in Krankheits Darstellung variieren, was nicht im EAE-Modell wiedergegeben wird. Dies kann aufgrund unterschiedlicher Läsionsmuster in MS-Patienten und EAE Mäuse und der Tatsache, daß die Mäuse durch Inzucht erzeugten Stämme sind. In EAE-Mäusen, sind homogene Läsionen prominentesten im Rückenmark, während in MS-Patienten, vor allem heterogene Läsionenim Gehirn 45,46 gefunden. Darüber hinaus MS und die EAE teilen sich den entscheidenden Beitrag von Th1 - Zellen und Th17 - Zellen für ihre Entwicklung, aber im Gegensatz zu MS, CD8 + T - Zellen spielen eine untergeordnete Rolle bei der EAE Pathologie 33. Abschließend konzentriert sich das EAE-Modell in erster Linie auf die kombinierten Effekte von Autoimmunität, entzündliche Prozesse und Neurodegeneration während demyelinisierende Prozesse weniger zugänglich zu selektiven Beurteilung sind. Daher können andere Tiermodelle wie das Cuprizon Modell verwendet werden , für die unterschiedliche Studie von demyelinisierenden 47 verarbeitet. Die EAE - Modell ist unvollkommen, aber dennoch ein nützliches Modell der MS 33.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
| Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
| Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
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