Abstract
Multipel skleros antas vara en inflammatorisk autoimmun sjukdom, som kännetecknas av lesionsbildning i det centrala nervsystemet (CNS) resulterar i kognitiv och motorisk försämring. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en användbar djurmodell av MS, eftersom den kännetecknas också av lesionsbildning i CNS, motorisk försämring och är också driven av autoimmuna och inflammatoriska reaktioner. En av EAE-modeller induceras med en peptid härledd från myelin oligodendrocyt protein (MOG) 35-55 i möss. De EAE-möss utvecklar ett progressivt sjukdomsförlopp. Denna kurs är indelad i tre faser: den prekliniska fasen (dag 0-9), sjukdomsdebut (dag 10-11) och den akuta fasen (dag 12-14). MS och EAE induceras av autoreaktiva T-celler som infiltrerar CNS. Dessa T-celler utsöndrar kemokiner och cytokiner som leder till rekrytering av ytterligare immunceller. Därför immuncellfördelning i ryggmärgen dnder de tre sjukdomsfaserna undersöktes. För att markera tiden punkt av sjukdomen vid vilken aktiveringen / proliferation / ackumulering av T-celler, B-celler och monocyter startar, var immuncellfördelningen i lymfkörtlar, mjälte och blod också bedömas. Dessutom var nivåerna av flera cytokiner (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i de tre sjukdomsfaserna bestäms, för att få en inblick i de inflammatoriska processerna av sjukdomen. Sammanfattningsvis data ger en överblick över den funktionella profil av immunceller under EAE patologi.
Introduction
Multipel skleros (MS) och dess motsvarande djurmodell, experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), visar autoimmuna neuroinflammation förändringar i det centrala nervsystemet (CNS). Tidigt aktiva MS- och EAE-lesioner kännetecknas av närvaron av infiltrerade immunceller. Orsaken till MS är okänd, men anses allmänt innebära förstörelsen av myelin förmedlas av autoreaktiva T-celler. Dessa autoreaktiva T-celler utsöndrar proinflammatoriska cytokiner och kemokiner som attraherar andra immunceller, såsom B-celler, monocyter och neutrofiler från cirkulationen. Monocyter differentierar till makrofager. Interferon-gamma (IFNy) utsöndras av autoreaktiva T-celler polariserar makrofagerna till pro-inflammatoriska makrofager. De proinflammatoriska makrofager frisättning cytokiner och reaktiva syreradikaler som främjar apoptos i oligodendrocyter. Döden av oligodendrocyter leder till demyelinisering. Dessutom B-celler differentierar till pLasma celler och frisättning autoantikroppar mot myelinskidan, i slutändan resulterar i nedbrytning av myelin. Förlusten av myelin leder till nedbrytning av axoner och neuroner och därigenom till bildandet av skadeställen i CNS som utgör den huvudsakliga kännetecken för MS 1. I periferin, är T-celler och B-celler aktiverade i lymfkörtlarna, de förökar i mjälten och migrera genom omsättning i det centrala nervsystemet. Monocyter och neutrofiler prolifererar i benmärgen och även migrerar genom omsättning i det centrala nervsystemet.
Leukocyter extravasering från benmärg, mjälte och lymfkörtlar i blodet eller från blodet in i CNS är en flerstegsprocess som beror på flera faktorer, bland annat molekylära interaktioner mellan leukocyter och endotel förmedlas av kemokiner och kemokinreceptorer. Produktion av kemokiner av olika celltyper kan induceras under immun reaction av cytokiner såsom tumörnekrosfaktor-α (TNFa), IFNy och interleukin-6 (IL-6), som därefter rekryterar immunceller till stället för inflammation 2,3. Immunceller presentera en delmängd av kemokinreceptorer på deras yta, beroende på celltyp och migration väg till inflammationsstället. Således CXCR2, CCR1 och CXCR1 uttrycks på mogna neutrofiler i benmärgen och blodet 4, och bindning av dess ligander, CXCL2, CCL5 eller CXCL6 respektive aktiverar neutrofiler och främjar deras vidhäftning till endotelet och därefter migrationen av celler i vävnaderna 5-9. CCL2 och CCL20 attrahera monocyter och Th1 / Th17-celler 10, vilka uttrycker CCR2 11 och CCR6 12, respektive. CCR1 och CCR5, som uttrycks av olika celltyper, innefattande T-celler, monocyter och makrofager 13, binder CCL3, CCL5 och CCL7 och uppregleras under MS 14. CXCR3 uttrycks på T-celler och binder CCL9, CCL10 ochCCL11 15.
