Abstract
多発性硬化症は、認知および運動障害を生じる中枢神経系（CNS）において病変形成することを特徴とする炎症性自己免疫疾患であると推定されます。それはまた、CNS内の病変形成、運動障害を特徴とし、また、自己免疫疾患および炎症反応により駆動されるので、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、MSの有用な動物モデルです。 EAEモデルの一つは、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（MOG）マウスにおける35-55に由 来するペプチドを用いて誘導されます。 EAEマウスは、進行性疾患のコースを開発しています。このコースは3つのフェーズに分かれています。前臨床段階（日0から9）、疾患の発症（日10から11）と急性期（日12から14）。 MSおよびEAEは、CNSに浸潤する自己反応性T細胞によって誘導されます。これらのT細胞は、さらに、免疫細胞の動員をもたらすケモカインおよびサイトカインを分泌します。脊髄dのため、免疫細胞の分布3疾患の段階をuringすることを検討しました。 T細胞、B細胞および単球の活性化/増殖/蓄積が開始される疾患の時点を強調するために、リンパ節、脾臓および血液中の免疫細胞の分布についても評価しました。さらに三病段階におけるいくつかのサイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-23、TNFα、IFNγ）のレベルは、疾患の炎症過程への洞察を得るために、測定されました。結論として、データは、EAEの病理中の免疫細胞の機能プロファイルの概要を説明します。
Introduction
多発性硬化症（MS）およびその対応する動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、中枢神経系（CNS）における自己免疫神経炎症の変化を示します。早期活性MSおよびEAEの病変は、浸潤免疫細胞の存在によって特徴付けられます。 MSの病因は不明であるが、広く自己反応性T細胞によって媒介ミエリンの破壊を伴うと考えられています。これらの自己反応性T細胞は、循環からのB細胞、単球および好中球などの他の免疫細胞を誘引前炎症性サイトカインおよびケモカインを分泌します。単球はマクロファージに分化します。自己反応性T細胞によって分泌されるインターフェロンγ（IFNγ）は、前炎症性マクロファージにマクロファージを偏光します。前炎症性マクロファージ放出サイトカインおよびオリゴデンドロサイトのアポトーシスを促進する活性酸素種。オリゴデンドロサイトの死は脱髄につながります。さらに、B細胞は、pに分化します細胞をlasma、最終的にミエリンの劣化が生じ、ミエリン鞘に対する自己抗体をリリース。ミエリンの喪失は、軸索及びニューロンの劣化にし、それによってMS 1の主な特徴を表すCNSにおける病変部位の形成をもたらします。周囲に、T細胞とB細胞はリンパ節において活性化され、それらは、脾臓中で増殖し、中枢神経系への循環を通って移動します。単球および好中球は骨髄で増殖し、また、中枢神経系への循環を通って移動します。
血液中へのまたはCNSへの血流からの骨髄、脾臓およびリンパ節からの白血球の血管外漏出は、ケモカインおよびケモカイン受容体によって媒介される白血球と内皮細胞との間の分子間相互作用を含むいくつかの要因に依存する多段階プロセスです。種々の細胞型によるケモカインの産生、免疫reactio中に誘導することができますその後炎症2,3の部位への免疫細胞を補充腫瘍壊死因子α（TNFα）などのサイトカイン、IFNγおよびインターロイキン6（IL-6）、によってN。免疫細胞は、炎症部位への細胞型及び移動経路に応じて、それらの表面上のケモカイン受容体のサブセットを提示します。したがって、CXCR2、CCR1とCXCR1は、骨髄や血液4で成熟した好中球上に発現し、そのリガンド、CXCL2、CCL5またはCXCL6の結合され、それぞれ、好中球を活性化し、その後、細胞の遊走を内皮細胞への接着を促進し、組織5-9に。 CCL2とCCL20はそれぞれ、CCR2 11およびCCR6 12を発現し 、単球およびTh1 / Th17細胞10を 、引き付けます。 T細胞、単球およびマクロファージを含む、13の異なる細胞型によって発現CCR1及びCCR5、CCL3、CCL5及びCCL7に結合し、MS 14の間にアップレギュレートされます。 CXCR3は、T細胞上に発現され、CCL9、CCL10に結合され、かつCCL11 15。
MSの治療における一つの主要な戦略は、免疫細胞の枯渇またはCNSへの免疫細胞の浸潤の予防です。したがって、特定のケモカイン受容体の遮断は、EAEに検討されています。拮抗作用またはCCR1 16の遺伝子欠失、CCR2 17は 、CCR7 18またはCXCR2 19は、拮抗作用またはCCR1 20の遺伝子欠失のに対し、CCR5 20またはCXCR3 21は病変を減少させなかった、EAEの病理を低減します。したがって、白血球上の特定のケモカイン受容体の発現は、CNSへの後者の浸透のために重要であり、EAEのコースを指示します。
