Abstract
La sclerosi multipla si presume essere una malattia autoimmune infiammatoria, che è caratterizzato dalla formazione di lesione al sistema nervoso centrale (CNS) con conseguente deterioramento cognitivo e motorio. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di SM utile, perché è anche caratterizzata dalla formazione della lesione del sistema nervoso centrale, disabilità motoria ed è guidato anche da reazioni autoimmunitarie e infiammatorie. Uno dei modelli EAE viene indotta con un peptide derivato dalla proteina mielina oligodendrociti (MOG) 35-55 nei topi. I topi EAE sviluppare un corso di malattia progressiva. Il corso è suddiviso in tre fasi: la fase preclinica (giorno 0 - 9), l'insorgenza della malattia (giorno 10 - 11) e la fase acuta (giorno 12 - 14). MS e EAE sono indotti da cellule T autoreattivi che si infiltrano il sistema nervoso centrale. Queste cellule T secernono chemochine e citochine che portano al reclutamento di ulteriori cellule immunitarie. Pertanto, la distribuzione di cellule immunitarie nel midollo spinale durante le tre fasi della malattia è stata studiata. Per evidenziare il punto di tempo della malattia in cui inizia l'attivazione / la proliferazione / accumulo di cellule T, cellule B e monociti, la distribuzione delle cellule immunitarie nei linfonodi, la milza e il sangue è stato anche valutato. Inoltre, i livelli di diverse citochine (IL-1b, IL-6, IL-23, TNFa, IFNγ) nelle tre fasi di malattia sono stati determinati, al fine di conoscere i processi infiammatori della malattia. In conclusione, i dati forniscono una panoramica del profilo funzionale delle cellule immunitarie durante EAE patologia.
Introduction
La sclerosi multipla (MS) e il corrispondente modello animale, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), mostrano variazioni neuroinfiammazione autoimmuni del sistema nervoso centrale (CNS). All'inizio lesioni della SM e EAE attivi sono caratterizzati dalla presenza di cellule immunitarie infiltrate. L'eziologia della SM rimane sconosciuta, ma è ampiamente considerato di coinvolgere la distruzione della mielina mediata dalle cellule T autoreattivi. Queste cellule T autoreattive secernono citochine pro-infiammatorie e chemochine che attraggono altre cellule del sistema immunitario come le cellule B, monociti e neutrofili dalla circolazione. I monociti differenziano in macrofagi. L'interferone gamma (IFNγ) secreto da cellule T autoreattive polarizza i macrofagi in macrofagi pro-infiammatorie. Le citochine macrofagi rilascio pro-infiammatorie e specie reattive dell'ossigeno che promuovono l'apoptosi in oligodendrociti. La morte degli oligodendrociti porta a demielinizzazione. Inoltre, le cellule B si differenziano in pcellule LASMA e autoanticorpi rilascio contro la guaina mielinica, che si traduce nella degradazione della mielina. La perdita di mielina porta alla degradazione degli assoni e neuroni e quindi alla formazione di siti di lesione del SNC che rappresentano la caratteristica principale del MS 1. In periferia, cellule T e cellule B sono attivati nei linfonodi, proliferano nella milza e migrano attraverso la circolazione nel sistema nervoso centrale. I monociti e neutrofili proliferano nel midollo osseo e migrano anche attraverso la circolazione nel sistema nervoso centrale.
Leucociti stravaso da midollo osseo, milza e nei linfonodi nel sangue o dal flusso sanguigno nel SNC è un processo multifasico che dipende da diversi fattori, comprese le interazioni molecolari tra leucociti e endotelio mediata da chemochine e recettori per chemochine. La produzione di chemochine da vari tipi di cellule può essere indotta durante la reactio immunitarion dalle citochine come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF), IFNγ e interleuchina-6 (IL-6), che recluta successivamente le cellule immunitarie al sito di infiammazione 2,3. Le cellule immunitarie presentano un sottoinsieme di recettori per chemochine sulla loro superficie, a seconda del tipo di cellula e percorso migrazione al sito infiammatorio. Così, CXCR2, CCR1 e CXCR1 sono espressi su neutrofili maturi nel midollo osseo e sangue 4, e vincolante dei suoi ligandi, CXCL2, CCL5 o CXCL6 rispettivamente, attiva neutrofili e promuove la loro adesione all'endotelio e successivamente, la migrazione delle cellule nei tessuti 5-9. CCL2 e CCL20 attirare monociti e cellule Th1 / Th17 10, che esprimono CCR2 11 e CCR6 12, rispettivamente. CCR1 e CCR5, espressa da diversi tipi di cellule, comprese le cellule T, monociti e macrofagi 13, legare CCL3, CCL5 e CCL7 e sono upregulated durante MS 14. CXCR3 è espresso sulle cellule T e lega CCL9, CCL10 eCCL11 15.