En huvudstrategi i MS behandling är utarmningen av immunceller eller förhindrande av immuncellinfiltration in i CNS. Därför har blockaden av specifika kemokinreceptorer undersökts i EAE. Antagonism eller genetisk deletion av CCR1 16, CCR2 17 CCR7 18 eller CXCR2 19 minskar EAE patologi, medan antagonism eller genetisk deletion av CCR1 20, gjorde CCR5 20 eller CXCR3 21 inte minska patologin. Följaktligen är uttrycket av specifika kemokinreceptorer på leukocyter avgörande för infiltration av den senare in i CNS och dikterar loppet av EAE.
Utarmning av immunceller är en effektiv metod för att behandla MS-patienter, eftersom infiltrerade immunceller frisätta cytokiner, såsom TNFa, IL-6 och IL-1β, vilket i sin tur främjar den inflammatoriska processen, eller nedbrytning av neuroner 22. Vidare auto-reaktiva Th1-celler frisätta IFNy, som i sin tur stimulerar makrofager att frisätta TNFa, IL-1β och IL-23.
Detta manuskript beskriver induktion av EAE, bestämningen av immuncellfördelningen och cytokinnivåer (mRNA) i olika vävnader i EAE-möss. Celler isolerades vid olika tidpunkter under sjukdomsförloppet för att åstadkomma en tidsberoende översikt över de inflammatoriska processer som slutligen leder till lesionsbildning i CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ETIK ANALYS: Våra experimentella procedurer är godkända av etikkommittén Regierungspräsidium Darmstadt (Tyskland) och bekräfta för Nationella och europeiska regler. Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och minska antalet djur som används.
1. EAE Modell
- Induktion av EAE-modellen
- Använd 10- till 13-veckor gamla kvinnliga 129S4 / SvJae x C57BL / 6 möss för induktionen av EAE.
- Ge mössen en subkutan injektion i den övre och nedre delen av ryggen, den encefalitogena MOG 35-55 (myelin oligodendrocyt glykoprotein) peptid (200 mikrogram), emulgerades i 200 pl komplett Freund`s adjuvans (CFA) innehållande 400 mikrogram Mycobacterium tuberculosis.
Obs: Som en negativ icke-sjukdomsinducerande bluff kontroll, ofullständig Freunds adjuvans innehållande Mycobacterium tuberculosis, i samma volym och samma väg, kan användas. - TherENär, och igen 24 h senare, ge mössen en intraperitoneal injektion av pertussistoxin (totalt 0,2 | ag, utspädd i 200 | il fosfatbuffrad saltlösning, PBS). Använd obehandlade möss som kontrollgruppen, för att kunna jämföra sjuka med friska djur.
Obs: Det är också möjligt att inducera EAE med 200-300 mikrogram MOG 35-55 peptid, 300-500 mikrogram av Mycobacterium tuberculosis i CFA och 0,2-0,3 ug pertussis-toxin i en volym av 0,1 - 0,2 ml per injektion. - Med början en vecka efter injektionen, undersöka möss dagligen med avseende på kliniska symptom (se steg 1.2.1)
Obs: Dagen för insjuknande varierar i olika experiment, men under de förhållanden i vårt laboratorium, är detta runt dag 11 och därmed här dag 14 definieras som 3 dagar efter sjukdomsdebuten. Alla möss i föreliggande studie utvecklade kliniska symptom.
- Poängsättning av mössen
- Klassificera kliniska symtom av kliniska poäng enligt följande:0) inga tecken, 0,5) distala förlamning av svansen, en) fullständig förlamning av svansen, 1,5) slapp svans och mild svaghet av bakbenen, 2) slapp svans och allvarlig svaghet i bakbenen, 2,5) slapp svans och förlamning av ett bakben, 3) slapp svans och förlamning i båda bakbenen, 3,5) förlamning av både bakbenen och svaghet i en främre extremitet (möss uppnå detta poäng avlivades, i enlighet med lokala etiska riktlinjer).
2. Beredning av enstaka celler för flödescytometrianalys
Obs: Blandningen antikropp består av ett pl CD45-Vioblue, 2 pl CD8-eFluor650, 0,5 l CD11b-eFluor605, 0,5 l F4 / 80-PE-Cy7, 1 l CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 pl CD11c -AlexaFluor700, 1 pl CD19-APC-H7 och en pl Ly6G-APC-Cy7.
Obs: Om du tar blod, lymfkörtel, mjälte och ryggmärg då förfarandet är enligt följande: Möss är djupt nedsövd med en kombination av isoflurane (2% i carbogen per minut) och ketamin (100 mg / kg kroppsvikt). Nästa öppna bröstkorgen, ta bort blodet med en intrakadriell pinne och BEGJUTA mössen intracardially med kall PBS. Sedan bort lymfkörtlarna följt av mjälte och slutligen ryggmärgen. Om du inte behöver BEGJUTA mössen intracardially sedan avliva möss enligt djup anestesi genom luxation av halsen.