浸潤免疫細胞は、順に、炎症過程またはニューロン22の劣化を促進し、TNFα、IL-6およびIL-1βなどのサイトカインを放出するため、免疫細胞の枯渇が、MS患者に対する有効な治療戦略です。また、自動反応性Th1細胞は、順番に、TNFα、IL-1βおよびIL-23を解放するためにマクロファージを刺激しIFNγを放出します。
この原稿は、EAEの誘導、EAEマウスの種々の組織における免疫細胞の分布とサイトカインレベル（mRNA）の決意を示しています。細胞は、最終的にCNSにおける病変形成をもたらす炎症過程の時間依存性の概要を提供するために、疾患の経過中の異なる時点で単離しました。
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Protocol
倫理の声明：私たちの実験手順はRegierungspräsidiumダルムシュタット（ドイツ）の倫理委員会によって承認され、国内および欧州の規制に確認されています。すべての努力は、動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減少させました。
1. EAEモデル
- EAEモデルの誘導
- EAEの誘導のために10〜13週齢の雌129S4 / SvJae×C57BL / 6マウスを使用してください。
- 200μl中400μgの結核菌を含む完全Freund`sアジュバント（CFA）を乳化55（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）ペプチド（200μgの）、 -脳炎誘発性MOG 35の、背面上部および下部に、マウスに皮下注射を与えます。
注：陰性、非疾患誘発偽対照として、同じ量および同じ経路で、 結核菌を含む不完全フロイントアジュバントを使用することができます。 - THEReafter、そして再び24時間後、マウスを（200μlのリン酸緩衝生理食塩水、PBSで希釈し、合計0.2μgの中で、）百日咳毒素の腹腔内注射を与えます。健康な動物との患部を比較することができるように、対照群として未処理マウスを使用してください。
注：、55ペプチド300 - - - 300μgのMOG 35 200でEAEを誘導することも可能である注射当たり0.2ミリリットル- 0.1の容量で0.3μgの百日咳毒素- CFAと0.2での結核菌 500μgの。 - （ステップ1.2.1を参照）、注射後1週間以降、臨床症状について毎日マウスを調べます
注：疾患発症の日が異なる実験で変動するが、我々の研究室での条件の下で、これは11日目のまわりであり、従って、ここでは14日目には、疾患の発症後3日間として定義されています。本研究における全てのマウスは臨床症状を発症しました。
- マウスのスコアリング
- 次のように臨床スコアによって臨床症状を分類：0）兆候ない、尾の0.5）遠位麻痺、1）尾の完全麻痺、1.5）尾の引きずりと後肢の軽度の弱さ、2）尾の引きずりと後足の重度の衰弱、2.5）尾の引きずりとの麻痺1後肢、3）尾の引きずり、両方の後肢の麻痺、後肢と1前肢の弱さの両方の3.5）麻痺が（このスコアを達成したマウスは）地元の倫理ガイドラインを踏まえて、安楽死させました。
フローサイトメトリー分析のための単一細胞の調製
注：抗体混合物は、1μlのCD45-VioBlueに、2μlのCD8-eFluor650、0.5μlののCD11b-eFluor605、0.5μlのF4 / 80-PE-Cy7を、1μlのCD3-PE-CF594、CD4-V500、0.5μlのCD11cので構成されてい-AlexaFluor700、1μlのCD19-APC-H7と1μlのLy6G-APC-Cy7を。
注：血液、リンパ節、脾臓および脊髄を取る場合は、次のように手順は次のとおりです。マウスを深くisoflの組み合わせで麻酔urane（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）。次に、胸郭を開き心臓内棒で血液を除去し、冷PBSで心臓内にマウスを灌流。その後、脾臓、最終的には脊髄が続いリンパ節を削除します。あなたが心臓内にマウスを灌流する必要がない場合は、首の脱臼により深い麻酔下でマウスを安楽死させます。
- 脾細胞の単離
- イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。
- 80％のイソプロパノールでウェット切開領域は、はさみを使って、毛を持つ任意の汚染を回避し、より深部の組織を穿刺することなく、縦方向に胸郭を開きます。
- 冷PBSのpHは7.0 23で心臓内にマウスを灌流。
