Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях

Published: May 8, 2016 doi: 10.3791/53933
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 1, 2
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME
* These authors contributed equally

Abstract

Рассеянный склероз, как предполагают, воспалительное аутоиммунное заболевание, которое характеризуется образованием поражения центральной нервной системы (ЦНС), что приводит к когнитивной и двигательных нарушений. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является полезной животной моделью MS, так как он также характеризуется образованием поражением ЦНС, нарушение двигательной и также определяется аутоиммунных и воспалительных реакций. Одна из моделей EAE индуцируют с пептидом , полученным из миелин олигодендроцитов белка (MOG) 35-55 у мышей. Мыши EAE разработать прогрессивное течение заболевания. Этот курс делится на три фазы: доклинические фазы (день 0 - 9), начало заболевания (день 10 - 11) и острой фазы (день 12 - 14). МС и ЕАЕ индуцируются аутореактивных Т-клеток, которые проникают в ЦНС. Эти Т-клетки секретируют хемокины и цитокины, которые приводят к набору дополнительных иммунных клеток. Таким образом, распределение иммунных клеток в спинном мозге Dйти во время трех фаз заболевания была исследована. Для того, чтобы выделить момент времени болезни, при которой начинается активация / пролиферации / накопление Т-клеток, В-клеток и моноцитов, распределение иммунных клеток в лимфатических узлах, селезенке и крови также оценивали. Кроме того, уровни ряда цитокинов (IL-1 & beta;, IL-6, IL-23, TNF-alpha, IFN & gamma;) в трех фазах заболевания были определены, чтобы получить представление о воспалительных процессах заболевания. В заключение отметим, что данные обеспечивают обзор функционального профиля иммунных клеток в процессе EAE патологии.

Introduction

Рассеянный склероз (РС) и соответствующая модель животного, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), показывают, аутоиммунные изменения нейровоспаления в центральной нервной системе (ЦНС). Ранние активные поражения MS и EAE характеризуются наличием проникших иммунных клеток. Этиология МС остается неизвестным, но широко считается вовлечь разрушение миелина, опосредованного аутореактивных Т-клеток. Эти аутореактивные Т-клетки секретируют провоспалительные цитокины и хемокины, которые привлекают другие иммунные клетки, такие как В-клетки, моноциты и нейтрофилы из кровообращения. Моноциты дифференцируются в макрофаги. Интерферон гамма (IFN & gamma;), секретируемые аутореактивного Т-клетки поляризует макрофаги в текущем провоспалительных макрофагов. Провоспалительных макрофаги высвобождения цитокинов и активных форм кислорода, которые способствуют апоптозу в олигодендроциты. Смерть олигодендроцитов приводит к демиелинизации. Кроме того, В-клетки дифференцировались в рКлетки Lāsma и высвобождения аутоантитела против миелиновой оболочки, в конечном счете, приводит к ухудшению миелина. Потеря миелина приводит к деградации аксонов и нейронов и тем самым к образованию участков поражения в ЦНС , которые представляют собой основную характеристику МС 1. На периферии, Т-клетки и В-клетки активируются в лимфатических узлах, они пролиферируют в селезенке и мигрируют через циркуляцию в центральную нервную систему. Моноциты и нейтрофилы пролиферировать в костном мозге, а также мигрируют через циркуляцию в центральную нервную систему.

Лейкоцитов из костного мозга, селезенки и лимфатических узлов в кровь или из кровотока в ЦНС является многоэтапный процесс, который зависит от нескольких факторов, в том числе молекулярных взаимодействий между лейкоцитами и эндотелием, опосредованных хемокинов и рецепторов хемокинов. Производство хемокинов различными типами клеток могут быть вызваны во время иммунной reactioN цитокинами , такими как фактор некроза опухоли альфа (ФНО), IFN & gamma ; и интерлейкина-6 (ИЛ-6), который впоследствии вербует иммунные клетки к месту воспаления 2,3. Иммунные клетки представляют подмножество рецепторов хемокинов на их поверхности, в зависимости от типа клеток и пути миграции в воспаленном участке. Таким образом, CXCR2, CCR1 и CXCR1 экспрессируются на зрелых нейтрофилов в костном мозге и крови 4, и связывание его лигандов, CXCL2, CCL5 или CXCL6, соответственно, активирует нейтрофилы и способствует их адгезии к эндотелию и в дальнейшем, миграцию клеток в ткани 5-9. CCL2 и CCL20 привлекают моноциты и клетки Th1 / Th17 10, которые выражают CCR2 11 и CCR6 12, соответственно. CCR1 и CCR5, выраженное различными типами клеток, включая Т - клетки, моноциты и макрофаги 13, связывают CCL3, CCL5 и CCL7 и усиливает свою активность во время МС 14. CXCR3 экспрессируется на Т-клетках и связывает CCL9, CCL10 иCCL11 15.