Una strategia principale nel trattamento SM è la deplezione di cellule immunitarie o la prevenzione di infiltrazione di cellule immunitarie nel SNC. Pertanto, il blocco dei recettori per chemochine specifiche è stato studiato in EAE. Antagonismo o delezione genetica di CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 o 19 CXCR2 riduce EAE patologia, mentre l'antagonismo o delezione genetica di CCR1 20, CCR5 20 o CXCR3 21 non hanno ridotto la patologia. Quindi, l'espressione di recettori per chemochine specifiche sui leucociti è cruciale per l'infiltrazione di quest'ultimo nel sistema nervoso centrale e detta corso di EAE.
La deplezione di cellule immunitarie è una strategia di trattamento efficace per i pazienti SM, perché le cellule immunitarie infiltrate rilasciano citochine, quali TNF, IL-6 e IL-1β, che, a sua volta, promuovere il processo infiammatorio o la degradazione dei neuroni 22. Inoltre, auto-cellule Th1 reattive rilasciano IFNγ, che a sua volta stimola i macrofagi a rilasciare TNFa, IL-1β e IL-23.
Questo manoscritto descrive l'induzione di EAE, la determinazione della distribuzione delle cellule immunitarie ei livelli di citochine (mRNA) in vari tessuti in topi EAE. Le cellule sono state isolate in diversi momenti durante il corso della malattia per fornire una panoramica tempo-dipendente dei processi infiammatori che alla fine portano alla formazione di lesioni nel SNC.
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Protocol
ETICA DICHIARAZIONE: Le nostre procedure sperimentali sono approvati dal Comitato Etico del Regierungspräsidium Darmstadt (Germania) e confermare le normative nazionali ed europee. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e ridurre il numero di animali utilizzati.
1. EAE Modello
- Induzione del modello EAE
- Utilizzare 10- a 13 settimane di età femminile 129S4 / SvJae × C57BL / 6 topi per l'induzione di EAE.
- Dare i topi una iniezione sottocutanea, nella parte superiore e inferiore della schiena, del encefalitogenico MOG 35 - peptide 55 (mielina oligodendrociti glicoproteina) (200 mg), emulsionato in 200 ml completa adiuvante Freund`s (CFA) contenente 400 mg Mycobacterium tuberculosis.
Nota: Come un negativo, il controllo sham non-malattia inducono, adiuvante incompleto di Freund contenente Mycobacterium tuberculosis, nello stesso volume e per la stessa via, può essere utilizzato. - therEDopo, e ancora 24 ore dopo, invia i topi un'iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse (in totale 0,2 mg, diluito in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato, PBS). Utilizzare topi non trattati come gruppo di controllo, per poter confrontare malata con animali sani.
Nota: È anche possibile indurre EAE da 200 - 300 mg MOG 35 - 55 peptide 300 - 500 mg di Mycobacterium tuberculosis in CFA e 0.2 - 0.3 mg tossina della pertosse in un volume di 0,1 - 0,2 ml per iniezione. - Inizio una settimana dopo l'iniezione, esaminare i topi al giorno per sintomi clinici (vedere il punto 1.2.1)
Nota: Il giorno di esordio della malattia varia nelle diverse esperienze, ma alle condizioni nel nostro laboratorio, questo è di circa 11 giorni e, quindi, qui il giorno 14 è definito come 3 giorni dopo l'insorgenza della malattia. Tutti i topi in questo studio hanno sviluppato sintomi clinici.
- Punteggio dei topi
- Classificare i sintomi clinici di punteggi clinici come segue:0) che nessun indizio, 0.5) la paralisi distale della coda, 1) paralisi completa della coda, 1.5) coda molle e lieve debolezza degli arti posteriori, 2) di coda molle e grave debolezza delle zampe posteriori, 2.5) coda zoppicare e paralisi di una zampa posteriore, 3) la coda zoppicare e paralisi di entrambe le zampe posteriori, 3.5) la paralisi di entrambi gli arti posteriori e la debolezza di un arto anteriore (topi che hanno raggiunto questo punteggio sono stati eutanasia, in sintonia con le linee guida etiche locali).
2. Preparazione di singole cellule per l'analisi Citometria a Flusso
Nota: La miscela di anticorpi è composto da 1 ml CD45-Vioblue, 2 ml CD8-eFluor650, 0,5 ml CD11b-eFluor605, 0,5 ml F4 / 80-PE-Cy7, 1 ml CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0.5 ml CD11c -AlexaFluor700, 1 ml CD19-APC-H7 e 1 ml Ly6G-APC-Cy7.
Nota: Se si prende il sangue, linfonodi, milza e il midollo spinale allora la procedura è la seguente: I topi sono profondamente anestetizzati con una combinazione di isoflUrane (2% in carbogeno al minuto) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo). Successivo aprire il torace, rimuovere il sangue con un bastone intracardial e profumato topi intracardiaca con PBS freddo. Quindi rimuovere i linfonodi seguita da milza e, infine, il midollo spinale. Se non c'è bisogno di perfusione topi intracardiaca poi eutanasia i topi sotto anestesia profonda per la lussazione del collo.