注：脾臓は胸郭の下で左上腹部の象限に位置しています。脾臓が検討される場合にのみ、この器官はretaiするために、灌流前に除去することができます関心のあるすべての細胞型をn個。 - 脾臓を取り出して、約1/8をカットし、それを量ります。氷上のPBSでサンプルを保管してください。
- 2mLの注射器のプランジャーを用いて、（50mlのチューブ上に配置）70ミクロンメッシュの篩を通して脾臓組織を絞ります。
- 5ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。 3分間1800×gで遠心分離します。ソリューションを溶解500μlのペレットを再懸濁。
注：この段階では、後で、代替のFACS解析方法は、ビーズを使用しないという使用される場合、差分細胞カウントを行うことが必要であってもよい（セクション3を参照）。 - 室温（RT）で10分間インキュベートし、500μlのPBSを追加します。室温（RT）で650×gで6分間遠心。
- 500μlのPBSで洗浄工程を繰り返します。 100μlの0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）で細胞ペレットを再懸濁し、上清を捨て/ PBSは、2μLのFc受容体1（のFcRI）ブロッキング緩衝液を追加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。
- 13μlの追加tibody混合物を、暗所で室温で15分間インキュベート室温で650×gで6分間、500μlのPBSおよび遠心分離機を追加します。上清を捨てます。
注：メーカーの染色手順は、単一の洗浄を推奨するが、バックグラウンド染色のさらなる減少は、必要に応じて洗浄工程を一又は二回以上繰り返すことによって達成することができます。 - 500μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁（またはおそらくタンパク質の分離のためのバッファを実行すると、潜在的に細胞凝集を減少させる）、フローサイトメトリーチューブに移します。細胞を氷上に保管してください。
- リンパ節細胞の単離
- イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。
- 80％のイソプロパノールでウェット切開領域とハサミを使用して縦方向に胸郭を開きます。冷PBSのpHは7.0 23で心臓内にマウスを灌流。
- 鼠径リンパ節を単離するために、慎重にハイの領域で皮膚を除去鉗子で脂肪組織の外に慎重にリンパ節をpと選択します。鼠径リンパ節を秤量し、氷上でPBSでサンプルを保存します。
注：我々は、我々の研究のためO`Connor らに鼠径リンパ節を使用していました。活性化単球、マクロファージ、好中球およびT細胞の高い数は、すべてのEAE誘導後24鼠径リンパ節中に存在することを見出しました。 - 2ミリリットルの注射器のプランジャーを用いて、（50ミリリットルチューブの上に配置）70ミクロンメッシュの篩を通してリンパ節を絞ります。
- 5ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。 8分間、2400×gで遠心分離します。 100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁し、2μlののFcRIブロッキング緩衝液を添加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。
- 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。
- 上清を捨て、300μlのPBSで細胞ペレット（または適切なランニングバッファー）を再懸濁し、それを移しますフローサイトメトリーチューブに。
- 血液細胞の単離
- （EDTAで安定化された）50μlの血液に50μlの20 mMのHEPESを追加し、ソリューションを溶解500μlを添加します。 RTで10分間インキュベートし、500μlのPBSを追加します。室温で650×gで6分間遠心分離します。上清を捨て、洗浄ステップを繰り返します。
- 100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁し、2μlののFcRIブロッキング緩衝液を添加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。
- 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。 、上清を捨て、300μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。
- 脊髄細胞の単離
- イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。
