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Abstract
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Immunology and Infection

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Published: May 08, 2016
doi:
10.3791/53933
, , , , , ,
1Institute of Clinical Pharmacology,Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology,Fraunhofer IME

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

La sclerosi multipla si presume essere una malattia autoimmune infiammatoria, che è caratterizzato dalla formazione di lesione al sistema nervoso centrale (CNS) con conseguente deterioramento cognitivo e motorio. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di SM utile, perché è anche caratterizzata dalla formazione della lesione del sistema nervoso centrale, disabilità motoria ed è guidato anche da reazioni autoimmunitarie e infiammatorie. Uno dei modelli EAE viene indotta con un peptide derivato dalla proteina mielina oligodendrociti (MOG) 35-55 nei topi. I topi EAE sviluppare un corso di malattia progressiva. Il corso è suddiviso in tre fasi: la fase preclinica (giorno 0 – 9), l'insorgenza della malattia (giorno 10 – 11) e la fase acuta (giorno 12 – 14). MS e EAE sono indotti da cellule T autoreattivi che si infiltrano il sistema nervoso centrale. Queste cellule T secernono chemochine e citochine che portano al reclutamento di ulteriori cellule immunitarie. Pertanto, la distribuzione di cellule immunitarie nel midollo spinale durante le tre fasi della malattia è stata studiata. Per evidenziare il punto di tempo della malattia in cui inizia l'attivazione / la proliferazione / accumulo di cellule T, cellule B e monociti, la distribuzione delle cellule immunitarie nei linfonodi, la milza e il sangue è stato anche valutato. Inoltre, i livelli di diverse citochine (IL-1b, IL-6, IL-23, TNFa, IFNγ) nelle tre fasi di malattia sono stati determinati, al fine di conoscere i processi infiammatori della malattia. In conclusione, i dati forniscono una panoramica del profilo funzionale delle cellule immunitarie durante EAE patologia.

Introduction

La sclerosi multipla (MS) e il corrispondente modello animale, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), mostrano variazioni neuroinfiammazione autoimmuni del sistema nervoso centrale (CNS). All'inizio lesioni della SM e EAE attivi sono caratterizzati dalla presenza di cellule immunitarie infiltrate. L'eziologia della SM rimane sconosciuta, ma è ampiamente considerato di coinvolgere la distruzione della mielina mediata dalle cellule T autoreattivi. Queste cellule T autoreattive secernono citochine pro-infiammatorie e chemochine che attraggono altre cellule del sistema immunitario come le cellule B, monociti e neutrofili dalla circolazione. I monociti differenziano in macrofagi. L'interferone gamma (IFNγ) secreto da cellule T autoreattive polarizza i macrofagi in macrofagi pro-infiammatorie. Le citochine macrofagi rilascio pro-infiammatorie e specie reattive dell'ossigeno che promuovono l'apoptosi in oligodendrociti. La morte degli oligodendrociti porta a demielinizzazione. Inoltre, le cellule B si differenziano in pcellule LASMA e autoanticorpi rilascio contro la guaina mielinica, che si traduce nella degradazione della mielina. La perdita di mielina porta alla degradazione degli assoni e neuroni e quindi alla formazione di siti di lesione del SNC che rappresentano la caratteristica principale del MS 1. In periferia, cellule T e cellule B sono attivati ​​nei linfonodi, proliferano nella milza e migrano attraverso la circolazione nel sistema nervoso centrale. I monociti e neutrofili proliferano nel midollo osseo e migrano anche attraverso la circolazione nel sistema nervoso centrale.

