Abstract
Multippel sklerose er antatt å være en inflammatorisk autoimmun sykdom, som er kjennetegnet ved lesjonsdannelse i sentralnervesystemet (CNS) som resulterer i kognitiv og motorisk svekkelse. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en nyttig dyremodell av MS, fordi det er også karakterisert ved lesjonsdannelse i CNS, motorfunksjon og er også drevet av autoimmune og inflammatoriske reaksjoner. Ett av EAE-modeller er indusert med et peptid avledet fra myelin oligodendrocytt protein (MOG) 35-55 i mus. EAE mus utvikler en progressiv sykdomsforløpet. Dette kurset er delt inn i tre faser: preklinisk fase (dag 0-9), sykdomsutbruddet (dag 10-11) og den akutte fasen (dag 12-14). MS og EAE induseres av autoreaktive T-celler som infiltrerer CNS. Disse T-cellene utskiller kjemokiner og cytokiner som fører til rekruttering av ytterligere immunceller. Derfor immunceller fordelingen i ryggmargen dUrering tre sykdomsfaser ble undersøkt. For å markere tidspunktet av sykdommen hvor aktivering / spredning / opphopning av T-celler, B-celler og monocytter starter, ble immunceller fordelingen i lymfeknuter, milt og blod også vurderes. Videre ble nivåene av flere cytokiner (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i de tre fasene sykdoms bestemt, for å få innsikt i inflammatoriske prosesser av sykdommen. I konklusjonen, data gi en oversikt over den funksjonelle profilen av immunceller i løpet av EAE patologi.
Introduction
Multippel sklerose (MS) og dens tilsvarende dyremodell, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), viser autoimmune nevroinflammasjon endringer i sentralnervesystemet (CNS). Tidlig aktive MS- og EAE-lesjoner er karakterisert ved tilstedeværelsen av infiltrerte immunceller. Årsaken til MS er fortsatt ukjent, men er ansett å innebære ødeleggelse av myelin mediert av autoreaktive T-celler. Disse autoreaktive T-celler utskiller pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner som tiltrekker andre immunceller slik som B-celler, monocytter og nøytrofile celler fra sirkulasjonen. Monocytter differensieres til makrofager. Interferon gamma (IFNy) som utskilles av autoreaktive T-celle-polariserer makrofagene til pro-inflammatoriske makrofager. Den pro-inflammatoriske makrofager utslipp cytokiner og reaktive oksygenforbindelser som fremmer apoptose i oligodendrocytes. Død av de oligodendrocytes fører til demyelinisering. Videre B-celler differensieres til plasma celler og utslipp autoantistoffer mot myelin skjede, til slutt resulterer i nedbrytning av myelin. Tapet av myelin fører til nedbrytning av axoner og nerveceller, og derved til dannelsen av lesjon områder i CNS som representerer de viktigste kjennetegn av MS-en. I periferien, blir T-celler og B-celler aktivert i lymfeknutene, sprer de i milten og vandrer gjennom sirkulasjonen inn i det sentrale nervesystemet. Monocytter og nøytrofile celler prolifererer i benmargen og også migrere gjennom sirkulasjonen inn i det sentrale nervesystemet.
Leukocytt ekstravasjon fra benmarg, milt og lymfeknuter i blodet eller fra blodet inn i CNS er en flertrinns prosess som er avhengig av flere faktorer, blant molekylære interaksjoner mellom leukocytter og endotel formidlet av kjemokiner og kjemokinreseptorer. Produksjonen av kjemokiner ved hjelp av forskjellige celletyper kan bli indusert i løpet av immun reaction av cytokiner som tumornekrosefaktor-α (TNF-alfa), IFNy og interleukin-6 (IL-6), som deretter rekrutterer immunceller til stedet av betennelse 2,3. Immunceller presentere et delsett av kjemokin reseptorer på sin overflate, avhengig av celletype og migrering vei til inflammatorisk sete. Således er CXCR2, CCR1 og CXCR1 uttrykt på modne neutrofiler i benmarg og blod 4, og binding av dets ligander, CXCL2, CCL5 eller CXCL6, henholdsvis, aktiverer neutrofiler og fremmer deres adhesjon til endotel og deretter, migrering av cellene i vev 5-9. CCL2 og CCL20 tiltrekke monocytter og Th1 / Th17 celler 10 som uttrykker CCR2 11 og CCR6 12, henholdsvis. CCR1 og CCR5, uttrykt av forskjellige celletyper, inkludert T-celler, monocytter og makrofager 13, fell CCI3, CCL5 og CCL7 og blir oppregulert ved MS 14. CXCR3 er uttrykt på T-celler og binder CCL9, CCL10 ogCCL11 15.