- 80％のイソプロパノールで湿潤切開領域と縦方向に胸部を開きはさみを使って。冷PBSのpHは7.0 23で心臓内にマウスを灌流。
- 背面の切開領域を湿らせ、メスで再び縦カットをすると皮膚を取り除きます。
- （後肢を神経支配）脊椎の腰部を切り出し、脊髄を抽出するためにPBSで満たされた注射器でそれをフラッシュします。 、腰椎コードの約1/3を切り取り、これを計量し、氷上でPBSでサンプルを保存します。
- 4°Cで2分間250×gで遠心分離します。上清を捨て、500μlの細胞剥離液とHBSS追加（1：1）。 、3 mg / mlでコラゲナーゼA及び1単位/ mlのDNアーゼIを追加アップ繰り返し、ダウンピペッティングにより細胞を首をはねると400rpmで37℃で振とうしながら30分間インキュベートします。
注：好ましい場合、細胞懸濁液は、バックグラウンド自己蛍光のANを低減することにより、測定フローサイトメトリーの感度を向上させることができる密度勾配遠心分離によりミエリン及び細胞残屑を汚染するクリアすることができ取得する必要のあるイベントの数をD（セクション3.5を参照）。 - 室温で2分間、250×gで遠心します。上清を捨て、1ミリリットル10％ウシ胎児血清（FCS）/ダルベッコ最小必須培地（DMEM）中にペレットを再懸濁し、最大繰り返し、ダウンピペッティングにより細胞を再度首をはねます。
- 室温で2分間、250×gで遠心します。洗浄工程を繰り返します。
- 1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、2ミリリットルの注射器のプランジャーを用いて、（50ミリリットルチューブの上に配置）70ミクロンメッシュのふるいを通して脊髄を圧迫。
- 4ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。室温で3分間、1,800×gで遠心します。上清を捨て、のFcRIはブロッキング試薬2μlを添加し、暗所で室温で15分間インキュベートし、100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁します。
- 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。
- 上清を捨て、細胞PELLEを再懸濁500μlのPBS（または適切なランニングバッファー）でtとフローサイトメトリーチューブに移します。
3.フローサイトメトリー分析
- オレシュら 25によって記載されるように最適な濃度を決定するために、事前にすべての抗体を滴定します。
- manufacturer`s指示に従って、マルチカラー補正行列を作成するために単一色補正のための抗体捕捉補償ビーズを使用します。
- manufacturer`s指示に従って特定のビーズを使用して、毎日機器較正を制御します。
- 直接測定のフローサイトメトリーの前に、絶対細胞数を決定するために（分離のためのセクション2.1、2.2、2.3、2.4を参照）を細胞に30μlのフローサイトメトリー絶対数の標準を追加します。代わりに計数ビーズを用いて細胞を計数することができます。
- フローサイトメーターに試料（50万イベント：10万イベント、脊髄、脾臓、リンパ節及び血液からの細胞）を取り上げますND特定のフローサイトメトリーソフトウェアを使用して分析します。
- フローサイトメトリーソフトウェアを開き、ボタン「サンプルを追加」を押すことで、FCS 3.0のファイルを追加します。
- ダブルクリックして追加したファイルを開きます。 x軸とy軸のチャンネルを調整します。目的の細胞集団を選択するには（ 図4を参照）は、ゲートを作成します。
4.定量的PCR分析
- cDNAへのmRNAの単離および転写
- フェノール-クロロホルムにより腰部脊髄（1/3）、脾臓（1/8）および鼠径リンパ節からmRNAを抽出し、エタノール26で沈殿します。
- このために、10分間インキュベート1mlのグアニジンチオシアネート - フェノール混合物中で組織をホモジナイズします。 200μlのクロロホルムを加え、再び10分間インキュベートします。
- 遠心分離工程（4℃で15分間、18,000×gで）した後、4時（上部の水相は、500μlのイソプロパノールおよび遠心分離機である8分間18,000×gで洗います°C）。
- 500μlのエタノールでペレットを洗浄し、遠心分離工程（4℃、5分間18,000×gで）した後、真空濃縮器（30℃、5分）でペレットを乾燥させます。その後、30μlの水にペレットを再懸濁。
- 血液からmRNAを抽出するには、遠心分離機500μlのEDTA安定化血液（300×gで10分間、4℃）。
- 、バフィーコートを取る白血球を含有する、溶液（150mMのNH 4 Cl を 、100mMの炭酸水素ナトリウム、0.1mMのナトリウム、EDTA pH7.4）に溶解1mlに希釈します。