- Isolering av splenocyter
- Söva möss med en kombination av isofluran (2% i karbogen per minut) och ketamin (100 mg / kg kroppsvikt).
- Våt snitt med 80% isopropanol för att undvika kontaminering med hår och öppna bröstkorgen i längsled, utan att punktera djupare vävnader med hjälp av sax.
- BEGJUTA möss intracardially med kall PBS pH 7,0 23.
Obs: Mjälten ligger i den vänstra överlägsen buken kvadranten under bröstkorgen. Om endast är som skall studeras mjälten, kan detta organ avlägsnas före perfusion i syfte att Retain alla celltyper av intresse. - Ta bort mjälten och avbröt cirka 1/8 och väga den. Lagra provet i PBS på is.
- Pressa mjälten vävnaden genom en 70 ^ m mesh sikt (placeras över en 50 ml rör), med användning av kolven i en 2 ml spruta.
- Tvätta ingrepp med 5 ml PBS. Centrifugera vid 1800 x g under 3 min. Resuspendera pelleten i 500 pl lyseringslösning.
Obs: I detta skede kan det vara nödvändigt att göra en differentialkroppar om senare, är ett alternativ FACS analysmetoden som inte använder pärlor (se avsnitt 3). - Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (RT) och tillsätt 500 | il PBS. Centrifugera i 6 min vid 650 xg vid rumstemperatur (RT).
- Upprepa tvättsteg med 500 | il PBS. Kassera supernatanten, resuspendera cellpelleten i 100 | il 0,2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS, tillsätt 2 pl Fc-receptor-1 (FcRI) blockeringsbuffert och inkubera under 15 min vid RT i mörker.
- Lägg 13 pl entibody blandning, inkubera 15 min vid RT i mörker, tillsätt 500 | il PBS och centrifugera i 6 min vid 650 x g vid RT. Kassera supernatanten.
Notera: Tillverkarens färgningsproceduren rekommenderar en enda tvätt, men ytterligare minskning av bakgrundsfärgning kan uppnås genom att valfritt upprepa tvättsteget en eller två gånger till. - Resuspendera cellpelleten i 500 | il PBS (eller möjligen löpbufferten för proteinseparation, för att eventuellt minska cellklumpning) och överför den till flödescytometri röret. Håll celler på is.
- Isolering av lymfkörtelceller
- Söva möss med en kombination av isofluran (2% i karbogen per minut) och ketamin (100 mg / kg kroppsvikt).
- Våt snitt med 80% isopropanol och öppna bröstkorgen i längdled med sax. BEGJUTA möss intracardially med kall PBS pH 7,0 23.
- För att isolera inguinal lymfkörtel, försiktigt bort huden i området för hip och plocka lymfkörteln försiktigt ur fettvävnad med pincett. Väg inguinal lymfkörtel och lagra provet i PBS på is.
Obs: Vi använde inguinala lymfkörtlar i våra studier på grund O`Connor et al. funnit att ett stort antal aktiverade monocyter, makrofager, neutrofiler och T-celler var alla närvarande i de inguinala lymfkörtlar efter EAE-induktion 24. - Pressa lymfkörteln genom ett 70 | j, m mesh sikt (placeras över en 50 ml rör) genom att använda kolven i en 2 ml spruta.
- Tvätta ingrepp med 5 ml PBS. Centrifugera vid 2400 x g under 8 min. Resuspendera cellpelleten i 100 | j, l 0,2% BSA / PBS, tillsätt 2 pl FcRI blockeringsbuffert och inkubera under 15 min vid RT i mörker.
- Lägg 13 pl antikroppsblandning, inkubera 15 min vid RT i mörker, tillsätt 500 | il PBS och centrifugera i 6 min vid 650 x g vid RT.
- Kassera supernatanten, resuspendera cellpelleten i 300 | il PBS (eller ett lämpligt rinnande buffert) och överföra dentill en flödescytometri rör.
- Isolering av blodceller
- Tillsätt 50 pl 20 mM HEPES till 50 pl blod (stabiliserad med EDTA) och tillsätt 500 pl lyseringslösning. Inkubera under 10 min vid RT och tillsätt 500 | il PBS. Centrifugera under 6 minuter vid 650 xg vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och upprepa tvättsteget.
- Resuspendera cellpelleten i 100 | j, l 0,2% BSA / PBS, tillsätt 2 pl FcRI blockeringsbuffert och inkubera under 15 min vid RT i mörker.
- Lägg 13 pl antikroppsblandning, inkubera 15 min vid RT i mörker, tillsätt 500 | il PBS och centrifugera i 6 min vid 650 x g vid RT. Kassera supernatanten, resuspendera cellpelleten i 300 | il PBS och överför den till flödescytometri röret.