En hovedstrategi i MS behandling er uttømming av immunceller eller forebygging av immuncelleinfiltrasjon inn i CNS. Derfor har blokaden av spesifikke kjemokinreseptorer blitt undersøkt i EAE. Antagonisme eller genetisk sletting av CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 eller CXCR2 19 reduserer EAE patologi, mens antagonisme eller genetisk sletting av CCR1 20, gjorde CCR5 20 eller CXCR3 21 ikke redusere patologi. Derfor er uttrykket av spesifikke kjemokinreseptorer på leukocytter avgjørende for infiltrasjon av den sistnevnte inn i CNS og dikterer løpet av EAE.
Uttømming av immunceller er en effektiv behandlingsstrategi for MS-pasienter, fordi infiltrerte immunceller frigjør cytokiner, slik som TNFa, IL-6 og IL-1β, som i sin tur fremme den inflammatoriske prosessen eller nedbrytning av nerveceller 22. Videre auto-reaktive Th1-celler frigjør IFNy, som i sin tur stimulerer makrofager til å frigjøre TNFa, IL-1β og IL-23.
Dette manuskriptet beskriver induksjon av EAE, bestemmelse av immunceller fordeling og cytokinnivåer (mRNA) i forskjellige vev i EAE mus. -Celler ble isolert ved forskjellige tidspunkter i løpet av sykdomsforløpet for å tilveiebringe en tidsavhengig oversikt over de inflammatoriske prosesser som til slutt fører til lesjonsdannelse i CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ETIKK UTTALELSE: Våre eksperimentelle prosedyrer godkjent av etikkomiteen av Regierungspräsidium Darmstadt (Tyskland) og bekrefte overfor nasjonale og europeiske forskrifter. Alle forsøk ble gjort for å minimalisere dyr lidelse og redusere antall dyr benyttet.
1. EAE Model
- Induksjon av EAE modellen
- Bruk 10 til 13 uker gamle kvinnelige 129S4 / SvJae × C57BL / 6 mus for induksjon av EAE.
- Gir musene subkutan injeksjon, inn i den øvre og nedre del av ryggen, av den encefalitogene MOG 35 - 55 (myelin oligodendrocytt glykoprotein) peptid (200 ug), emulgert i 200 ul komplett Freund`s adjuvans (CFA) inneholdende 400 ug Mycobacterium tuberculosis.
Merk: Som et negativ, ikke-sykdomsfremkallende sham kontroll, ufullstendig Freunds adjuvans inneholdende Mycobacterium tuberculosis, i det samme volum og med samme rute, kan anvendes. - therEEtter, og igjen 24 timer senere, gir musene en intraperitoneal injeksjon av pertussis toksin (i totalt 0,2 ug, fortynnet i 200 ul fosfatbufret saltoppløsning, PBS). Bruke ubehandlede mus som kontrollgruppen, for å kunne sammenligne syk med friske dyr.
Merk: Det er også mulig å indusere EAE med 200-300 pg MOG 35 - 55 peptid 300 - 500 pg av Mycobacterium tuberculosis i CFA og 0,2 til 0,3 pg pertussis-toksin i et volum på 0,1 - 0,2 ml pr injeksjon. - Begynnelsen en uke etter injeksjonen, undersøke mus daglig for kliniske symptomer (se trinn 1.2.1)
Merk: Dagen for sykdomsutbruddet varierer i forskjellige eksperimenter, men under de betingelser som i vårt laboratorium, er dette rundt dag 11 og således, her dag 14 er definert som 3 dager etter sykdomsutbruddet. Alle musene i denne studien utviklet kliniske symptomer.
- Scoring av musene
- Gi din kliniske symptomer ved kliniske skårer som følger:0) tegn, 0,5) distal lammelse av halen, 1) fullstendig lammelse av halen, 1,5) limp tail og mild svakhet av bakbena, 2) limp tail og alvorlig svakhet i bakbeina, 2,5) slapp halen og lammelse av en bakben, 3) slapp halen og lammelse av begge bakbena, 3,5) lammelse av begge bakbena og svakhet av en forgrunnen lem (mus oppnå dette resultatet ble avlivet, i tråd med lokale etiske retningslinjer).
2. Utarbeidelse av enkeltceller for flowcytometrisystemer Analysis
Merk: antistoff blanding består av en fil CD45-Vioblue, 2 ul CD8-eFluor650, 0,5 mL CD11b-eFluor605, 0,5 mL F4 / 80-PE-Cy7, 1 ul CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 mL CD11c -AlexaFluor700, 1 ul CD19-APC-H7 og en ul Ly6G-APC-Cy7.