- 室温で10分間インキュベートした後、6分間、650×gで細胞を遠心分離し、その後PBSで2回洗浄します。
- 製造者の指示に従ってRNA抽出用キットを使用して、白血球（WBC）からmRNAを抽出します。
- 製造業者の指示に従ってランダムヘキサマーを含むcDNA合成用キットを用いてcDNA合成を行います。 CDN 200 ngのmRNAをを使用して合成。
- フェノール-クロロホルムにより腰部脊髄（1/3）、脾臓（1/8）および鼠径リンパ節からmRNAを抽出し、エタノール26で沈殿します。
- 定量PCR
- 特定のmRNAの量を定量化するために、1μlのcDNAを、1μMリバース/フォワードプライマーと、製造元の指示27に従って、蛍光DNA結合色素を使用します。プライマーセットのための配列については表1を参照してください。定量PCRシステムを用いて、IL-1β、IL-6、IL-23、IFNγ、TNFαおよびPPIA（ペプチジルプロリルイソメラーゼ）のCT値を測定します。
- 相対的mRNA発現を決定するために、比較CT（サイクル閾値）法27を使用します 。
- このため、以前の研究（Barthelmes らに記載されているように、標的遺伝子からPPIAの平均CT値を減算することによりPPIAの発現レベルに標的遺伝子のCT値を正規化する。28、Schiffmann ら 。29、Schiffmann ら 30）。続いて、ΔCT値を正規化する、使用して、いわゆるΔΔCT値を計算しますEAEマウスにおけるΔCT値から未処置マウスにおける平均ΔCT値を減算することにより再度、未処理マウスの標的遺伝子の発現レベルにEAEマウスからの標的遺伝子の。
- - ΔΔCT2：標的遺伝子の相対的mRNA発現を得るために、以下の式を用いて比を計算します。
- 各プライマーの特異性をテストします。 2％アガロースゲル31を使用して増幅断片のサイズを決定します。フラグメントサイズを表 1に示します。
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Representative Results
図1は、この記事で説明されているさまざまな方法の概略図を示します。1）マウスは、MOG 35-55抗原の注射を受け、10.7±0.3日28後の初期の臨床症状を起こします。 EAEマウスの代表的な疾患経過を図1に示されている。2）種々の組織（脾臓、リンパ節、腰部脊髄）および血液を前臨床段階（2日目、4日目の間に異なる時点で制御し、EAEマウスから抽出され、6日目）、疾患の発症時（10日目）および疾患（12日目、14日目）。3）EAEの発生を調節するサイトカインのmRNA発現プロフィールの急性期の間、さまざまな決定されます組織は、定量的PCRを用いて、疾患の経過中の異なる時点で抽出した。4）単一細胞抽出種々の組織から単離されます疾患の経過および免疫細胞の分布の間の異なる時点でフローサイトメトリーを用いて決定しました。
脾臓およびリンパ節では、T細胞およびB細胞は、最も顕著な細胞型として観察されます。リンパ節とは対照的に、脾臓において、さらに、単球および好中球の多数が存在します。全ての免疫細胞は脾臓においてのみ、マクロファージ、B細胞、T細胞および好中球の増加に対し、急性期リンパ節における一過性の上昇を示します。血液では、すべての免疫細胞は、前臨床段階の間、一時的に増加します。腰髄において、すべての免疫細胞の疾患依存性増加を離れて、おそらく脊髄（ 図2）に、その入り口の後、マクロファージへ分化する単球から、観察されました。 CD4 +およびCD8 + T細胞は、異なる疾患のコース中、脾臓、リンパ節及び血液中の同等の変化を示します。アム脊髄を浸潤オング細胞は、CD4 + T細胞の増加が最も（ 図3）に顕著でした。 図4では、異なる細胞集団の決意するためのゲーティング戦略を示しています。単球（CD45hi、CD3-、Ly6G-、CD19-、CD11c-、のCD11b +）、マクロファージ（CD45hi、CD3-、Ly6G-、CD11c-を、のCD11b +、F4 /：次のように詳細には、この原稿に記載の細胞集団を同定しました80hi）、好中球（CD45hi、CD3-、のCD11b +、Ly6G +）、樹状細胞（CD45hi、CD3-、Ly6G-、CD19-、のCD11c +）、B細胞（CD45hi、CD3-、CD19 +）、T細胞（CD45hi、CD3 +） 、CD4 + T細胞（CD45hi、CD3 +、CD4 +）およびCD8 + T細胞（CD45hi、CD3 +、CD8 +）。細胞の数は、このように絶対的な細胞数を反映して、組織（脾臓の重さ、リンパ節、腰部脊髄）または血液量の量に関連しています。測定された全細胞の百分率としての細胞型を発現するように、しかしながら、可能です。