Leucociti stravaso da midollo osseo, milza e nei linfonodi nel sangue o dal flusso sanguigno nel SNC è un processo multifasico che dipende da diversi fattori, comprese le interazioni molecolari tra leucociti e endotelio mediata da chemochine e recettori per chemochine. La produzione di chemochine da vari tipi di cellule può essere indotta durante la reactio immunitarion dalle citochine come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF), IFNγ e interleuchina-6 (IL-6), che recluta successivamente le cellule immunitarie al sito di infiammazione 2,3. Le cellule immunitarie presentano un sottoinsieme di recettori per chemochine sulla loro superficie, a seconda del tipo di cellula e percorso migrazione al sito infiammatorio. Così, CXCR2, CCR1 e CXCR1 sono espressi su neutrofili maturi nel midollo osseo e sangue 4, e vincolante dei suoi ligandi, CXCL2, CCL5 o CXCL6 rispettivamente, attiva neutrofili e promuove la loro adesione all'endotelio e successivamente, la migrazione delle cellule nei tessuti 5-9. CCL2 e CCL20 attirare monociti e cellule Th1 / Th17 10, che esprimono CCR2 11 e CCR6 12, rispettivamente. CCR1 e CCR5, espressa da diversi tipi di cellule, comprese le cellule T, monociti e macrofagi 13, legare CCL3, CCL5 e CCL7 e sono upregulated durante MS 14. CXCR3 è espresso sulle cellule T e lega CCL9, CCL10 eCCL11 15.

Una strategia principale nel trattamento SM è la deplezione di cellule immunitarie o la prevenzione di infiltrazione di cellule immunitarie nel SNC. Pertanto, il blocco dei recettori per chemochine specifiche è stato studiato in EAE. Antagonismo o delezione genetica di CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 o 19 CXCR2 riduce EAE patologia, mentre l'antagonismo o delezione genetica di CCR1 20, CCR5 20 o CXCR3 21 non hanno ridotto la patologia. Quindi, l'espressione di recettori per chemochine specifiche sui leucociti è cruciale per l'infiltrazione di quest'ultimo nel sistema nervoso centrale e detta corso di EAE.

La deplezione di cellule immunitarie è una strategia di trattamento efficace per i pazienti SM, perché le cellule immunitarie infiltrate rilasciano citochine, quali TNF, IL-6 e IL-1β, che, a sua volta, promuovere il processo infiammatorio o la degradazione dei neuroni 22. Inoltre, auto-cellule Th1 reattive rilasciano IFNγ, che a sua volta stimola i macrofagi a rilasciare TNFa, IL-1β e IL-23.

Questo manoscritto descrive l'induzione di EAE, la determinazione della distribuzione delle cellule immunitarie ei livelli di citochine (mRNA) in vari tessuti in topi EAE. Le cellule sono state isolate in diversi momenti durante il corso della malattia per fornire una panoramica tempo-dipendente dei processi infiammatori che alla fine portano alla formazione di lesioni nel SNC.

Protocol

ETICA DICHIARAZIONE: Le nostre procedure sperimentali sono approvati dal Comitato Etico del Regierungspräsidium Darmstadt (Germania) e confermare le normative nazionali ed europee. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e ridurre il numero di animali utilizzati. 1. EAE Modello Induzione del modello EAE Utilizzare 10- a 13 settimane di età femminile 129S4 / SvJae × C57BL / 6 topi per l'induzione di EAE. Dare i t…

Representative Results

La figura 1 fornisce una panoramica schematica dei diversi metodi descritti in questo articolo. 1) Topi riceve un'iniezione di MOG 35-55 antigene e sviluppare sintomi clinici iniziali dopo 10,7 ± 0,3 giorni 28. Un corso rappresentante della malattia di topi EAE è mostrato in Figura 1. 2) vari tessuti (milza, linfonodi, midollo spinale lombare) e il sangue sono estratti da topi di controllo e E…

Discussion

Il modello di EAE qui descritto ha ricevuto la massima attenzione come modello di SM ed è abitualmente utilizzato in fase di test strategie terapeutiche per la SM 32. La malattia del mouse presenta molte caratteristiche cliniche e istologiche della SM ed è causata dall'induzione di autoimmunità agli antigeni neuronali. La sensibilizzazione agli antigeni della mielina è associata con il cervello di sangue barriera erettile e in tal modo, l'infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso ce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit
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References

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Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).
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