- Isolering av ryggmärgsceller
- Söva möss med en kombination av isofluran (2% i karbogen per minut) och ketamin (100 mg / kg kroppsvikt).
- Våt snitt med 80% isopropanol och öppna bröstkorgen i längdledmed användning av en sax. BEGJUTA möss intracardially med kall PBS pH 7,0 23.
- Blöt snittet område på baksidan och gör återigen ett längsgående snitt med en skalpell och ta bort huden.
- Skär ut den lumbala delen av ryggraden (som innerverar bakbenen) och spola den med en PBS-fylld spruta för att extrahera ryggmärgen. Skär ut ungefär 1/3 av ländmärgen, väga denna och lagra provet i PBS på is.
- Centrifugera vid 250 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten, tillsätt 500 l cell lossnar lösning och HBSS (1: 1). Lägg 3 mg / ml kollagenas A och en enhet / ml DNas I, HALSHUGGA cellerna genom upprepad upp och ner pipettering och inkubera under 30 min med skakning vid 37 ° C vid 400 rpm.
Obs: Om så föredras, kan cellsuspensionen rensas från kontaminerande myelin och cellulär debris genom densitetsgradientcentrifugering vilket kan förbättra känsligheten hos flödescytometri mätningen och därigenom, minska bakgrunds autofluorescens end antalet händelser som måste förvärvas (se avsnitt 3.5). - Centrifugera vid 250 xg under 2 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 1 ml 10% fetalt kalvserum (FCS) / Dulbeccos minimala essentiella medium (DMEM) och HALSHUGGA cellerna igen genom upprepad upp och ner pipettering.
- Centrifugera vid 250 xg under 2 min vid rumstemperatur. Upprepa tvättsteget.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml PBS och pressa ryggmärgen genom en 70 | j, m mesh sikt (placeras över en 50 ml rör) genom att använda kolven i en 2 ml spruta.
- Tvätta mesh med 4 ml PBS. Centrifugera vid 1800 xg under 3 min vid RT. Kassera supernatanten, resuspendera cellpelleten i 100 | j, l 0,2% BSA / PBS, tillsätt 2 pl FcRI blockeringsreagens och inkubera under 15 min vid RT i mörker.
- Lägg 13 pl antikroppsblandning, inkubera 15 min vid RT i mörker, tillsätt 500 | il PBS och centrifugera i 6 min vid 650 x g vid RT.
- Kassera supernatanten, resuspendera cellen pellet i 500 pl PBS (eller ett lämpligt rinnande buffert) och överför den till flödescytometri röret.
3. Flödescytometrisk analys
- Titrera alla antikroppar i förväg för att bestämma optimala koncentrationer som beskrivs av Olesch et al. 25.
- Använd antikroppsfångande ersättning pärlor för enfärgade ersättning för att skapa flerfärgade ersättning matriser enligt tillverkarens anvisningar.
- Styr instrumentets kalibrering dagligen med särskilda pärlor enligt tillverkarens anvisningar.
- Direkt före flödescytometri mätning, tillsätt 30 | il flödescytometrisk absolutantal standard till cellerna (för isolering se avsnitt 2,1, 2,2, 2,3, 2,4) för att bestämma absoluta cellräkningar. Istället för att använda räknings pärlor cellerna kan räknas.
- Ta upp prover (celler från mjälte, lymfkörtel och blod: 100.000 händelser, ryggmärg: 500.000 händelser) i en flödescytometer ennd analysera via specifika flödescytometri programvara.
- Öppna flödescytometri programvara och lägga FCS 3,0 filer genom att trycka på knappen "lägg prover".
- Öppna den tillagda filen genom att dubbelklicka. Justera kanalerna för x- och y-axeln. Att välja cellpopulationer av intresse skapar en grind (se Figur 4).
4. Kvantitativ PCR-analys
- Isolering av mRNA och transkription till cDNA
- Extrahera mRNA från ländryggen ryggmärgen (1/3), mjälte (1/8) och inguinala lymfkörtlar genom fenol-kloroform och utfällning med etanol 26.
- För detta, homogenisera vävnaden i 1 ml guanidiniumtiocyanat-fenol blandningen, inkubera i 10 min. Tillsätt 200 | il kloroform och inkubera igen under 10 min.
- Efter ett centrifugeringssteg (18.000 xg under 15 min vid 4 ° C), tvätta den övre vattenfasen är med 500 | il isopropanol och centrifug (18000 x g under 8 min vid 4° C).
- Tvätta pelleten med 500 | j, l etanol och efter en centrifugeringssteg (18.000 xg under 5 min vid 4 ° C), torka pelleten i vakuum koncentrator (5 min vid 30 ° C). Därefter återsuspendera pelleten i 30 pl vatten.