Merk: Hvis du tar blod, lymfeknute, milt og ryggmargen da prosedyren er som følger: Mus er dypt bedøvet med en kombinasjon av isoflURANE (2% i karbogen per minutt) og ketamin (100 mg / kg kroppsvekt). Neste åpne thorax, fjerne blod med en intracardial stokk og perfuse musene intracardially med kald PBS. Deretter fjerne lymfeknuter fulgt av milt og til slutt ryggmargen. Hvis du ikke trenger å perfuse musene intracardially deretter avlive mus henhold dyp anestesi ved luksasjon av halsen.
- Isolering av splenocytes
- Bedøver mus med en kombinasjon av isofluran (2% i karbogen per minutt) og ketamin (100 mg / kg kroppsvekt).
- Våt snitt med 80% isopropanol for å unngå forurensing med hår og åpne thorax lengderetningen, uten punktering dypere vev, ved hjelp av saks.
- Perfuse mus intracardially med kald PBS pH 7,0 23.
Merk: Milten ligger i venstre overlegen abdominal kvadrant under brystkassen. Hvis bare milten som skal undersøkes, kan dette organ fjernes før perfusjon, for å Retain alle celletyper av interesse. - Fjern milten og kuttet omtrent 1/8 og veie det. Lagre prøven i PBS på is.
- Presse miltvevet gjennom en 70 um mesh sikt (plassert over et 50 ml rør), ved hjelp av stempelet i en 2 ml sprøyte.
- Vask mesh med 5 ml PBS. Sentrifuger ved 1800 x g i 3 min. Resuspender pelleten i 500 pl lyserende oppløsning.
Merk: I denne fasen kan det være nødvendig å foreta en differensiell celletelling hvis senere, er en alternativ FACS analysemetode benyttet som anvender ikke-perler (se punkt 3). - Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur (RT) og tilsett 500 ul PBS. Sentrifuger i 6 minutter ved 650 xg ved romtemperatur (RT).
- Gjenta vasketrinn med 500 mL PBS. Kast supernatanten, cellepelleten suspenderes i 100 mL 0,2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS, tilsett 2 ul Fc-reseptor-1 (FcRI) blokkeringsbuffer og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Legg 13 mL entibody blanding, inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke, tilsett 500 ul PBS og sentrifuger i 6 minutter ved 650 x g ved romtemperatur. Kast supernatanten.
Merk: Produsenten er fargeprosedyre anbefaler en enkelt vask, men ytterligere reduksjon av bakgrunnsfarging kan oppnås ved eventuelt å gjenta vasketrinnet, en eller to ganger til. - Resuspender cellepelleten i 500 ul PBS (eller muligens rennende buffer for proteinseparasjon, for å eventuelt redusere celleklumpdannelse) og overføre den til den flowcytometri røret. Hold celler på is.
- Isolering av lymfeknuteceller
- Bedøver mus med en kombinasjon av isofluran (2% i karbogen per minutt) og ketamin (100 mg / kg kroppsvekt).
- Våt snitt med 80% isopropanol og åpne thorax lengderetningen ved hjelp av saks. Perfuse mus intracardially med kald PBS pH 7,0 23.
- For å isolere det inguinale lymfeknuter, fjerne huden forsiktig i området ved hip og plukke lymfeknute forsiktig ut av fettvev med pinsett. Vei lyske lymfeknute og lagre prøven i PBS på is.
Merk: Vi brukte inguinal lymfeknuter i våre studier fordi O`Connor et al. fant at høyt antall aktiverte monocytter, makrofager, nøytrofile granulocytter og T-celler var alle tilstede i inguinal lymfeknuter etter EAE induksjon 24. - Klem lymfeknute gjennom en 70 um mesh sikt (plassert over et 50 ml rør) ved hjelp av stemplet på en 2 ml sprøyte.
- Vask mesh med 5 ml PBS. Sentrifuger ved 2400 x g i 8 min. Resuspender cellepelleten i 100 ul 0,2% BSA / PBS, tilsett 2 mL FcRI blokkeringsbuffer og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Legg 13 ul antistoffblanding, inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke, tilsett 500 ul PBS og sentrifuger i 6 minutter ved 650 x g ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, resuspender cellepelleten i 300 ul PBS (eller en egnet buffer) og overføre dentil en flowcytometri rør.
- Isolering av blodlegemer
- Tilsett 50 mL 20 mM HEPES til 50 pl blod (stabilisert med EDTA) og tilsett 500 mL lyserende løsning. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur og tilsett 500 ul PBS. Sentrifuger i 6 minutter ved 650 x g ved romtemperatur. Fjern supernatant og gjenta vasketrinnet.
- Resuspender cellepelleten i 100 ul 0,2% BSA / PBS, tilsett 2 mL FcRI blokkeringsbuffer og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Legg 13 ul antistoffblanding, inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke, tilsett 500 ul PBS og sentrifuger i 6 minutter ved 650 x g ved romtemperatur. Kast supernatanten, resuspender cellepelleten i 300 ul PBS og overfør den til flowcytometri røret.