LYMでIL-6のmRNAの発現は、疾患依存的に増加し、一方、pHがノードは、IL-23 mRNAの発現は、一過性、前臨床段階中に増加されます。疾患の発症時に、IL-1βmRNAの発現が上昇している間に脾臓において、IL-6およびIL-23 mRNAの発現は、前臨床段階で一過性に増加します。血液中で、TNFαのmRNAの発現は、疾患依存的に増加されます。急性期腰髄において、TNFα、IL-1β及びIFNγの増加、IL-6は、開始フェーズ（ 図5）の間にアップレギュレートされる一方。
図1：EAEの誘導および免疫学的評価のためのワークフローのスキーム。 1）EAEの臨床症状の発症につながるマウスにおいて誘導されます。臨床症状はclassifiあります以下のように、臨床スコアによって編：尾の0）徴候、0.5）遠位麻痺、尾の1）完全麻痺、1.5）尾の引きずりと後肢の軽度の弱さ、2）尾の引きずりと後足の重度の衰弱、2.5）尾の引きずりと1後肢、3）尾の引きずり、両後肢の麻痺の麻痺を。図に示すに使用したマウスの数は、図はBarthelmes らから変更されている。28 7であった。2）マウスは、疾患経過、脾臓、鼠径リンパ節、血液および腰髄中の異なる時点で屠殺されています抽出され、単一のこれらの組織から単離された細胞は、様々な組織における3）免疫細胞分布、フローサイトメトリーによって決定される。 図4は、異なる組織における様々なサイトカインのための）mRNA発現、定量的PCRにより決定される。 拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。このFのigure。
図2：免疫細胞の分布、FACS脾臓における分析、リンパ節を（蛍光活性化細胞選別）、異なる疾患段階でのEAEマウスからの血液や脊髄サンプルにより決定示された実験では、グループあたりのマウスの数は2でした。 - 10.好中球/血液中の単球と好中球の分布/脊髄中のマクロファージは、適応とBarthelmes らから変更されている28。。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：CD4 + T細胞およびCD8
図4：T 細胞、12日目A）すべてのセルからのSSC / CD45のプロット上のEAEマウスの脊髄からのB細胞、好中球、単球、樹状細胞やマクロファージのフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略 。ゲート：CD45 +細胞からCD45 +細胞B）FSC-H /のプロットFSC-W秒。ゲート：単一細胞C）単一細胞からSSC-A / FSC-Aのプロット。ゲート：生細胞。 D）生細胞からFSC-H / CD3のプロット。ゲート：CD3 +およびCD3 -細胞E）CD3 +細胞からのCD4 / CD8のプロット。ゲート：CD4 + CD8 - （CD4 + T細胞 ）及びCD4 - CD8 +（CD8 + T細胞 ）F）CD3のCD19およびLy6G / CD11bのプロット-細胞。ゲート：CD19 +のCD11b -細胞（B細胞 ）、Ly6G +のCD11b +細胞（ 好中球 ）とCD19 - Ly6G - Ly6G - -細胞の細胞G）CD19からのCD11c / CD11b細胞のプロット：門のCD11c +細胞（ 樹状細胞 ）およびCD11c -細胞H）SSC / F4 / 80 FRのプロット。オムのCD11c -細胞。ゲート：F4 / 80 -細胞（ 単球 ）およびF4 / 80 +細胞（ マクロファージ ）。 9のいずれかの代表的なプロットが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 異なる疾患段階におけるEAEマウスからの試料中の サイトカインプロファイル（IL-1β、IL-6、IL-23、TNFα、IFNγ）A） リンパ節、B）脾臓、C）血液及びD）脊髄。 mRNA発現レベルは、プロピルイソメラーゼA（PPIA）のペプチジルに対して標準化し、同じ齢の未処理マウスのmRNAレベルを用いて計算しました。測定は三重に行きました。 3.結果STA±手段として提示されている - グループあたりのマウスの数は2でしたndard誤差（SEM）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 遺伝子 | フォワード | 逆 | fragementサイズ（BP） | ||||
| IL-1β | CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA | CCGACAGCACGAGGCTTT | 76 | ||||
| IL-6 | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | 76 | ||||