- Att extrahera mRNA från blod, centrifug 500 pl EDTA-stabiliserad blod (300 xg 10 min 4 ° C).
- Ta lättcellskoncentratet, innehållande vita blodkroppar, och späd i 1 ml lyseringslösning (150 mM NH4CI, 100 mM NaHCOs 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4).
- Efter 10 min inkubation vid RT, centrifugera cellerna vid 650 xg under 6 min och därefter tvätta två gånger med PBS.
- Extrahera mRNA från vita blodkroppar (WBC) med användning av ett kit för RNA-extraktion enligt tillverkarens instruktioner.
- Utföra cDNA-syntes med användning av ett kit för cDNA-syntes, inklusive slumpmässiga hexamerer i enlighet med tillverkarens instruktioner. Använd 200 ng mRNA för CDNEn syntes.
- Extrahera mRNA från ländryggen ryggmärgen (1/3), mjälte (1/8) och inguinala lymfkörtlar genom fenol-kloroform och utfällning med etanol 26.
- kvantitativ PCR
- För att kvantifiera mängden av ett specifikt mRNA, använder ett pl cDNA, 1 | iM framåt / omvänd primer och ett fluorescerande DNA-bindande färgämne i enlighet med tillverkarens instruktioner 27. Se tabell 1 för sekvenserna för de primeruppsättningar. Mät CT-värdena för IL-1β, IL-6, IL-23, IFNy, TNFa och PPIA (peptidyl prolyl-isomeras) med användning av en kvantitativ PCR-system.
- För att bestämma den relativa mRNA-uttryck använder jämförande CT (cykel tröskel) metod 27.
- För detta, normalisera CT-värdena för de målgener till expressionsnivåer av PPIA genom att subtrahera medelvärdet CT-värdet för PPIA från målgenen, såsom beskrivs i tidigare studier (et al. BARTHELMES 28 et al. Schiffmann 29, Schiffmann et al. 30). Därefter, beräkna de så kallade ΔΔCT-värden, vid vilka, normalisera ΔCT-värdenav målgener från EAE-möss till uttrycksnivån för målgenerna av obehandlade möss, återigen genom att subtrahera medelvärdet ΔCT-värde i de obehandlade mössen från ΔCT-värdet i EAE-möss.
- För att få den relativa mRNA-expression av målgenen, beräkna förhållandet med hjälp av följande formel: 2 - ΔΔct.
- Testa specificiteten av varje primer. Fastställa det amplifierade fragmentstorlek med användning av en 2% -ig agarosgel 31. Fragmentstorleken visas i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 ger en schematisk översikt av de olika metoder som beskrivs i den här artikeln. 1) Möss får en injektion av MOG 35-55 antigen och utveckla första kliniska symptom efter 10,7 ± 0,3 dagar 28. Ett representativt sjukdomsförlopp av EAE-möss visas i figur 1. 2) olika vävnader (mjälte, lymfkörtlar, ländryggen ryggmärg) och blod utvinns ur kontroll och EAE-möss vid olika tidpunkter under den prekliniska fasen (dag 2, dag 4 , dag 6), under uppkomsten av sjukdomen (dag 10) och under den akuta fasen av sjukdomen (dag 12, dag 14). 3) mRNA uttryck profil av cytokiner, som reglerar EAE utveckling bestäms i de olika vävnader extraheras vid olika tidpunkter under sjukdomsförloppet, med användning av kvantitativ PCR. 4) Enkel celler isoleras från olika vävnader extraheradevid olika tidpunkter under sjukdomsförloppet och immuncellfördelningen bestämdes med användning av flödescytometri.
I mjälte och lymfkörtlar, är T-celler och B-celler observerades som den mest framträdande celltypen. I motsats till lymfkörtlarna, i mjälten, dessutom ett stort antal monocyter och neutrofiler är närvarande. Alla immunceller visar en övergående ökning i lymfkörtlarna under den akuta fasen, medan endast makrofager, B-celler, T-celler och neutrofiler ökning i mjälten. I blod, alla immunceller ökar övergående under den prekliniska fasen. I den lumbala ryggmärgen, är en sjukdom beroende ökning i alla immunceller observer, bortsett från monocyter, vilket förmodligen skiljer till makrofager efter deras inträde i ryggmärgen (fig 2). CD4 + och CD8 + T-celler visar jämförbara förändringar i mjälte, lymfkörtel och blod under de olika kurserna sjukdoms. ärong celler infiltrerar ryggmärgen, ökningen av CD4 + T-celler var mest uttalad (Figur 3). I figur 4, är grindnings-strategi för bestämning av de olika cellpopulationer som visas. I detalj var cellpopulationer som beskrivs i detta manuskript identifieras enligt följande: monocyter (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c-, CD11b +), makrofager (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD11c-, CD11b +, F4 / 80hi), neutrofiler (CD45hi, CD3-, CD11b +, Ly6G +), dendritiska celler (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c +), B-celler (CD45hi, CD3-, CD19 +), T-celler (CD45hi, CD3 +) , CD4 + T-celler (CD45hi, CD3 +, CD4 +) och CD8 + T-celler (CD45hi, CD3 +, CD8 +). Antalet celler är relaterade till mängden av vävnad (vikt för mjälte, lymfkörtlar, länd- ryggmärg) eller blodvolymen, vilket återspeglar den absoluta celltal. Det är emellertid möjligt att uttrycka de celltyper som procent av totala celler mättes.