- Isolering av ryggmargs celler
- Bedøver mus med en kombinasjon av isofluran (2% i karbogen per minutt) og ketamin (100 mg / kg kroppsvekt).
- Våt snittområdet med 80% isopropanol og åpne brystkassen langsmed saks. Perfuse mus intracardially med kald PBS pH 7,0 23.
- Fukt innsnitt området på ryggen og gjør igjen en langsgående kutt med en skalpell og fjerne huden.
- Skjær ut lumbale delen av ryggraden (som innervates baklemmene) og skyll den med en PBS fylt sprøyte for å pakke ryggmargen. Skjær ut ca 1/3 av korsryggen ledningen, veie dette og oppbevar prøven i PBS på is.
- Sentrifuger ved 250 xg i 2 min ved 4 ° C. Kast supernatanten, tilsett 500 mL celle avløsning løsning og HBSS (1: 1). Tilsett 3 mg / ml kollagenase A og 1 enhet / ml DNase I, decollate cellene ved gjentatt pipettering opp og ned og inkuber i 30 minutter med risting ved 37 ° C ved 400 rpm.
Merk: Hvis foretrukket, kan cellesuspensjonen tømmes for forurensende myelin og cellerester ved tetthetsgradient-sentrifugering som kan forbedre følsomheten av flowcytometri måling, for derved å redusere bakgrunn autofluorescens end antall hendelser som trenger å bli kjøpt opp (se avsnitt 3.5). - Sentrifuger ved 250 xg i 2 min ved RT. Kast supernatanten, resuspender pelleten i 1 ml 10% føtalt kalveserum (FCS) / Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM) og decollate cellene på nytt ved gjentatt pipettering opp og ned.
- Sentrifuger ved 250 xg i 2 min ved RT. Gjenta vasketrinnet.
- Cellepelleten suspenderes i 1 ml PBS og presse ryggmargen gjennom en 70 um mesh sikt (plassert over et 50 ml rør) ved hjelp av stemplet på en 2 ml sprøyte.
- Vask mesh med 4 ml PBS. Sentrifuger ved 1800 x g i 3 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten, resuspender cellepelleten i 100 ul 0,2% BSA / PBS, tilsett 2 mL FcRI blokkerende reagens og inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Legg 13 ul antistoffblanding, inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke, tilsett 500 ul PBS og sentrifuger i 6 minutter ved 650 x g ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, resuspender cellen pellet i 500 ul PBS (eller en egnet buffer) og overføre den til den flowcytometri røret.
3. flowcytometrisk analyse
- Titrere alle antistoffer på forhånd for å bestemme optimale konsentrasjoner som beskrevet av Olesch et al., 25.
- Bruk antistoff-fange kompensasjon perler for ensfarget kompensasjon for å skape multi-farge kompensasjon matriser i henhold til produsentens anvisninger.
- Styr instrumentkalibrering daglig bruk av spesifikke perler i henhold til produsentens anvisninger.
- Direkte før flowcytometri måling, tilsett 30 mL flowcytometrisk absolutt tall standard til cellene (for isolering se punkt 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) for å bestemme absolutte celletall. I stedet for å bruke telle perler celler kan telles.
- Ta opp prøver (celler fra milt, lymfeknuter og blod: 100.000 hendelser, ryggmarg: 500.000 hendelser) i et flowcytometer ennd analysere ved hjelp av spesifikke flowcytometri programvare.
- Åpne flowcytometri programvare og legge FCS 3,0 filer ved å trykke på knappen "legg prøver".
- Åpne lagt filen ved å dobbeltklikke. Juster kanaler for x- og y-aksen. Slik velger du cellen bestander av interesse skape en port (se figur 4).
4. Kvantitativ PCR analyse
- Isolering av mRNA og transkripsjon til cDNA
- Pakk ut mRNA fra ryggmargen (1/3), milt (1/8) og inguinal lymfeknuter ved fenol-kloroform og utfelles med etanol 26.
- For dette, homogenisere vevet i 1 ml guanidiniumtiocyanat-fenol-blanding, inkuber i 10 min. Tilsett 200 ul kloroform og inkuberes på nytt i 10 min.
- Etter et sentrifugeringstrinn (18 000 xg i 15 minutter ved 4 ° C), vaske det øvre vandige fase med 500 mL isopropanol og sentrifuge (18 000 x g i 8 minutter ved 4° C).
- Vask pelleten med 500 mL etanol og etter et sentrifugeringstrinn (18 000 xg i 5 minutter ved 4 ° C), tørke pellet i vakuum konsentratoren (5 min ved 30 ° C). Deretter resuspender pelleten i 30 mL vann.
- Hvis du vil trekke mRNA fra blod, sentrifuger 500 mL EDTA-stabilisert blod (300 xg 10 min 4 ° C).