- Isolamento di splenociti
- Anestetizzare topi con una combinazione di isoflurano (2% in carbogeno al minuto) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo).
- zona di incisione bagnato con 80% di isopropanolo per evitare qualsiasi contaminazione con peli e aprire il torace longitudinale, senza puntura tessuti più profondi, con le forbici.
- Profumato topi intracardiaca con PBS freddo pH 7,0 23.
Nota: La milza si trova nella sinistra quadrante addominale superiore sotto la gabbia toracica. Se solo la milza è da studiare, tale organo può essere rimosso prima di perfusione per retain tutti i tipi di cellule di interesse. - Rimuovere la milza e tagliare circa 1/8 e si pesa. Conservare il campione in PBS in ghiaccio.
- Comprimere il tessuto della milza attraverso un setaccio con maglie di 70 micron (posto sopra un tubo da 50 ml), con lo stantuffo di una siringa 2 ml.
- Lavare la rete con 5 ml di PBS. Centrifugare a 1.800 xg per 3 min. Risospendere il pellet in 500 ml Soluzione di Lisi.
Nota: A questo punto, può essere necessario effettuare un conteggio cella differenziale se, successivamente, un metodo di analisi FACS alternativa viene utilizzata che non utilizza perline (vedi punto 3). - Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) e aggiungere 500 microlitri di PBS. Centrifugare per 6 minuti a 650 xg a temperatura ambiente (RT).
- Ripetere la fase di lavaggio con 500 microlitri di PBS. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 ml 0,2% di albumina sierica bovina (BSA) / PBS, aggiungere 2 ml Fc recettore-1 (FcRI) tampone bloccante e incubare per 15 min a RT al buio.
- Aggiungere 13 ml unmiscela tibody, incubare 15 minuti a temperatura ambiente al buio, aggiungere 500 microlitri di PBS e centrifugare per 6 minuti a 650 xg a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante.
Nota: procedura di colorazione del produttore consiglia un lavaggio singolo, ma ulteriore riduzione della colorazione di fondo può essere ottenuto opzionalmente ripetere la fase di lavaggio di una o due volte. - Risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri PBS (o, eventualmente, tampone di corsa per la separazione delle proteine, per ridurre potenzialmente aggregazione delle cellule) e trasferire alla citometria a flusso tubo. Mantenere le cellule in ghiaccio.
- L'isolamento di cellule dei linfonodi
- Anestetizzare topi con una combinazione di isoflurano (2% in carbogeno al minuto) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo).
- zona di incisione bagnato con 80% di isopropanolo e aprire il torace longitudinalmente con le forbici. Profumato topi intracardiaca con PBS freddo pH 7,0 23.
- Per isolare il linfonodo inguinale rimuovere con attenzione la pelle nella regione del hip e scegliere il linfonodo con attenzione fuori dal tessuto adiposo con una pinza. Pesare il linfonodo inguinale e conservare il campione in PBS in ghiaccio.
Nota: Abbiamo usato linfonodi inguinali nei nostri studi, perché O`Connor et al. hanno scoperto che un numero elevato di monociti attivati, macrofagi, neutrofili e linfociti T erano tutti presenti nei linfonodi inguinali dopo EAE induzione 24. - Premere il linfonodo attraverso un setaccio di 70 micron (posto sopra un tubo da 50 ml) utilizzando lo stantuffo di una siringa 2 ml.
- Lavare la rete con 5 ml di PBS. Centrifugare a 2.400 g per 8 minuti. Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri 0,2% BSA / PBS, aggiungere 2 microlitri FcRI tampone bloccante e incubare per 15 min a RT al buio.
- Aggiungere 13 microlitri miscela di anticorpi, incubare 15 min a RT al buio, aggiungere 500 microlitri di PBS e centrifugare per 6 minuti a 650 xga RT.
- Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 300 l di PBS (o di un buffer di esecuzione adatto) e trasferirload un tubo citometria di flusso.
- Isolamento di cellule del sangue
- Aggiungere 50 ml di 20 mM HEPES a 50 microlitri di sangue (stabilizzato con EDTA) e aggiungere 500 microlitri Soluzione di Lisi. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e aggiungere 500 microlitri di PBS. Centrifugare per 6 minuti a 650 xg a temperatura ambiente. Gettare il surnatante e ripetere la fase di lavaggio.
- Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri 0,2% BSA / PBS, aggiungere 2 microlitri FcRI tampone bloccante e incubare per 15 min a RT al buio.
- Aggiungere 13 microlitri miscela di anticorpi, incubare 15 min a RT al buio, aggiungere 500 microlitri di PBS e centrifugare per 6 minuti a 650 xga RT. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 300 ml di PBS e trasferirlo alla citometria a flusso tubo.