i Lymph noder, är uttrycket av IL-23 mRNA transient ökat under den prekliniska fasen, medan uttrycket av IL-6-mRNA ökar i en sjukdomsberoende sätt. I mjälten, ökar IL-6 och IL-23 mRNA-expression transient i den prekliniska fasen, medan på uppkomsten av sjukdomen, är IL-1β-mRNA-expression höjas. I blod, är ett uttryck för TNF-mRNA ökade i en sjukdomsberoende sätt. I ländryggen ryggmärgen, TNFa, IL-1β och IFNy ökning under den akuta fasen, medan IL-6 uppregleras under början fasen (Figur 5).
Figur 1: Schema av arbetsflödet för induktion och immunologiska Bedömning av EAE. 1) EAE induceras i möss som ledde till utvecklingen av kliniska symtom. Kliniska symtom är klassified av kliniska poäng enligt följande: 0) inga tecken, 0,5) distala förlamning av svansen, 1) fullständig förlamning av svansen, 1,5) slapp svans och mild svaghet i bakbenen, 2) slapp svans och allvarlig svaghet i bakbenen , 2,5) slapp svans och förlamning av ett bakben, 3) slapp svans och förlamning i båda bakbenen. Antalet möss som användes i figuren visas var 7. Siffran har modifierats BARTHELMES et al. 28. 2) Mössen avlivades vid olika tidpunkter under sjukdomsförloppet, mjälte, inguinala lymfkörtlar, blod och ländryggen ryggmärgen extraherade och enskilda celler som isolerats från dessa vävnader. 3) immunceller distribution i olika vävnader, som bestäms genom flödescytometri. 4) mRNA uttryck för olika cytokiner i olika vävnader, som bestäms genom kvantitativ PCR. klicka här för att se en större version av denna figure.
Figur 2:. Immune Cell Distribution, Bestämd genom FACS (fluorescensaktiverad cellsortering) analys i mjälte, lymfkörtlar, Blodet och ryggmärg Prover från EAE-möss vid olika sjukdoms Stadier I det experiment som visas, antalet möss per grupp var 2 - 10. fördelningen av neutrofiler / monocyter i blod och neutrofiler / makrofager i ryggmärgen är anpassade och ändras från BARTHELMES et al 28.. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CD4 + T-cell och CD8
Figur 4: Gating strategi för flödescytometrisk analys av T-celler, B-celler, neutrofiler, monocyter, dendritiska celler och makrofager från ryggmärg från EAE möss på dag 12.) Ett diagram över SSC / CD45 från alla celler. Gate. CD45 + celler B) En tomt på FSC-H / FSC-W från CD45 + cellers. Gate: enskilda celler C) En tomt på SSC-A / FSC-A från enstaka celler.. Gate: viabla celler. D) En tomt på FSC-H / CD3 från levande celler. Gate: CD3 + och CD3 - celler E) Ett diagram av CD4 / CD8 från CD3 + celler.. Gate: CD4 + CD8 - (CD4 + T-celler) och CD4 - CD8 + (CD8 + T-celler) F) Ett diagram över CD19 och Ly6G / CD11b från CD3 - celler.. Gate: CD19 + CD11b - celler (B-celler), Ly6G + CD11b + celler (neutrofiler) och CD19 - Ly6G - celler G) En plot av CD11c / CD11b celler från CD19 - Ly6G - celler. Gate CD11c + celler (dendritiska celler ) och CD11c - celler H) en tomt på SSC / F4 / 80 fr.Om CD11c - celler. Gate: F4 / 80 - celler (monocyter) och F4 / 80 + celler (makrofager). En representativ kurva av 9 visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
D) ryggmärgen cytokinprofil (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i Prover från EAE-möss vid olika sjukdoms Stages A) lymfkörtel, B) mjälte, C) blod och:. Figur 5. mRNA expressionsnivåer normaliserades till peptidyl propyl isomeras A (PPIA) och beräknades med användning av mRNA-nivån av obehandlade möss av samma ålder. Mätningar gjordes i triplikat. Antalet möss per grupp var 2 - 3. Resultaten presenteras som medelvärden ± standard fel (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen | framåt | omvänd | fragement storlek (Bp) | ||||
| IL-1β | CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA | CCGACAGCACGAGGCTTT | 76 | ||||