- Ta buffy coat, inneholdende hvite blodceller, og fortynnes i 1 ml lyseringsløsning (150 mM NH4CI, 100 mM NaHCO3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4).
- Etter 10 minutters inkubering ved romtemperatur, sentrifuger cellene ved 650 x g i 6 minutter, og deretter vaskes to ganger med PBS.
- Ekstrahere mRNA fra hvite blodlegemer (WBC) ved hjelp av et kit for RNA-ekstraksjon i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utfør cDNA syntese ved hjelp av et kit for cDNA syntese inkludert tilfeldige heksamer i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk 200 ng mRNA for CDNEn syntese.
- Pakk ut mRNA fra ryggmargen (1/3), milt (1/8) og inguinal lymfeknuter ved fenol-kloroform og utfelles med etanol 26.
- kvantitativ PCR
- For å kvantifisere mengden av et bestemt mRNA, bruke en ul cDNA, 1fiM forover / bakover primer og et fluoriserende DNA-bindende fargestoff i henhold til produsentens instruksjoner 27. Se tabell 1 for de sekvenser for primersettene. Måle CT-verdiene av IL-1β, IL-6, IL-23, IFNy, TNFa og PPIA (peptidyl-prolyl-isomerase) ved hjelp av en kvantitativ PCR system.
- For å bestemme den relative mRNA uttrykket bruker komparative CT (syklus terskel) -metoden 27.
- For dette, normal CT-verdiene av målgener til uttrykket nivåer av PPIA ved å subtrahere den gjennomsnittlige CT-verdi på PPIA fra målgenet, slik det er beskrevet i tidligere studier (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Deretter beregner de såkalte ΔΔCT-verdier, ved hjelp som, normalisere ΔCT-verdierav målgener fra EAE mus til ekspresjonsnivået av målgener fra ubehandlede mus, igjen ved å subtrahere den gjennomsnittlige ΔCT-verdien i den ubehandlede mus fra den ΔCT-verdien i EAE mus.
- For å få den relative mRNA uttrykk av målet genet, beregne forholdet ved hjelp av følgende formel: 2 - ΔΔct.
- Test spesifisiteten av hver primer. Bestem forsterket fragment størrelse med en 2% agarosegel 31. Fragmentet størrelse er vist i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 gir en skjematisk oversikt over de forskjellige fremgangsmåter som er beskrevet i denne artikkelen. 1) Mus som mottar en injeksjon av MOG 35-55 antigen og utvikle de første kliniske symptomene etter 10,7 ± 0,3 dager 28. En representativ sykdomsforløpet av EAE mus er vist i figur 1. 2) Forskjellige vev (milt, lymfeknuter, lumbar ryggmargen) og blod blir trukket ut fra styre- og EAE mus ved forskjellige tidspunkter under den prekliniske fase (dag 2, dag 4 , dag 6), under utbruddet av sykdommen (dag 10) og under den akutte fase av sykdommen (dag 12, dag 14). 3) mRNA-ekspresjon profilen for cytokiner som regulerer EAE utvikling, blir bestemt i forskjellige vev hentet på ulike tidspunkter i løpet av sykdomsforløpet, ved hjelp av kvantitativ PCR. 4) Enkeltceller celler~~POS=HEADCOMP er isolert fra ulike vev hentetved ulike tidspunkt i løpet av sykdomsforløpet og immunceller fordelingen bestemmes ved hjelp av flowcytometri.
I milt og lymfeknuter, blir T-celler og B-celler observert som det mest fremtredende celletype. I motsetning til lymfeknuter, i milten, i tillegg, et høyt antall monocytter og nøytrofiler er til stede. Alle immunceller viser en forbigående økning i lymfeknutene i den akutte fase, mens bare makrofager, B-celler, T-celler og neutrofiler økning i milten. I blod, alle immunceller øker forbigående under preklinisk fase. I ryggmargen er en sykdom avhengig økning i alle immunceller observert, bortsett fra monocytter, noe som antagelig differensierer til makrofager etter sin inngang i ryggmargen (figur 2). CD4 + og CD8 + T-celler viser tilsvarende endringer i milt, lymfeknute og blodet i løpet av de forskjellige sykdomsforløp. Erong cellene som trenger ned til ryggmargen, økningen i CD4 + T-celler var sterkest (figur 3). I figur 4 er det gating-strategi for bestemmelse av de forskjellige cellepopulasjoner vist. I detalj, ble cellepopulasjoner som er beskrevet i dette manuskriptet identifisert som følger: monocytter (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c-, CD11b +), makrofager (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD11c-, CD11b +, F4 / 80hi), nøytrofile (CD45hi, CD3-, CD11b +, Ly6G +), dendrittiske celler (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c +), B-celler (CD45hi, CD3-, CD19 +), T-celler (CD45hi, CD3 +) CD4 + T-celler (CD45hi, CD3 +, CD4 +) og CD8 + T-celler (CD45hi, CD3 +, CD8 +). Antallet av celler er relatert til mengden av vev (vekt av milt, lymfeknuter, lumbar ryggmargen) eller blodvolum, og dermed gjenspeiler den absolutte legemer. Det er imidlertid mulig å uttrykke celletypene i prosent av totale celler målt.