Одной из основных стратегия лечения рассеянного склероза является истощение иммунных клеток или предотвращение инфильтрации клеток иммунной в ЦНС. Таким образом, блокада специфических рецепторов хемокинов было исследовано в EAE. Антагонизм или генетическое удаление CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 или CXCR2 19 уменьшает EAE патологии, в то время как антагонизм или генетического удаления CCR1 20, 20 CCR5 или CXCR3 21 не снижали патологии. Следовательно, экспрессия специфических рецепторов хемокинов на лейкоцитах является решающим для проникновения последнего в ЦНС и диктует ход EAE.

Истощение иммунных клеток является эффективной стратегией для лечения пациентов с рассеянным склерозом, так как внедренные иммунные клетки высвобождают цитокины, такие как TNF & alpha ; , IL-6 и IL-1 , который, в свою очередь, способствуют воспалительного процесса или деградацию нейронов 22. Кроме того, ав-реактивные Th1-клетки, релиз IFN & gamma; в свою очередь, стимулирует макрофаги к выпуску TNF-alpha, IL-1 & beta; и IL-23.

Эта рукопись описывает индукцию ЭАЭ, определения распределения иммунных клеток и уровни цитокинов (мРНК) в различных тканях у мышей EAE. Клетки были выделены в различные моменты времени в течение болезни, чтобы обеспечить обзор воспалительных процессов, которые в конце концов приводят к образованию поражений в ЦНС зависит от времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Наши экспериментальные процедуры одобрены Комитетом по этике Regierungspräsidium Дармштадт (Германия) по и подтвердить к национальным и европейским нормам. Все усилия были сделаны, чтобы минимизировать страдания животных и уменьшить количество используемых животных.

1. EAE модель

  1. Индукция модели EAE
    1. Используйте 10- до 13-недельного возраста самка 129S4 мышей / SvJae × C57BL / 6 для индукции EAE.
    2. Дайте Мышей подкожную инъекцию, в верхней и нижней части спины, на энцефалитогенных МОГ 35 - 55 (миелин олигодендроцитов гликопротеин) пептида (200 мкг), эмульгированного в 200 мкл полной Freund`s адъювантной (CFA) , содержащей 400 мкг микобактерии туберкулеза.
      Примечание: В качестве отрицательного, немедицинские индуцирующего контроля мнимого, неполный адъювант Фрейнда , содержащий микобактерии туберкулеза, в том же объеме и по тому же маршруту, могут быть использованы.
    3. Thereafter, и снова 24 часа позже, дают Мышам внутрибрюшинно инъекцию коклюшного токсина (всего 0,2 мкг, разведенного в 200 мкл фосфатно-буферным солевым раствором PBS). Использование необработанных мышей в качестве контрольной группы, чтобы иметь возможность сравнить больное со здоровыми животными.
      Примечание: Кроме того , можно индуцировать EAE с 200 - 300 мкг MOG 35 - 55 пептида, 300 - 500 мкг микобактерий туберкулеза в CFA и 0,2 - 0,3 мкг коклюшного токсина в объеме 0,1 - 0,2 мл на инъекцию.
    4. Начиная через одну неделю после инъекции мышам ежедневно EXAMINE для клинических симптомов (см шаг 1.2.1)
      Примечание: В день начала болезни варьирует в различных экспериментах, но в условиях, в нашей лаборатории, это около 11-й день и, таким образом, здесь день 14 определяется как через 3 дня после начала заболевания. У всех мышей в данном исследовании разработаны клинические симптомы.
  2. Скоринг мышей
    1. Классифицировать клинические симптомы клинической оценки следующим образом:0) Нет признаков, 0,5) дистальный паралич хвоста, 1) полный паралич хвоста, 1,5) хромать хвост и мягкий слабость задних ног, 2) хромать хвост и сильная слабость задних ног, 2,5) хромать хвост и паралич одна задняя нога, 3) хромать хвост и паралич обеих задних конечностей, 3,5) паралич обеих задних конечностей и слабость одной передней конечности (мыши достигающие этот счет были подвергнуты эвтаназии, в соответствии с местными этическими нормами).