| IL-6 | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | 76 | ||||
| IL-23 | GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC | GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA | 127 | ||||
| IFNy | CACGGCACAGTCATTGAAAGC | CACCATCCTTTTGCCAGTTCC | 118 | ||||
| TNFa | TGACAAGCCTGTAGCCCACG | GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC | 178 | ||||
| PPIA | GCTGGACCAAACACAAACGG | GCCATTCCTGGACCCAAAAC | 144 | ||||
Tabell 1: Primerpar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EAE modell som beskrivs här har fått mest uppmärksamhet som en modell av MS och används rutinmässigt testa terapeutiska strategier för MS 32. Musen sjukdom uppvisar många kliniska och histologiska funktioner i MS och orsakas av induktion av autoimmunitet mot neuronala antigener. Den sensibilisering mot myelinantigener är associerad med blodhjärnbarriären dysfunktion och därmed, immuncellinfiltration i CNS. Våra resultat visar att immunceller ökar transient i lymfkörtlarna i den akuta fasen. Mjält-T-celler och B-celler minskar i den prekliniska fasen av sjukdomen. I cirkulerande blod, T-celler, B-celler, dendritiska celler och monocyter öka transient i den prekliniska fasen, medan neutrofiler ökar sjukdomsberoende. Slutligen, i ryggmärgen, är en ökning av immunceller detekterbara (figur 2). Dessa data indikerar att T-celler och B-celler migrerar från mjälten, som verkaren reservoar för dessa celler, till lymfkörtlarna där de är aktiverade och föröka sig. Därefter migrerar de via cirkulationen in i ryggmärgen. Neutrofiler, monocyter och dendritiska celler, å andra sidan, migrerar från benmärgen genom omsättning i CNS.
Våra data visar att i ryggmärgen, är IFNy, TNFa och IL-1β regleras på ett sjukdomsberoende sätt, medan IL-6 är transient uppregleras vid uppkomsten av sjukdomen. Dessa data stöder hypotesen att EAE patologi drivs av Th1 och Th17 celler. Th1-celler släpper IFNy, som i sin tur aktiverar makrofager att frisätta TNFa och IL-1β 33. Dessutom är IL-6 känd för att driva differentiering av Th1 och Th17 celler och därmed främja utvecklingen av EAE 34.
Dagen för debut av kliniska symptom och svårighetsgraden av sjukdomen är variabel i EAE-möss. Baserat på vår erfarenhet, det finns flera rKÄLEN för detta. Möss som exponerats för stress under den prekliniska fasen visar en minskad svårighetsgrad av sjukdom och en fördröjning av sjukdomsdebut. Huset hos möss påverkar också svårighetsgraden av EAE, och också dagen för debut. Nyligen visade det sig att de kommensala floran hos möss påverka utvecklingen av EAE 35 och olika bostadssituationer kan påverka microbiome och därmed EAE patologi. Vidare är det mycket viktigt att alltid använda nyberedd pertussistoxin. Pertussistoxin skadar blodhjärnbarriären vilket är en förutsättning för utvecklingen av EAE. Använd inte emulgerade MOG 35-55 peptid efter utgångsdatum. Åldern på de möss påverkar också EAE patologi. Således finns det vissa regler som bör vara uppfyllda för att generera en reproducerbar EAE modell. Använd möss i åldrarna 10 och 13 veckor och möss från samma leverantör, om det är möjligt. Om möss beställs från en extern leverantör, låta mössen att acklimatisera för tvåveckor i stallet. Hantera mössen försiktigt innan EAE-induktion, så att de vänjer sig vid hantering. Undvika onödig hantering efter EAE-induktion. Tillhandahålla mössen med mat och vatten som de lätt kan nå så snart de visar kliniska symptom. Om mössen ska behandlas med ett läkemedel, är det bäst att blanda den in i maten eller dricksvattnet, för att undvika confounding spänningseffekter. Om sondmatning eller en injektion är viktigt för läkemedelsadministrering, är det viktigt att använda samma rutt för fordonet.