- L'isolamento di cellule del midollo spinale
- Anestetizzare topi con una combinazione di isoflurano (2% in carbogeno al minuto) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo).
- zona di incisione bagnato con 80% di isopropanolo e aprire il torace longitudinalmentecon le forbici. Profumato topi intracardiaca con PBS freddo pH 7,0 23.
- Bagnare l'area di incisione sulla schiena e rendere nuovamente un taglio longitudinale con un bisturi e rimuovere la pelle.
- Tagliare la parte lombare della colonna vertebrale (che innerva gli arti posteriori) e lavare con una siringa PBS-riempita per estrarre il midollo spinale. Tagliare circa 1/3 del cavo lombare valutare questo e conservare il campione in PBS in ghiaccio.
- Centrifugare a 250 xg per 2 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 microlitri soluzione di distacco delle cellule e HBSS (1: 1). Aggiungere 3 mg / ml di collagenasi A e 1 unità / ml DNasi I, decollate le cellule ripetuta su e giù pipettaggio e incubare per 30 minuti con agitazione a 37 ° C a 400 rpm.
Nota: Se preferito, la sospensione cellulare può essere cancellato di contaminare mielina e detriti cellulari dal gradiente di densità centrifugazione che possono migliorare la sensibilità della citometria a flusso misura, quindi, riducendo bassa autofluorescenza und il numero di eventi che devono essere acquisiti (vedi paragrafo 3.5). - Centrifugare a 250 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 1 ml 10% di vitello siero fetale (FCS) / medio Dulbecco minimo essenziale (DMEM) e decollate le cellule nuovamente ripetuto su e giù pipettaggio.
- Centrifugare a 250 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Ripetere la fase di lavaggio.
- Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS e spremere il midollo spinale attraverso un setaccio con maglie di 70 micron (posto sopra un tubo da 50 ml) utilizzando lo stantuffo di una siringa 2 ml.
- Lavare la maglia con 4 ml di PBS. Centrifugare a 1.800 xg per 3 min a RT. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 ml 0,2% BSA / PBS, aggiungere 2 ml di reagente FcRI blocco e incubare per 15 min a RT al buio.
- Aggiungere 13 microlitri miscela di anticorpi, incubare 15 min a RT al buio, aggiungere 500 microlitri di PBS e centrifugare per 6 minuti a 650 xga RT.
- Eliminare il surnatante, risospendere il pelle delle cellulet in 500 microlitri di PBS (o un tampone di corsa adatto) e trasferirlo al flusso citometria tubo.
3. analisi di citometria di flusso
- Titolare tutti gli anticorpi in anticipo per determinare le concentrazioni ottimali come descritto da Olesch et al. 25.
- Utilizzare sfere di compensazione anticorpi di cattura per la compensazione singolo colore per creare matrici di compensazione multi-colore in base alle istruzioni del fornitore.
- Controllare la calibrazione dello strumento quotidiano utilizzando perline specifici secondo le istruzioni del fornitore.
- Direttamente prima della citometria a flusso di misura, aggiungere 30 ml di citometria di flusso conta assoluta standard per le celle (per l'isolamento vedere la sezione 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) per determinare conta assoluta delle cellule. Invece di utilizzare il conteggio sfere le cellule possono essere contate.
- Raccogliere campioni (cellule di milza, linfonodi e sangue: 100.000 eventi, midollo spinale: 500.000 eventi) in un citofluorimetro unND analizzare utilizzando un software specifico citometria a flusso.
- Aprire il software citometria a flusso e aggiungere FCS file 3.0 premendo il pulsante "aggiungi campioni".
- Aprire il file aggiunto con un doppio clic. Regolare i canali per gli assi X e Y. Per selezionare le popolazioni cellulari di interesse creano un cancello (vedi Figura 4).
4. Analisi quantitativa PCR
- Isolamento di mRNA e trascrizione in cDNA
- Estrarre il mRNA dal midollo spinale lombare (1/3), la milza (1/8) e linfonodi inguinali da fenolo-cloroformio e precipitato con etanolo 26.
- Per questo, omogeneizzare il tessuto in 1 ml guanidinio miscela tiocianato-fenolo, incubare per 10 min. Aggiungere 200 ml di cloroformio e incubare ancora per 10 min.
- Dopo una fase di centrifugazione (18.000 xg per 15 min a 4 ° C), lavare la fase acquosa superiore è di 500 microlitri isopropanolo e centrifugare (18.000 xg per 8 minuti a 4° C).
- Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo e, dopo una fase di centrifugazione (18.000 xg per 5 minuti a 4 ° C), asciugare il pellet nel concentratore a vuoto (5 min a 30 ° C). Successivamente, risospendere il pellet in 30 microlitri di acqua.
- Per estrarre l'mRNA dal sangue, centrifuga 500 microlitri di sangue EDTA-stabilizzato (300 xg 10 min 4 ° C).