2. Получение одиночных клеток для анализа потока цитометрии

Примечание: Смесь антитело состоит из 1 мкл CD45-Vioblue, 2 мкл CD8-eFluor650, 0,5 мкл CD11b-eFluor605, 0,5 мкл F4 / 80-PE-Cy7, 1 мкл CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 мкл CD11c -AlexaFluor700, 1 мкл CD19-APC-H7 и 1 мкл Ly6G-APC-Cy7.

Примечание: Если вы берете кровь, лимфатические узлы, селезенка и спинного мозга, то процедура выглядит следующим образом: Мыши глубоко анестезию комбинацией isoflurane (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела). Затем откройте грудную клетку, удалить кровь с внутрисердечной палкой и заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS. Затем удалите лимфатические узлы с последующим селезенке и, наконец, спинной мозг. Если вам не нужно заливать мышей внутрисердечно затем усыпить мышей под глубокой анестезией вывих шеи.

  1. Выделение спленоцитов
    1. Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
    2. Влажная зона надрез с 80% изопропилового спирта, чтобы избежать каких-либо загрязнений с волосками и открыть грудной клетки в продольном направлении, не прокалывая глубокие ткани, с помощью ножниц.
    3. Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
      Примечание: Селезенка расположена в левой верхней абдоминальной квадранте под грудной клеткой. Если только селезенку изучаться, этот орган может быть удален перед перфузией для того, чтобы Retaiп все типы клеток, представляющих интерес.
    4. Удалить селезенку и отрезать примерно 1/8 и взвесить его. Храните образец в PBS на льду.
    5. Сжать ткань селезенки через сито 70 мкм (помещенном над 50 мл трубки), с помощью плунжера 2 мл шприца.
    6. Промойте сетку с 5 мл PBS. Центрифуга при 1800 мкг в течение 3 мин. Ресуспендируют осадок в 500 мкл раствора лизиса.
      Примечание: На этом этапе, может быть необходимо, чтобы сделать рассчитывать дифференциальный клетка, если, позже, альтернативный метод анализа FACS используется, который не использует бусинки (смотри раздел 3).
    7. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) и добавляют 500 мкл PBS. Центрифуга в течение 6 мин при 650 мкг при комнатной температуре (RT).
    8. Повторите этап промывки с 500 мкл PBS. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) / PBS, добавляют 2 мкл Fc-рецептора-1 (FcRI) блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    9. Добавить 13 мклtibody смесь, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавьте 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре. Удалите супернатант.
      Примечание: Процедура окрашивания производителя рекомендует единую стирку, но дополнительное снижение фонового окрашивания может быть достигнуто за счет необходимости повторение стадии отмывки больше один или два раза.
    10. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS (или, возможно, работает буфер для разделения белков, чтобы потенциально уменьшить клеток комков) и передать его в проточной цитометрии трубки. Сохранить клетки на льду.
  2. Выделение клеток лимфоузлов
    1. Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
    2. Влажные Разрез область с 80% изопропилового спирта и открыть грудную клетку в продольном направлении с помощью ножниц. Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
    3. Для того, чтобы изолировать паховый лимфатический узел, осторожно снимите кожу в области Hiр и выбрать лимфатический узел тщательно из жировой ткани с щипцами. Взвесьте паховый лимфатический узел и хранить образцы в PBS на льду.