Förutom den primär progressiv EAE modell som beskrivs här, skovvis förlöpande EAE-modeller existerar också. De olika sjukdomsförlopp induceras genom administrering av olika antigener i olika musstammar. Således tillämpningen av MOG 35 - leder 55 i musstammar, såsom C57BL / 6, Sv129, B10, NOD och Biozzi möss, till en primär progressiv form sjukdom. Intressant nog skiljer sig den dag debut i de olika musstammar. medanC57BL / 6, SV129 och B10 möss utvecklar första kliniska symtom från cirka dag 11 till 12, Biozzi möss visar första kliniska symptom efter 21 dagar 36. I en tidigare studie visades att 129S4 / SvJae × C57BL / 6-hybrider första uppvisar kliniska symtom från cirka dag 11 28. Injektionen av proteolipidprotein (PLP) 131-151 leder i SJL möss induktion av en skovvis förlöpande sjukdomsförloppet 37. Det bästa EAE-modellen att använda beror på i fokus för forskningen. Således, om återfall fasen är av intresse, återfall förlöpande modell bör användas, medan om insjuknande är i fokus, bör progressiva modell användas. Om rollen av ett specifikt protein är att undersökas i EAE-modellen, med hjälp av knock-out-möss, är det viktigt att komma ihåg att inte alla stammar kan användas för att inducera EAE och eventuellt återkorsning av knock-out-stammen på en känsliga stammen är nödvändigt.
Den tre mest använda types av djurmodeller för MS är (1) autoantigen inducerad EAE; (2) viralt inducerade spontan, kronisk demyeliniserande sjukdom, och (3) toxininducerad demyelinisering 38. EAE-modeller kännetecknas av induktion av inflammation och autoimmuna responser genom applicering av en autoantigenic peptid, såsom myelin oligodendrocyt-protein eller proteolipidprotein 38. Spontan EAE utvecklas i transgena möss som överuttrycker en T-cellreceptor mot en peptid av myelin oligodendrocyt protein 39. För att inducera viralt inducerad kronisk inflammation, kan en neurotrofisk infektion i det centrala nervsystemet induceras, till exempel, med Theiler`s murint encefalomyelit-virus. Celler infekterade med viruset attackeras av både T-celler och ett humoralt svar och leder därmed till kronisk demyelinisering 40,41. Toxininducerad demyelinisering kan framkallas t ex med koppar kelator cuprizone 42. Denna modell leder specifikt till demyelination eftersom cuprizone angriper oligodendrocyter och leder därmed till aktivering av astroglia och mikroglia, medan inflammatoriska processer spelar en underordnad roll. Efter godkännande av toxinet, nya oligodendrocyter genereras och en ny myelin bildas. Användningen av dessa tre modeller, på ett kompletterande sätt, medger utvärdering av läkemedelseffekter på olika aspekter av patogenes av MS, eftersom modellerna skiljer sig med avseende på inflammatoriska och immun och demyeliniserande processer. I EAE och virusinducerade modell, inflammation och autoimmuna processer i första hand driva sjukdomen, medan i toxininducerad modell, demyeliniserande och remyelinating processer dominerar. För preklinisk testning av potentiella läkemedel för MS-behandling, åtminstone tre modeller, en toxin-inducerad modell, ett återfall förlöpande EAE och en primär progressiv EAE eller en viralt inducerad modell bör användas för att kontrollera effektiviteten av läkemedlet.
EAE-modellen beskrev hennee kan användas för att få ytterligare insikt i mekanismen för utvecklingen av MS-liknande sjukdomsprocessen, identifierar de viktigaste cellulära förare av sjukdomen, såsom Th1, Th17 och B-celler 43,44. Ju bättre förståelse av de inflammatoriska och immun processer är inblandade i utvecklingen av MS och de processer som främjar och lösa de skador, desto mer sannolikt är det att nya behandlingsstrategier kan utvecklas.
Ändå har EAE modell som beskrivs här endast vissa egenskaper gemensamt med MS, och har några tydliga skillnader från den mänskliga sjukdomen. Den mest framträdande skillnaden är att MS-patienter varierar kraftigt i sjukdomspresentation, som inte återges i EAE-modellen. Detta kan bero på olika lesionsmönster i MS-patienter och EAE-möss och till det faktum att möss är inavlade stammar. I EAE-möss, homogena skador är mest framträdande i ryggmärgen, medan i MS-patienter, främst heterogena lesioner äri hjärnan 45,46. Dessutom MS och EAE dela ett avgörande sätt bidrar Th1-celler och Th17 celler för deras utveckling, men till skillnad från MS, CD8 + T-celler spelar en underordnad roll i EAE patologi 33. Sammanfattningsvis fokuserar EAE-modellen i huvudsak på de kombinerade effekterna av autoimmunitet, inflammatoriska processer och neurodegeneration medan demyeliniserande processer är mindre mottagliga för selektiv bedömning. Därför kan andra djurmodeller såsom den cuprizone modellen användas för den distinkta studier av demyeliniserande processer 47. EAE-modellen är ofullständig, men ändå en användbar modell för MS 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
| Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
| Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
References
- McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
- Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
- Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
- Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
- Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
- Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
- Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
- Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
- Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
- Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
- Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
- Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
- Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
- Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
- Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
- Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
- Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
- Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
- Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
- Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
- Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
- Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
- Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
- Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
- Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
- Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
- 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
- Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
- Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
- Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
- Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
- Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
- Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
- El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
- Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
- Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).