| IL-23 | GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC | GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA | 127 | ||||
| IFNγ | CACGGCACAGTCATTGAAAGC | CACCATCCTTTTGCCAGTTCC | 118 | ||||
| TNFα | TGACAAGCCTGTAGCCCACG | GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC | 178 | ||||
| PPIA | GCTGGACCAAACACAAACGG | GCCATTCCTGGACCCAAAAC | 144 | ||||
表1：プライマー対。
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Discussion
ここで説明EAEモデルは、MSのモデルとして最も注目されており、日常的にMS 32のための治療戦略を試験する際に使用されます。マウスの疾患は、MSの多くの臨床的および組織学的特徴を示し、神経細胞の抗原に対する自己免疫の誘導によって引き起こされます。ミエリン抗原に対する感作は、血液脳関門機能不全に関連し、それによって、CNSへの免疫細胞浸潤されます。我々の知見は、免疫細胞が急性期でリンパ節内に一時的に増加することを示しています。脾臓T細胞とB細胞は、疾患の前臨床段階で減少します。好中球は、疾患依存的に増加させるのに対し、血液循環において、T細胞、B細胞、樹状細胞および単球は、前臨床段階で一過性に増加します。最後に、脊髄内に、免疫細胞の増加が検出（ 図 2）です。これらのデータは、T細胞およびB細胞が作用脾臓から移行することを示しますこれらの細胞は、それらが活性化し、増殖しているリンパ節のリザーバ。その後、彼らは、脊髄への血液循環を経て移行します。好中球、単球および樹状細胞が、一方、CNSへの循環を介して骨髄から移動します。
IL-6は、一過性疾患の発症時にアップレギュレートされるのに対し、我々のデータは、脊髄において、IFNγ、TNFαおよびIL-1βが疾患依存的に調節されることを明らかにする。これらのデータは、EAEの病理は、Th1およびTh17細胞の細胞によって駆動されるという仮説を支持します。 Th1細胞は、順番に、TNFαおよびIL-1β33を解放するためにマクロファージを活性化IFNγを放出します。また、IL-6は、Th1およびTh17の細胞の分化を駆動し、それによってEAE 34の開発を促進することが知られています。
臨床症状の発症および疾患の重症度の日は、EAEマウスにおける変数です。私たちの経験に基づいて、いくつかのrがありますこのためeasons。前臨床段階の間にストレスにさらされたマウスは、疾患の減少した重症度および疾患発症の遅延を示しています。マウスのハウジングはまた、EAEの重症度とも発症日に影響を与えます。最近、マウスの共生微生物がそれによってmicrobiomeと、EAEの病理に影響を与える可能性EAE 35と異なるハウジング状況の発達に影響を与えることが示されました。また、新たに調製した百日咳毒素を使用することが常に非常に重要です。百日咳毒素損害EAEの開発のための前提条件である血液脳関門。有効期限後に乳化したMOG 35-55ペプチドを使用しないでください。マウスの年齢はまた、EAEの病理に影響を与えます。このように、再現性のEAEモデルを生成するために満たされるべきいくつかのルールがあります。可能な場合、同じサプライヤーから10と13週とマウスとの間老齢マウスを使用してください。マウスを外部のサプライヤーに発注している場合は、マウスが2のための順応できるようにします動物の家の中で週間。彼らは取り扱いに慣れるように優しくEAE誘導前に、マウスを処理します。 EAE誘導後の不要な取り扱いは避けてください。彼らは簡単に、すぐに彼らは、臨床症状を示すように到達することができ、食物と水をマウスに与えます。マウスは薬物で処置される場合、それは、交絡応力の影響を回避するために、食品または飲料水にそれを混合するのが最善です。強制経口または注射は、薬物投与のために必須である場合には、車両の同じ経路を使用することが重要です。
ここに記載の一次進行性EAEモデルに加えて、再発寛解型EAEモデルも存在します。異なる疾患経過は、種々のマウス系統における異なる抗原の投与によって誘導されます。このように、MOG 35の応用-そのようなC57BL / 6、SV129、B10、NODおよびBiozziマウスとマウス系統、55は 、一次進行性疾患のフォームにつながります。興味深いことに、発症日は、様々なマウス系統で異なっています。一方C57BL / 6は、SV129とB10マウスはBiozziマウスは、21日36後の最初の臨床症状を示し、12日目約11から最初の臨床症状を発症します。以前の研究では、129S4 / SvJae×C57BL / 6ハイブリッド初日約11 28からの臨床症状を示すことが示された。プロテオリピドタンパク質（PLP）131-151の注入は再発寛解型の誘導にSJLマウスにおいてリード疾病経過37。使用するのに最適なEAEモデルは、研究の焦点に依存します。再発相に関心がある場合、疾患の発症は、主な焦点である場合、進行性モデルを使用する必要があり、一方、したがって、再発寛解型モデルを使用すべきです。特定のタンパク質の役割は、ノックアウトマウスを用いて、EAEモデルにおいて調査される場合、すべての株がEAEを誘導し、おそらくは上ノックアウト株の戻し交配するために使用され得ることに留意することが重要です感受性株が必要です。