      Примечание: Мы использовали паховые лимфатические узлы в наших исследованиях , так как О'Коннор и др. обнаружили , что большое число активированных моноцитов, макрофагов, нейтрофилов и Т - клеток , были все присутствующие в паховых лимфатических узлах после индукции ЕАЕ 24.
    4. Сожмите лимфоузел через сито 70 мкм (расположенную над 50 мл трубки), используя поршень 2 мл шприца.
    5. Промойте сетку с 5 мл PBS. Центрифуга при 2400 мкг в течение 8 мин. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    6. Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре.
    7. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл PBS (или подходящего рабочего буфера) и передать егок проточной цитометрии трубки.
  3. Выделение клеток крови
    1. Добавить 50 мкл 20 мМ HEPES до 50 мкл крови (стабилизированный с ЭДТА) и добавляют 500 мкл раствора Lysing. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре и добавляют 500 мкл PBS. Центрифуга в течение 6 мин при 650 мкг при комнатной температуре. Удалите супернатант и повторите стадию промывки.
    2. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    3. Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл PBS и передачи его в проточной цитометрии трубки.
  4. Выделение клеток спинного мозга
    1. Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
    2. Влажная зона надрез с 80% изопропилового спирта и открыть грудной клетки в продольном направлениис помощью ножниц. Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
    3. Влажные области надреза на спине и сделать снова продольный разрез скальпелем и снимите кожу.
    4. Вырежьте поясничного отдела позвоночника (который иннервирует задние конечности) и промойте его с PBS заполненный шприц для извлечения спинного мозга. Вырез примерно 1/3 поясничном шнура, весить это и хранить образцы в PBS на льду.
    5. Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, добавляют 500 мкл раствора открепления клеток и HBSS (1: 1). Добавить 3 мг / мл коллагеназы А и 1 ед / мл ДНКазы I, разрывать клетки путем неоднократного вверх и вниз пипеткой и инкубировать в течение 30 мин при встряхивании при 37 ° C при 400 оборотах в минуту.
      Примечание: При желании суспензию клеток может быть очищен от загрязняющего миелина и клеточных остатков центрифугирования в градиенте плотности, которые могут улучшить чувствительность проточной цитометрии измерения, таким образом, уменьшая фон автофлюоресценции А.Н.d число событий, которые должны быть приобретены (смотри раздел 3.5).
    6. Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок в 1 мл 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) / минимальная поддерживающая среда Дульбекко (DMEM), и разрывать клетки снова многократным вверх и вниз пипеткой.
    7. Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Повторите шаг стирки.
    8. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл PBS и сжимают спинной мозг через сито 70 мкм (помещенном над 50 мл трубки), используя поршень 2 мл шприца.
    9. Промойте сетку с 4 мл PBS. Центрифуга при 1,800 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующий реагент и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    10. Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре.
    11. Удалите супернатант, ресуспендируют Pelle клетокт в 500 мкл PBS (или подходящего рабочего буфера) и передать его на поточной цитометрии трубки.