i Lymph noder, blir ekspresjon av IL-23 mRNA forbigående økning i preklinisk fase, mens ekspresjonen av IL-6 mRNA blir øket i en sykdom avhengig måte. I milten, øker IL-6 og IL-23 mRNA-ekspresjon transient i den prekliniske fase, mens ved utbruddet av sykdommen, blir IL-1β mRNA-ekspresjon hevet. I blod, er ekspresjon av TNFa-mRNA øket i en sykdom avhengig måte. I ryggmargen, TNFa, IL-1β og IFNy økning i den akutte fase, mens IL-6 er oppregulert under utbruddet fasen (figur 5).
Figur 1: Skjema over arbeidsflyten for induksjon og Immunologisk Vurdering av EAE. 1) EAE induseres i mus fører til utvikling av kliniske symptomer. Kliniske symptomer er, klassifiserted av kliniske score, som følger: 0) tegn, 0,5) distal lammelse av halen, 1) fullstendig lammelse av halen, 1,5) limp tail og mild svakhet av bakbena, 2) limp tail og alvorlig svakhet i bakbeina , 2.5) slapp halen og lammelse av en bakben, 3) slapp halen og lammelse av begge bakbena. Antall mus som brukes i figuren er vist var 7. Figuren har blitt forandret fra Barthelmes et al., 28. To) Musene avlives ved forskjellige tidspunkter i løpet av sykdomsforløpet, milt, inguinale lymfeknuter, blod og lumbale ryggmargen utpakkede og enkeltceller isolert fra disse vev. 3) immuncelle fordeling i ulike vev, som bestemmes av flowcytometri. 4) mRNA uttrykk for forskjellige cytokiner i de ulike vev, som bestemmes av kvantitativ PCR. klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 2:. Immun Cell Distribution, Bestemmes av FACS (fluorescens-aktivert cellesortering) Analyse i Spleen, Lymfeknute, blod og Ryggmargs Prøver fra EAE Mus ved ulike sykdomsstadier I forsøket vist, antall mus per gruppe var to - 10. fordelingen av nøytrofile / monocytter i blodet og nøytrofile / makrofager i ryggmargen er tilpasset og modifisert fra Barthelmes et al 28.. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: CD4 + T-celler og CD8
Figur 4: gating Strategi for flowcytometrisk analyse av T-celler, B-celler, nøytrofile, monocytter, dendrittiske celler og makrofager fra Spinal Cord av EAE Mus på dag 12.) En tomt på SSC / CD45 fra alle celler. Gate. CD45 + celler B) En tomt på FSC-H / FSC-W fra CD45 + celles. Gate: enkeltceller C) En tomt på SSC-A / FSC-A fra enkeltceller.. Gate: levedyktige celler. D) En tomt på FSC-H / CD3 fra levende celler. Gate: CD3 + og CD3 - celler E) En tomt på CD4 / CD8 fra CD3 + -celler.. Gate: CD4 + CD8 - (CD4 + T-celler) og CD4 - CD8 + (CD8 + T-celler) F) En tomt på CD19 og Ly6G / CD11b fra CD3 - celler.. Gate: CD19 + CD11b - celler (B-celler), Ly6G + CD11b + celler (nøytrofile) og CD19 - Ly6G - celler G) en tomt på CD11c / CD11b celler fra CD19 - Ly6G - celler. Gate CD11c + celler (dendrittiske celler ) og CD11c - celler H) en tomt på SSC / F4 / 80 fr.om CD11c - celler. Gate: F4 / 80 - celler (monocytter) og F4 / 80 + celler (makrofager). En representant tomt på 9 vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Cytokin Profile (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i prøvene fra EAE Mus på ulike sykdomsstadier A) lymfeknute, B) milt, C) blod og D) ryggmarg. de mRNA uttrykk nivåer ble normalisert til peptidyl propyl isomerase A (PPIA) og ble beregnet ved bruk av mRNA nivået av ubehandlet mus på samme alder. Målingene ble utført i tre eksemplarer. Antall mus per gruppe var 2 - 3. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standard feil (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gene | framover | omvendt | fragment størrelse (Bp) | ||||
| IL-1β | CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA | CCGACAGCACGAGGCTTT | 76 | ||||
| IL-6 | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | 76 | ||||
| IL-23 | GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC | GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA | 127 | ||||
| IFNy | CACGGCACAGTCATTGAAAGC | CACCATCCTTTTGCCAGTTCC | 118 | ||||
| TNFa | TGACAAGCCTGTAGCCCACG | GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC | 178 | ||||
| PPIA | GCTGGACCAAACACAAACGG | GCCATTCCTGGACCCAAAAC | 144 | ||||