3最も広く使用されているトンMSの動物モデルのYPESは、（1）自己抗原EAEを誘発しています。 （2）ウイルス自発、慢性脱髄疾患、及び（3）毒素誘発性脱髄38を誘導しました 。 EAEモデルは、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質またはプロテオリピドタンパク質38として、自己抗原ペプチドの適用によって、炎症および自己免疫応答の誘導によって特徴付けられます。自発EAEは、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質39のペプチドに対するT細胞受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスで発症します。ウイルス誘発性の慢性炎症を誘導するために、中枢神経系の神経栄養感染Theiler`sマウス脳脊髄炎ウイルスを、例えば、誘導することができます。ウイルスに感染した細胞は、T細胞と体液性応答の両方によって攻撃され、慢性脱髄40,41に、それによってリードされています。毒素誘発性の脱髄は、銅キレート剤クプリゾン42と、例えば誘導され得ます。このモデルは、具体的にdemyeliにつながります国家がクプリゾンは、炎症プロセスはわずかな役割を果たしているのに対し、アストログリアおよびミクログリアの活性化、それによって、オリゴデンドロサイトとリードを攻撃するため。毒素のクリアランス後、新しい乏突起膠細胞が生成され、新たなミエリン鞘を形成します。モデルは、炎症、および免疫および脱髄プロセスに関して異なるため、これら3モデルの使用は、補完的な方法で、MSの病因の異なる側面に薬物効果を評価することができます。毒素誘発モデルでは、脱髄及び髄鞘再形成過程が支配的であるのに対し、EAEおよびウイルス誘発モデルでは、炎症および自己免疫プロセスは、主に、病気を駆動します。 MSの治療のための潜在的薬物の前臨床試験、少なくとも三つのモデル、毒素誘発モデル、再発寛解型EAEおよび一次進行性EAEまたはウイルス誘発性モデルの場合、薬剤の有効性を検証するために使用されるべきです。
EAEモデルは彼女を説明しましたEは、のTh1、Th17細胞およびB細胞の43,44などの疾患の重要な細胞ドライバを識別する、MS様疾患プロセスの開発の機構へのさらなる洞察を得るために使用することができます。 MSの開発および促進し、病変を解決するプロセスの関連する炎症および免疫プロセスのより良い理解は、より可能性が高いことは、新たな治療戦略を開発することです。
それにもかかわらず、ここで説明したEAEモデルは、単にMSと共通のいくつかの特徴を持っており、ヒトの疾患からいくつかの明確な違いを備えています。最も顕著な違いは、MS患者は、EAEモデルで再現されていない病気のプレゼンテーション、で広く変化することがあります。これは、MS患者及びEAEマウスにおけるマウスは近交系であるという事実に異なる病変パターンに起因し得ます。 MS患者において、主に異種の病変であるのに対し、EAEマウスでは、均質な病変は、脊髄において最も顕著です脳45,46で見つかりました。また、MSおよびEAEは、それらの開発のためにTh1細胞およびTh17細胞の重要な貢献を共有するが、MSとは対照的に、CD8 + T細胞は、EAEの病理33でマイナーな役割を果たしています。脱髄プロセスが選択的評価にはあまり適しているのに対し、結論として、EAEモデルは、主に自己免疫、炎症過程および神経変性の複合効果に焦点を当てています。したがって、このようなキュプリゾンモデルなどの他の動物モデルは、プロセス47の脱髄の別個の研究のために使用することができます。 EAEモデルは、それにもかかわらず、MS 33の有用なモデルで不完全ですが、。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
| Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
| Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
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