3. Cytometric анализ потока

  1. Titrate все антитела заранее , чтобы определить оптимальные концентрации , как описано Olesch и др. 25.
  2. Использование антител захвата компенсации шарики для компенсации одноцветной для создания многоцветных матриц компенсации в соответствии с инструкциями изготовителя.
  3. Контроль калибровки прибора ежедневно, используя специальные шарики в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Непосредственно перед проточной цитометрии измерения, добавьте 30 мкл проточной цитометрии абсолютного количества стандарта к клеткам (для изоляции смотри раздел 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) для определения абсолютного количества клеток. Вместо того чтобы использовать подсчета бусинки клетки могут быть подсчитаны.
  5. Возьмите образцы (клетки из селезенки, лимфатических узлов и крови: 100000 событий, спинного мозга: 500000 событий) в проточном цитометрей анализ с помощью специального программного обеспечения цитометрии потока.
    1. Откройте программное обеспечение проточной цитометрии и добавьте FCS 3.0 файлы, нажав на кнопку "добавить образцы".
    2. Откройте файл добавлен двойным щелчком. Настройте каналы для х- и у-оси. Для выбора популяции клеток , представляющих интерес создать ворота (смотри рисунок 4).

4. Количественный ПЦР анализ

  1. Выделение мРНК и транскрипции в кДНК
    1. Извлечение мРНК из поясничного отдела спинного мозга (1/3), селезенка (1/8) и паховых лимфатических узлов с помощью фенол-хлороформом и осаждают этанолом 26.
      1. Для этого, гомогенизацию ткани в 1 мл гуанидин тиоцианат-фенол смеси инкубируют в течение 10 мин. Добавить 200 мкл хлороформа и инкубировать в течение 10 мин.
      2. После центрифугирования (18 000 мкг в течение 15 мин при температуре 4 ° С), промывать верхнюю водную фазу с помощью 500 мкл изопропанола и центрифугу (18.000 х г в течение 8 мин при 4° С).
      3. Промывают осадок 500 мкл этанола и после стадии центрифугирования (18 000 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С), сухой осадок в вакуумной концентратором (5 мин при 30 ° С). После этого, ресуспендируют осадок в 30 мкл воды.
    2. Для извлечения мРНК из крови, центрифуга 500 мкл ЭДТА-стабилизированной крови (300 мкг в 10 мин 4 ° С).
      1. Возьмем поглощающее покрытие, содержащая белые клетки крови, и разбавить в 1 мл лизирующего раствора (150 мМ NH 4 Cl, 100 мМ NaHCO 3, 0,1 мМ Na-ЭДТА , рН 7,4).
      2. После 10 мин инкубации при комнатной температуре, центрифугировать клетки при 650 х г в течение 6 минут, а затем промыть в два раза с PBS.
      3. Извлечение мРНК из белых кровяных телец (WBCs) с использованием набора для экстракции РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
    3. Выполните синтез кДНК с использованием набора для синтеза кДНК в том числе случайных гексамерах в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте 200 нг мРНК для CdnСинтез.
  2. Количественная ПЦР
    1. Для количественной оценки количества специфической мРНК, используют 1 мкл кДНК, 1 мкМ вперед / назад праймера и флуоресцентный краситель ДНК связывания в соответствии с инструкциями изготовителя 27. Приведены в таблице 1 для последовательностей для наборов праймеров. Мера CT-значения IL-1, IL-6, IL-23, IFN & gamma;, TNF-alpha и PPIA (пептидил-пролил-изомеразы) с использованием системы количественного ПЦР.
    2. Для определения экспрессии мРНК по сравнению с помощью метода 27 сравнительный CT (пороговый цикл).
      1. Для этого, нормализовать CT-значения генов - мишеней на уровни экспрессии PPIA путем вычитания среднего CT-значение PPIA от гена - мишени, как описано в предыдущих исследованиях (Barthelmes и др. 28, Шиффманна и др. 29, Шиффманна и др. 30). Впоследствии, вычислить так называемые ΔΔCT-значения, с помощью которых, нормализовать значения & Delta; CТ-генов-мишеней от мышей EAE до уровня экспрессии генов-мишеней необработанных мышей, снова путем вычитания среднего & Delta; CТ-значение в необработанных мышей от & Delta; CТ-значения у мышей EAE.
      2. Для того, чтобы получить относительный уровень экспрессии мРНК гена - мишени, вычислить отношение с помощью следующей формулы: 2 - ΔΔct.
  3. Проверьте специфичность каждого праймера. Определить усиленную размер фрагмента , используя агарозном геле 2% 31. Размер фрагмента показана в таблице 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 приведен схематический обзор различных способов , описанных в этой статье. 1) Мыши получали инъекцию MOG 35-55 антигена и развить начальные клинические симптомы после 10,7 ± 0,3 дней 28. Представитель Конечно болезнь EAE мышей показано на рисунке 1. 2) Различные ткани (селезенка, лимфатические узлы, поясничного спинного мозга) и крови извлекаются из контрольных и ЕАЕ мышей в различные моменты времени в течение доклинической стадии (2 -й день, 4 -й день , день 6), во время начала заболевания (день 10) и во время острой фазы заболевания (12 -й день, 14 -й день). 3) мРНК профиля экспрессии цитокинов, которые регулируют развитие EAE, определяется в различных ткани извлеченный в различные моменты времени в течение болезни, с помощью количественной ПЦР. 4) Отдельные клетки выделяют из различных тканей , экстрагированныхв различные моменты времени в течение заболевания и распределения иммунных клеток определяли с помощью проточной цитометрии.