Tabell 1: Primerpar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EAE modellen beskrevet her har fått mest oppmerksomhet som en modell for MS og blir rutinemessig anvendt ved testing av terapeutiske strategier for MS 32. Musen sykdom oppviser mange kliniske og histologiske trekk ved MS og skyldes induksjon av autoimmunitet til neuronale antigener. Sensibilisering til myelin-antigener er forbundet med blod-hjerne-barrieren dysfunksjon og derved immuncelleinfiltrasjon inn i CNS. Våre funn viser at immunceller øker forbigående i lymfeknutene i den akutte fasen. Milt-T-celler og B-celler reduseres i den prekliniske fase av sykdommen. I sirkulerende blod, T-celler, B-celler, dendrittiske celler og monocytter øker forbigående i den prekliniske fase, mens neutrofiler øke sykdom avhengig. Til slutt, i ryggmargen, en økning i immunceller er påvisbar (figur 2). Disse data indikerer at T-celler og B-celler migrere fra milten, som virkeret reservoar for disse cellene, til lymfeknutene hvor de aktiveres og sprer. Deretter vandrer de via sirkulasjonen inn i ryggmargen. Neutrofiler, monocytter og dendrittiske celler, på den annen side, migrere fra benmargen gjennom sirkulasjonen inn i CNS.
Våre data indikerer at i ryggmargen, IFNy, TNFa og IL-1β er regulert i en sykdom avhengig måte, mens IL-6 er transient oppreguleres ved utbruddet av sykdommen. Disse data støtter hypotesen om at EAE patologi er drevet av Th1 og Th17-celler. Th1-celler frigjør IFNy, som i sin tur aktiverer makrofager til å frigjøre TNFa og IL-1β 33. Videre er IL-6 er kjent for å drive differensiering av Th1 og Th17-celler og derved fremme utviklingen av EAE 34.
Dagen for inntreden av kliniske symptomer, og alvorlighetsgraden av sykdommen er variabel i EAE mus. Basert på vår erfaring, er det flere reasons for dette. Mus eksponert for stress under preklinisk fase viser en redusert alvorlighetsgrad av sykdom og en forsinkelse i sykdomsutbruddet. Huset til mus påvirker også alvorligheten av EAE og også dagen for debut. Nylig ble det vist at kommensal bakterieflora hos mus påvirke utviklingen av EAE 35 og ulike bolig situasjoner kan påvirke mikrobiomer og derved, EAE patologi. Videre er det svært viktig alltid å bruke nylaget pertussis toksin. Pertussis-toksin skader blod-hjerne barrieren som er en forutsetning for utviklingen av EAE. Bruk ikke emulgert MOG 35-55 peptid etter utløpsdatoen. Alderen på mus påvirker også EAE patologi. Således er det noen regler som må oppfylles for å frembringe en reproduserbar EAE modellen. Bruk mus i alderen mellom 10 og 13 uker og mus fra samme leverandør, om mulig. Dersom musene er bestilt fra en ekstern leverandør, la musene å akklimatisere for touker i dyrehuset. Håndter mus forsiktig før EAE induksjon, slik at de blir vant til håndtering. Unngå unødvendig håndtering etter EAE induksjon. Gi musene med mat og vann som de lett kan komme så snart de viser kliniske symptomer. Hvis musene er å bli behandlet med et medikament, er det best å blande det inn i maten eller drikkevannet, for å unngå confounding spenningseffekter. Dersom sonde eller en injeksjon er viktig for medikamentadministrering, er det viktig å bruke den samme rute for kjøretøyet.
I tillegg til primær progressiv EAE modellen beskrevet her, relapsing-remitting EAE modeller finnes også. De forskjellige sykdomsforløpet blir indusert ved administrering av forskjellige antigener i forskjellige musestammer. Således er anvendelsen av MOG 35 - 55 i musestammer, såsom C57BL / 6, Sv129, B10, NOD og Biozzi mus, fører til en primær progressiv sykdom form. Interessant, dagen for starten er forskjellig i de forskjellige musestammer. MensC57BL / 6, SV129 og B10 mus utvikler første kliniske symptomer fra ca dag 11 til 12, Biozzi mus viser første kliniske symptomer etter 21 dager 36. I en tidligere studie ble det vist at 129S4 / SvJae × C57BL / 6 hybrider først vise kliniske symptomer fra ca dag 11 28. Injeksjon av proteolipidprotein (PLP) 131-151 fører i SJL mus til induksjon av en relapsing-remitting sykdomsforløpet 37. Den beste EAE modellen å bruke vil avhenge av fokus for forskningen. Dermed, hvis tilbakefall fasen er av interesse, tilbakefall-remitting modellen bør benyttes mens hvis sykdomsutbruddet er hovedfokus, bør den progressive modellen brukes. Hvis rollen som en bestemt protein skal undersøkes i EAE modellen, ved hjelp av knock-out mus, er det viktig å huske på at ikke alle stammer kan brukes til å indusere EAE og eventuelt tilbakekryssing av knock-out belastning på en sensitiv stamme er nødvendig.