- Prendere il buffy coat, contenente cellule bianche del sangue, e diluire in 1 ml di soluzione di lisi (150 mm NH 4 Cl, 100 mM NaHCO 3, 0.1 mM Na-EDTA pH 7.4).
- Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare le cellule a 650 xg per 6 minuti e poi lavare due volte con PBS.
- Estrarre il mRNA da globuli bianchi (WBC) utilizzando un kit per l'estrazione di RNA in base alle istruzioni del produttore.
- Eseguire la sintesi del DNA utilizzando un kit per la sintesi del DNA compreso esameri casuali in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare 200 ng mRNA per il CDNUna sintesi.
- Estrarre il mRNA dal midollo spinale lombare (1/3), la milza (1/8) e linfonodi inguinali da fenolo-cloroformio e precipitato con etanolo 26.
- PCR quantitativa
- Per quantificare la quantità di un mRNA specifico, utilizzare 1 ml di cDNA, 1 micron di primer avanti / indietro e un DNA colorante fluorescente vincolante secondo le istruzioni del produttore 27. Vedere la Tabella 1 per le sequenze per le coppie di primer. Misurare CT-valori di IL-1β, IL-6, IL-23, IFNγ, TNF e PPIA (peptidyl prolil isomerasi) utilizzando un sistema di PCR quantitativa.
- Per determinare l'espressione di mRNA relativa utilizzare il metodo comparativo 27 CT (soglia ciclo).
- Per questo, normalizzare CT-valori dei geni bersaglio ai livelli di espressione di PPIA sottraendo il CT-valore medio PPIA dal gene bersaglio, come descritto in studi precedenti (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Successivamente, calcolare i cosiddetti ΔΔCT valori, con il quale, a normalizzare i ΔCT valoridei geni bersaglio da topi EAE al livello di espressione dei geni bersaglio di topi non trattati, sempre sottraendo il ΔCT valore medio nei topi non trattati dal ΔCT valore in topi EAE.
- Per ottenere l'espressione mRNA relativa del gene bersaglio, calcolare il rapporto utilizzando la seguente formula: 2 - ΔΔct.
- Testare la specificità di ciascun primer. Determinare la dimensione del frammento amplificato utilizzando un gel di agarosio al 2% 31. La dimensione del frammento è mostrato nella tabella 1.
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Representative Results
La figura 1 fornisce una panoramica schematica dei diversi metodi descritti in questo articolo. 1) Topi riceve un'iniezione di MOG 35-55 antigene e sviluppare sintomi clinici iniziali dopo 10,7 ± 0,3 giorni 28. Un corso rappresentante della malattia di topi EAE è mostrato in Figura 1. 2) vari tessuti (milza, linfonodi, midollo spinale lombare) e il sangue sono estratti da topi di controllo e EAE in diversi momenti durante la fase preclinica (giorno 2, giorno 4 , giorno 6), durante l'insorgenza della malattia (giorno 10) e durante la fase acuta della malattia (giorno 12, giorno 14). 3) il profilo di espressione di mRNA di citochine, che regolano lo sviluppo EAE, è determinata in vari tessuti estratti a tempi diversi durante il corso della malattia, mediante PCR quantitativa. 4) singole cellule sono isolate da vari tessuti estrattiin diversi momenti durante il decorso della malattia e la distribuzione delle cellule immunitarie determinato utilizzando citometria a flusso.
In milza e nei linfonodi, cellule T e B sono osservati come tipo di cella più prominente. In contrasto con linfonodi, nella milza, inoltre, un elevato numero di monociti e neutrofili sono presenti. Tutte le cellule immunitarie mostrano un aumento transitorio linfonodi durante la fase acuta, mentre solo macrofagi, cellule B, cellule T e neutrofili aumento nella milza. Nel sangue, tutte le cellule immunitarie aumentano transitoriamente durante la fase preclinica. Nel midollo spinale lombare, un aumento di malattie-dipendente in tutte le cellule immunitarie si osserva, a parte monociti, che presumibilmente differenziano per macrofagi dopo il loro ingresso nel midollo spinale (Figura 2). Le cellule CD4 + e CD8 + mostrano cambiamenti paragonabili a milza, linfonodi e sangue durante i diversi corsi di malattia. amcellule Ong infiltranti il midollo spinale, l'aumento delle cellule T CD4 + è stato più pronunciato (Figura 3). In figura 4, è mostrato il gating-strategia per il dosaggio delle varie popolazioni cellulari. Nel dettaglio, le popolazioni di cellule descritte in questo manoscritto sono stati identificati come segue: monociti (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c-, CD11b +), macrofagi (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD11c-, CD11b +, F4 / 80hi), neutrofili (CD45hi, CD3-, CD11b +, Ly6G +), le cellule dendritiche (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c +), cellule B (CD45hi, CD3-, CD19 +), le cellule T (CD45hi, CD3 +) , le cellule T CD4 + (CD45hi, CD3 +, CD4 +) e cellule T CD8 + (CD45hi, CD3 +, CD8 +). I numeri di cellule sono correlati alla quantità di tessuto (peso della milza, linfonodi, midollo spinale lombare) o il volume di sangue, riflettendo la conta delle cellule assoluta. È, tuttavia, possibile esprimere i tipi cellulari come percentuali di cellule totali misurate.