В селезенке и лимфатических узлах, Т-клетки и В-клетки наблюдаются как тип наиболее известных клеток. В отличие от лимфатических узлов, в селезенке, кроме того, большое количество моноцитов и нейтрофилов присутствуют. Все иммунные клетки обнаруживают кратковременное повышение лимфатических узлов во время острой фазы, в то время как только макрофаги, В-клетки, Т-клетки и нейтрофилы увеличение селезенки. В крови, все клетки иммунной системы увеличивают скоротечно в течение доклинической фазе. В поясничного отдела спинного мозга, болезнь-зависимый рост всех иммунных клеток наблюдается, кроме моноцитов, которые , предположительно , дифференцируются в макрофаги после их входа в спинной мозг (рисунок 2). CD4 + и CD8 + Т - клетки показывают сопоставимые изменения в селезенке, лимфатических узлах и крови во время различных курсов болезни. AmOng клетки проникают в спинной мозг, увеличение CD4 + Т - клеток была наиболее выражена (рисунок 3). На рисунке 4, стробирование-стратегия для определения различных клеточных популяций показано. Более подробно, клеточные популяции, описанные в этой рукописи были определены следующим образом: моноциты (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c-, CD11b +), макрофаги (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD11c-, CD11b +, F4 / 80hi), нейтрофилы (CD45hi, CD3-, CD11b +, Ly6G +), дендритные клетки (CD45hi, CD3-, Ly6G-, CD19-, CD11c +), В-клетки (CD45hi, CD3-, CD19 +), Т-клетки (CD45hi, CD3 +) , CD4 + Т-клетки (CD45hi, CD3 +, CD4 +) и CD8 + Т-клетки (CD45hi, CD3 +, CD8 +). Число клеток связаны с количеством ткани (вес селезенки, лимфатических узлов, поясничного отдела спинного мозга) или объема крови, таким образом, что отражает абсолютное количество клеток. Это, однако, можно выразить типы клеток в процентах от общего числа клеток измеряется.

В LYMрН-узлы, экспрессия IL-23 мРНК скоротечно увеличена во время доклинической фазе, тогда как экспрессия IL-6 мРНК увеличивается в болезнетворного зависимым образом. В селезенке, экспрессия мРНК IL-6 и IL-23 транзиторно возрастает в доклинической фазе, в то время как в начале болезни, экспрессия IL-1β мРНК повышается. В крови, экспрессия мРНК ФНО повышается в болезни-зависимым образом. В поясничном отделе спинного мозга, TNF - alpha, IL-1β и IFN & gamma ; увеличение во время острой фазы, в то время как IL-6 усиливает свою активность во время начала фазы (рисунок 5).

Рисунок 1

Рисунок 1: Схема рабочего потока для индукции и иммунологические оценки EAE. 1) ЕАЕ индуцируют у мышей приводит к развитию клинических симптомов. Клинические симптомы classifiред клиническими баллами, а не следующим образом: 0) каких-либо признаков, 0.5) дистальный паралич хвоста, 1) полный паралич хвоста, 1,5) хромать хвост и мягкий слабость задних ног, 2) хромать хвост и сильная слабость задних ног , 2,5) обмякшую хвост и паралич одной задней ноги, 3) безвольной хвост и паралич обеих задних конечностей. Число мышей , используемых на рисунке , показанном было 7. Фигура была изменена с Barthelmes и др. 28. 2) Мышей умерщвляли в различные моменты времени в течение болезни, селезенку, паховые лимфатические узлы, кровь и поясничного отдела спинного мозга извлечена и отдельные клетки , выделенные из этих тканей. 3) Иммунная распределение клеток в различных тканях, как было определено с помощью проточной цитометрии. 4) экспрессии мРНК для различных цитокинов в различных тканях, как это определено с помощью количественной ПЦР. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этого Figure.