De tre mest brukte types av dyremodeller av MS er (1) autoantigen indusert EAE; (2) viralt induserte spontan, kronisk demyelinerende sykdom, og (3) toksin-indusert demyelinisering 38. EAE-modeller er kjennetegnet ved induksjon av inflammasjon og autoimmune responser ved anvendelse av en autoantigenic peptid slik som myelin oligodendrocytt protein eller proteolipid protein 38. Spontan EAE utvikler seg i transgene mus som overuttrykker en T-celle-reseptor mot et peptid med myelin oligodendrocytt-proteinet 39. For å indusere viralt-indusert kronisk inflammasjon, kan en neurotrofisk infeksjon av sentralnervesystemet bli indusert, for eksempel med Theiler`s murine encephalomyelitis virus. Celler infisert med viruset blir angrepet av både T-celler og en humoral respons og fører derved til kronisk demyelinisering 40,41. Toksin-indusert demyelinisering kan induseres for eksempel med kobberet chelator cuprizone 42. Denne modellen fører spesielt til demyelinasjon fordi cuprizone angriper oligodendrocytes og fører derved til aktivering av astroglia og microglia, mens inflammatoriske prosesser bare spille en mindre rolle. Etter klarering av toksinet, er nye oligodendrocytes generert og en ny myelin skjede er dannet. Bruken av disse tre modeller, på en komplementær måte, tillater evaluering av medikamenteffekter på ulike sider av patogenesen av MS, fordi modellene varierer med hensyn til inflammatoriske og immun og demyeliniserende prosesser. I EAE og virus-induserte modell, inflammasjon og autoimmune prosesser i hovedsak drive sykdommen, mens i toksin-induserte modell, demyelinerende og remyelinating prosesser er fremherskende. For preklinisk testing av potensielle medikamenter for MS behandling, minst tre modeller, en toksin-indusert modell, et tilbakefall-remitting EAE og en primær progressiv EAE eller et viralt-indusert modellen bør brukes til å verifisere effektiviteten av stoffet.
Den EAE modellen beskrevet hennee kan brukes for å få ytterligere innsikt i mekanismen av utviklingen av MS-lignende sykdomsprosess, å identifisere viktige cellulære førere av sykdommen, slik som Th1, Th17 og B-celler 43,44. Jo bedre forståelse av de inflammatoriske og immun prosessene som er involvert i utviklingen av MS og de prosesser som fremmer og løse lesjoner, jo mer sannsynlig er det at nye behandlingsstrategier kan utvikles.
Likevel EAE modellen beskrevet her bare har noen egenskaper til felles med MS, og har noen klare forskjeller fra sykdom hos mennesker. Den mest fremtredende forskjellen er at MS-pasienter varierer mye i sykdom presentasjon, som ikke er gjengitt i EAE modellen. Dette kan skyldes ulike lesjon mønstre i MS-pasienter og EAE mus og til det faktum at mus er innavlede stammer. I EAE mus, homogene lesjoner er mest fremtredende i ryggmargen, mens det i MS-pasienter, hovedsakelig heterogene lesjoner erfinnes i hjernen 45,46. Videre MS og EAE dele avgjørende bidrag av Th1-celler og Th17-celler for deres utvikling, men i motsetning til MS, CD8 + T-celler spiller en underordnet rolle i patologien EAE 33. I konklusjonen, fokuserer EAE modellen hovedsakelig på den kombinerte effekten av autoimmunitet, inflammatoriske prosesser og nevrodegenerasjon mens demyeliniserende prosesser er mindre mottagelig for selektiv vurdering. Derfor kan andre dyremodeller slik som den cuprizone modell anvendes for distinkt studiet av demyeliniserende prosesser 47. EAE-modellen er ufullkommen, men ikke desto mindre en nyttig modell MS-33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
| Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
| Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
References
- McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
- Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
- Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
- Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
- Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
- Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
- Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
- Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
- Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
- Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
- Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
- Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
- Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
- Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
- Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
- Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
- Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
- Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
- Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
- Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
- Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
- Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
- Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
- Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
- Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
- Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
- 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
- Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
- Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
- Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
- Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
- Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
- Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
- El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
- Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
- Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).