in LYMnodi ph, l'espressione di IL-23 mRNA viene transitoriamente aumentata durante la fase preclinica, mentre l'espressione di IL-6 mRNA è aumentata in modo malattia dipendente. In milza, IL-6 e IL-23 mRNA aumenta transitoriamente nella fase preclinica, mentre al momento della comparsa della malattia, espressione di mRNA di IL-1β è sollevata. Nel sangue, l'espressione di TNFa mRNA è aumentata in modo malattia dipendente. In midollo spinale lombare, TNF, IL-1β e aumento IFNγ durante la fase acuta, che IL-6 è upregulated durante la fase di insorgenza (Figura 5).
Figura 1: Schema del flusso di lavoro per l'induzione e la valutazione immunologica della EAE. 1) EAE è indotta in topi che portano allo sviluppo dei sintomi clinici. I sintomi clinici sono classificati da punteggi clinici, come segue: 0) che nessun indizio, 0.5) la paralisi distale della coda, 1) paralisi completa della coda, 1.5) coda molle e lieve debolezza degli arti posteriori, 2) di coda molle e grave debolezza delle zampe posteriori , 2.5) la coda zoppicare e paralisi di una gamba posteriore, 3) la coda zoppicare e paralisi di entrambe le zampe posteriori. Il numero di topi utilizzati per la figura mostrata era 7. La cifra è stata modificata da Barthelmes et al. 28. 2) I topi vengono sacrificati in diversi momenti durante il corso della malattia, milza, linfonodi inguinali, sangue e midollo spinale lombare cellule estratte e singoli isolati da questi tessuti. 3) la distribuzione delle cellule immunitaria in vari tessuti, come determinato mediante citometria di flusso. 4) espressione di mRNA per varie citochine nei diversi tessuti, come determinato mediante PCR quantitativa. cliccate qui per vedere una versione più grande di questo fIGURA.
Figura 2:. Immunitario Distribuzione delle celle, Determinato da FACS (Fluorescence-Activated di separazione delle cellule) Analisi in Milza, linfonodi, sangue e midollo spinale I campioni di EAE topi a diversi stadi della malattia Nell'esperimento mostrato, il numero di topi per gruppo era 2 - 10. la distribuzione dei neutrofili / monociti nel sangue e neutrofili / macrofagi nel midollo spinale sono adattate e modificate da Barthelmes et al 28.. si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cellule T CD4 + e CD8
Figura 4: strategia di gating per citometria a flusso Analisi delle cellule T, cellule B, neutrofili, monociti, cellule dendritiche e macrofagi dal midollo spinale di topi EAE il giorno 12. A) Un appezzamento di SSC / CD45 da tutte le cellule. Gate:. CD45 + cellule B) Un appezzamento di FSC-H / FSC-W da cellule CD45 +S. Gate: singole cellule C) Un appezzamento di SSC-A / FSC-A da singole cellule.. Gate: cellule vitali. D) Un appezzamento di FSC-H / CD3 da cellule vitali. Porta: CD3 + e CD3 - cellule E) Un appezzamento di CD4 / CD8 dalle cellule CD3 +.. Gate: CD4 + CD8 - (cellule T CD4 +) e CD4 - CD8 + (cellule T CD8 +) F) Una trama di CD19 e Ly6G / CD11b da CD3 - cellule.. Gate: CD19 + CD11b - cellule (cellule B), Ly6G + CD11b + cellule (neutrofili) e CD19 - Ly6G - cellule G) un terreno di cellule CD11c / CD11b da CD19 - Ly6G - celle:. CD11c cellule Porta + (cellule dendritiche ) e CD11c - cellule H) un terreno di SSC / F4 / 80 fr.om CD11c - cellule. Gate: F4 / 80 - cellule (monociti) e 80 cellule (macrofagi) F4 / +. Un plot rappresentante 9 è indicata. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Citochine Profilo (IL-1β, IL-6, IL-23, TNF, IFNγ) nei campioni di EAE topi a diversi stadi della malattia A) linfonodo, B) la milza, C) nel sangue e D) del midollo spinale. i livelli di espressione di mRNA sono stati normalizzati per peptidil propile isomerasi a (PPIA) e sono stati calcolati utilizzando il livello di mRNA di topi non trattati della stessa età. Le misurazioni sono state effettuate in triplicato. Il numero di topi per gruppo era 2 - 3. I risultati sono presentati come media ± staerrori ndard (SEM). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Gene | inoltrare | inverso | dimensione fragement (Bp) | ||||
| IL-1β | CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA | CCGACAGCACGAGGCTTT | 76 | ||||
| IL-6 | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | 76 | ||||
| IL-23 | GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC | GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA | 127 | ||||
| IFNγ | CACGGCACAGTCATTGAAAGC | CACCATCCTTTTGCCAGTTCC | 118 | ||||
| TNF-alfa | TGACAAGCCTGTAGCCCACG | GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC | 178 | ||||
| PPIA | GCTGGACCAAACACAAACGG | GCCATTCCTGGACCCAAAAC | 144 | ||||
Tabella 1: coppie di primer.