фигура 2
Рис . 2: иммунные клетки Распределение, Определяются FACS (флуоресценция-Активированный сортировки клеток) Анализ в селезенке, лимфатических узлов, крови и спинного мозга образцы от ЕАЕ мышей на разных стадиях заболевания В эксперименте показано количество мышей в каждой группе было 2 - 10. распределение нейтрофилов / моноцитов в крови и нейтрофилы / макрофаги в спинном мозге адаптированы и модифицированы с Barthelmes и др. 28. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: CD4 + Т - клеток и CD8 распределение Т - клеток в образцах из ЕАЕ мышей на разных стадиях заболевания, Определяются FACS анализа. А) лимфатических узлов, В) селезенка, С) в крови и D) , спинного мозга. В эксперименте , показанном количество мышей в каждой группе было 2 - 10. Результаты представлены в виде средних значений ± стандартные ошибки (SEM). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: стробирование стратегия для проточной цитометрии анализа Т - клеток, В - клетки, нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки и макрофаги спинного мозга EAE у мышей на 12 день А) показан график SSC / CD45 от всех клеток. Ворота:. CD45 + клетки Б) Участок FSC-H / FSC-W от CD45 + клетокs. Ворота: отдельные клетки C) Участок SSC-A / FSC-A из отдельных клеток.. Ворота: жизнеспособные клетки. D) Участок FSC-H / CD3 из жизнеспособных клеток. Ворота: CD3 + и CD3 - клетки Е) Участок CD4 / CD8 из CD3 + клеток.. Ворота: CD4 + CD8 - (CD4 + Т - клетки) и CD4 - CD8 + (CD8 + Т - клетки) F) Участок CD19 и Ly6G / CD11b из CD3 - клеток.. Ворота: CD19 + CD11b - клетки (В - клетки), Ly6G + CD11b + клетки (нейтрофилы) и CD19 - Ly6G - клетки G) показан график CD11c / клеток CD11b из CD19 - Ly6G - клетки:. Ворота CD11c + клетки (дендритные клетки ) и CD11c - клетки Н) показан график SSC / F4 / 80 фр.ом CD11c - клетки. Ворота: F4 / 80 - клетки (моноциты) и F4 / 80 + клеток (макрофаги). Один из представителей участок 9 показан. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5:. Цитокин профиля (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-23, TNF - alpha, IFN & gamma ; ) в образцах от EAE у мышей на разных стадиях заболевания А) лимфатических узлов, В) селезенка, С) в крови и D) , спинного мозга. уровни экспрессии мРНК нормализовали к пептидил пропиловый изомеразный A (PPIA) и рассчитывали с использованием уровня мРНК необработанных мышей того же возраста. Измерения проводились в трех экземплярах. Количество мышей в группе 2 - представлены 3. Результаты в виде среднего ± ГНАndard ошибки (SEM). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Ген вперед задний ход fragement размер (Вр)
IL-1β CTGGTGTGTGACGTTCCCATTA CCGACAGCACGAGGCTTT 76
ИЛ-6 TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC 76
IL-23 GAGCAGCAACTCTGACTGAGCC GAACAGCACAAGTCCTAATGGGTTA 127
IFN & gamma; CACGGCACAGTCATTGAAAGC CACCATCCTTTTGCCAGTTCC 118
TNF-alpha TGACAAGCCTGTAGCCCACG GCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC 178
PPIA GCTGGACCAAACACAAACGG GCCATTCCTGGACCCAAAAC 144

Таблица 1: пар праймеров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Модель EAE , описанный здесь получил наибольшее внимание как модель MS и обычно используется при тестировании терапевтических стратегий для MS 32. Заболевание мыши обладает многими клинические и гистологические характеристики МС и обусловлена ​​индукцией аутоиммунитета к нейрональных антигенов. Сенсибилизация к миелиновых антигенов связано с гематоэнцефалического барьера дисфункции и, таким образом, инфильтрация клеток иммунной в ЦНС. Наши результаты показывают, что иммунные клетки увеличивают скоротечно в лимфатических узлах в острой фазе. Селезеночной Т-клетки и В-клетки уменьшаются в доклинической фазе заболевания. В циркулирующей крови, Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и моноциты увеличивают скоротечно в доклинической фазе, в то время как нейтрофилы увеличить болезнь зависимым от. И, наконец, в спинном мозге, повышение иммунных клеток выявляется (рисунок 2). Эти данные указывают на то, что Т-клетки и В-клетки мигрируют из селезенки, которая действуетрезервуар для этих клеток, в лимфатические узлы, где они активируются и пролиферируют. В дальнейшем они мигрируют через обращение в спинной мозг. Нейтрофилы, моноциты и дендритные клетки, с другой стороны, мигрируют из костного мозга путем циркуляции в ЦНС.

Наши данные показывают, что в спинном мозге, IFN & gamma;, ФНО и ИЛ-1β регулируются в болезнетворного зависимым образом, в то время как IL-6, промежуточно повышающей регуляции в начале заболевания. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что EAE патология приводится в движение Th1 и Th17 клеток. Th1 клетки продуцируют IFN & gamma ; , который в свою очередь активирует макрофаги выпустить TNF & alpha ; и IL-1β 33. Кроме того, ИЛ-6 , как известно, привод дифференциацию Th1 и Th17 клеток , и тем самым способствовать развитию EAE 34.