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Discussion
Il modello di EAE qui descritto ha ricevuto la massima attenzione come modello di SM ed è abitualmente utilizzato in fase di test strategie terapeutiche per la SM 32. La malattia del mouse presenta molte caratteristiche cliniche e istologiche della SM ed è causata dall'induzione di autoimmunità agli antigeni neuronali. La sensibilizzazione agli antigeni della mielina è associata con il cervello di sangue barriera erettile e in tal modo, l'infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale. I nostri risultati mostrano che le cellule immunitarie aumentano transitoriamente nei linfonodi nella fase acuta. le cellule della milza cellule T e B diminuzione della fase preclinica della malattia. Nel sangue circolante, le cellule T, cellule B, le cellule dendritiche e monociti aumentano transitoriamente nella fase preclinica, mentre i neutrofili aumentano malattia-dipendente. Infine, nel midollo spinale, un aumento delle cellule immunitarie è rilevabile (Figura 2). Questi dati indicano che le cellule T e cellule B migrano dalla milza, che agisceun serbatoio per queste cellule, ai linfonodi dove vengono attivati e proliferano. Successivamente, migrano attraverso la circolazione nel midollo spinale. Neutrofili, monociti e cellule dendritiche, invece, migrano dal midollo osseo attraverso la circolazione nel SNC.
I nostri dati rivelano che nel midollo spinale, IFNγ, TNF e IL-1β sono regolati in maniera malattia-dipendente, mentre l'IL-6 è transitoriamente upregulated al momento della comparsa della malattia. Questi dati supportano l'ipotesi che la patologia EAE è guidato da cellule Th1 e Th17. Cellule Th1 rilasciano IFNγ, che a sua volta attiva i macrofagi di rilasciare TNFa e IL-1β 33. Inoltre, IL-6 è noto per guidare la differenziazione delle cellule Th1 e Th17 e favorire in tal modo lo sviluppo di EAE 34.
Il giorno di inizio dei sintomi clinici e la gravità della malattia è variabile in topi EAE. Sulla base della nostra esperienza, ci sono diversi rEasons per questo. I topi esposti a stress durante la fase preclinica mostrano un livello di gravità ridotta della malattia e un ritardo della comparsa della malattia. L'alloggiamento dei topi influenza anche la gravità di EAE e anche il giorno di esordio. Recentemente, è stato dimostrato che il microbiota commensale di topi influenzare lo sviluppo di EAE 35 e diverse situazioni abitative possono influenzare il microbioma e, di conseguenza, la patologia EAE. Inoltre, è molto importante utilizzare sempre preparato fresco tossina della pertosse. Tossina della pertosse danneggia la barriera ematoencefalica, che è un prerequisito per lo sviluppo della EAE. Non utilizzare emulsionato MOG 35-55 peptide dopo la data di scadenza. L'età dei topi influenza anche EAE patologia. Così, ci sono alcune regole che devono essere soddisfatti per generare un modello EAE riproducibile. Utilizzare i topi di età compresa tra 10 e 13 settimane e topi dallo stesso fornitore, se possibile. Se i topi sono ordinati da un fornitore esterno, permettere ai topi per acclimatarsi per duesettimane nella casa degli animali. Maneggiare i topi delicatamente prima EAE induzione in modo da abituarsi al trattamento. Evitare trattamenti inutili dopo EAE induzione. Fornire i topi con cibo e acqua che possono facilmente raggiungere appena mostrano sintomi clinici. Se i topi devono essere trattati con un farmaco, si consiglia di mescolare nel cibo o acqua potabile, al fine di evitare effetti confondenti di stress. Se sonda gastrica o un'iniezione è essenziale per la somministrazione del farmaco, è importante utilizzare lo stesso percorso per il veicolo.
Oltre al modello progressivo EAE primaria qui descritto, esistono anche modelli EAE recidivante-remittente. Il decorso della malattia diversa è indotto dalla somministrazione di antigeni diversi nei vari ceppi di topi. Pertanto, l'applicazione di MOG 35 - 55 in ceppi di topi, come C57BL / 6, Sv129, B10, NOD e topi Biozzi, conduce ad una forma malattia progressiva primaria. È interessante notare, il giorno di insorgenza differisce nei vari ceppi di topi. MentreC57BL / 6, Sv129 e topi B10 sviluppare primi sintomi clinici da circa 11 a 12 giorni, i topi mostrano Biozzi primi sintomi clinici dopo 21 giorni 36. In uno studio precedente, è stato dimostrato che 129S4 / SvJae × C57BL / 6 ibridi prima mostra sintomi clinici da circa 11 giorno 28. L'iniezione di proteine proteolipid (PLP) 131-151 porta nei topi SJL per l'induzione di un recidivante-remittente decorso della malattia 37. Il miglior modello EAE da utilizzare dipenderà dal focus della ricerca. Così, se la fase di ricaduta è di interesse, il modello di ricaduta-remittente dovrebbe essere impiegato mentre se l'insorgenza della malattia è l'obiettivo principale, il modello progressivo deve essere utilizzato. Se il ruolo di una proteina specifica deve essere studiata nel modello EAE, utilizzando topi knock-out, è importante tenere presente che non tutti i ceppi possono essere utilizzati per indurre EAE e possibilmente backcrossing del ceppo knock-out su un ceppo sensibile è necessaria.
I tre t più usatoIPI DI modelli animali di SM sono (1) autoantigen indotta EAE; (2) viralmente indotta, malattia demielinizzante cronica spontanea, e (3) demielinizzazione 38 tossina-indotta. Modelli EAE sono caratterizzati dalla induzione di infiammazione e risposte autoimmuni dall'applicazione di un peptide autoantigenica come le proteine della mielina oligodendrociti o proteolipid proteina 38. Spontanea EAE si sviluppa in topi transgenici che overexpress un recettore delle cellule T contro un peptide della mielina oligodendrociti proteina 39. Per indurre infiammazione cronica virale indotta, un'infezione neurotrofico del sistema nervoso centrale può essere indotta, per esempio, con Theiler`s virus murino encefalomielite. Le cellule infettate con il virus sono attaccati da entrambe le cellule T e una risposta umorale e portare così alla demielinizzazione cronica 40,41. Tossina indotta demielinizzazione può essere indotta per esempio con il rame chelatore cuprizone 42. Questo modello porta specificamente alla demielinizzazionenazione, perché cuprizone attacca i oligodendrociti e conduce, in tal modo, per l'attivazione della microglia e astroglia, mentre i processi infiammatori svolgono solo un ruolo minore. Dopo la liquidazione della tossina, nuovi oligodendrociti sono generati e si forma una nuova guaina mielinica. L'uso di questi tre modelli, in modo complementare, consente la valutazione degli effetti dei farmaci su diversi aspetti della patogenesi della SM, perché i modelli si differenziano per processi infiammatori e immunitari e demielinizzanti. In EAE e il virus-indotto modello, infiammazione e processi autoimmuni soprattutto guidare la malattia, mentre nel modello tossina indotta demielinizzante e processi rimielinizzanti sono predominanti. Per i test preclinici di potenziali farmaci per il trattamento di MS, almeno tre modelli, un modello di tossina-indotta, una ricaduta-remittente EAE e una progressiva primaria EAE o un modello virale indotta deve essere utilizzato per verificare l'efficacia del farmaco.
Il modello di EAE ha descrittae può essere utilizzato per ottenere una visione nel meccanismo di sviluppo del processo di malattia MS-like, individuando chiave conducenti cellulari della malattia, come Th1, Th17 e cellule B 43,44. La migliore è la comprensione dei processi infiammatori e immunitari coinvolti nello sviluppo della sclerosi multipla e dei processi che promuovono e risolvono le lesioni, la più probabile è che le nuove strategie di trattamento possono essere sviluppate.
Tuttavia, il modello di EAE descritto qui ha solo alcune caratteristiche in comune con SM, e presenta alcune differenze evidenti dalla malattia umana. La differenza più importante è che i pazienti affetti da SM variano ampiamente nella presentazione della malattia, che non è riprodotto nel modello EAE. Ciò può essere dovuto a diversi modelli di lesione in pazienti con SM e topi EAE e al fatto che i topi sono ceppi inbred. Nei topi EAE, lesioni omogenee sono più importanti nel midollo spinale, mentre nei pazienti con sclerosi multipla, lesioni soprattutto eterogenei sonotrovato nel cervello 45,46. Inoltre, MS e l'EAE condividono il contributo cruciale delle cellule Th1 e cellule Th17 per il loro sviluppo, ma a differenza di MS, cellule T CD8 + svolgono un ruolo minore nel EAE patologia 33. In conclusione, il modello di EAE si concentra principalmente sugli effetti combinati di autoimmunità, processi infiammatori e neurodegenerativi che i procedimenti demielinizzanti sono meno suscettibili di valutazione comparativa. Pertanto, altri modelli animali, come il modello cuprizone possono essere utilizzati per lo studio distinto di demielinizzante elabora 47. Il modello di EAE è imperfetto, ma comunque, un utile modello di MS 33.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
| Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
| Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
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