День начала клинических симптомов и тяжести заболевания варьирует у мышей EAE. Основываясь на нашем опыте, есть несколько гeasons для этого. Мышей, подвергнутых стрессу во время доклинической фазы показывают пониженную тяжесть заболевания и задержку начала заболевания. Корпус мышей также влияет на тяжесть аллергического энцефаломиелита, а также день начала болезни. В последнее время было показано , что синантропных микробиоты мышей влияют на развитие ЭАЭ 35 и различных жилищных ситуациях могут влиять на микробиомом и , таким образом, патология EAE. Кроме того, очень важно всегда использовать свежеприготовленные коклюшного токсина. Коклюшный токсин повреждает гематоэнцефалический барьер, который является предпосылкой для развития EAE. Не используйте эмульгированной MOG 35-55 пептида после истечения срока годности. Возраст мышей также влияет на EAE патологии. Таким образом, есть некоторые правила, которые должны быть выполнены для того, чтобы генерировать воспроизводимую модель EAE. Используйте мышей в возрасте от 10 до 13 недель и мышей от того же поставщика, если это возможно. Если мыши упорядочиваются у внешнего поставщика, позволяют мышам акклиматизироваться в течение двухнедель в доме животных. Ручка мышей нежно перед EAE индукции так, чтобы они привыкли к обращению. Избегайте ненужной обработки после EAE индукции. Обеспечить мышей с пищей и водой, которые они могут легко достичь, как только они показывают клинические симптомы. Если мыши должны быть обработаны с лекарственным средством, то лучше смешивать его в пищу или питьевую воду, чтобы избежать путая эффектов стресса. Если через желудочный зонд или инъекции имеет важное значение для введения лекарственных средств, важно, чтобы использовать один и тот же маршрут для транспортного средства.

В дополнение к основной модели прогрессивной EAE, описанной здесь, ремиттирующим модели EAE также существуют. Различная Конечно заболевание индуцируют введением различных антигенов в различных штаммов мышей. Таким образом, применение MOG 35 - 55 штаммов мышей, таких как C57BL / 6, Sv129, B10, NOD и мышей Biozzi, приводит к первичной форме прогрессирующее заболевание. Интересно, что в день начала отличается в различных линиях мышей. В то время какC57BL / 6, SV129 и мышей B10 развиваются первые клинические симптомы примерно от 11 -й день до 12, мышей Biozzi показывают первые клинические симптомы после 21 дня 36. В предыдущем исследовании было показано , что 129S4 / SvJae × C57BL / 6 гибридов первого демонстрируют клинические симптомы примерно от 11 -й день 28. Инъекция протеолипидного белка (PLP) 131-151 приводит у мышей SJL к индукции ремиттирующим Конечно , болезнь 37. Лучшая модель EAE использовать, будет зависеть от направленности исследования. Таким образом, если рецидивы фаза представляет интерес, то рецидивы-ремитент модель следует использовать в то время как, если начало заболевания является основным направлением, прогрессивная модель должна быть использована. Если роль специфического белка должен быть исследован в модели EAE, используя выбиваемые мышей, важно иметь в виду, что не все штаммы могут быть использованы для индукции EAE и, возможно, беккросс штамма цепную выходящими на чувствительный штамм необходимо.

Три наиболее широко используется тypes животных моделей МС: (1) Аутоантиген индуцированный EAE; (2) вирусно индуцированных спонтанное, хронические заболевания демиелинизации, и (3) токсин-индуцированной демиелинизации 38. Модели EAE характеризуются индукции воспаления и аутоиммунных реакций путем применения к аутоантигенных пептида , такие как миелин олигодендроцитов белка или протеолипидного белка 38. Спонтанное ЕАЕ развивается у трансгенных мышей , которые избыточно экспрессируют рецептор Т - клеток против пептида миелиновой олигодендроцитов белка 39. Для того, чтобы побудить вирусно-индуцированный хроническое воспаление, нейротрофический инфекцию центральной нервной системы могут быть вызваны, например, с Theiler`s мышиный вирус энцефаломиелита. Клетки , инфицированные вирусом подвергаются нападению как Т - клеток и гуморального ответа и тем самым привести к хронической демиелинизации 40,41. Токсин-индуцированные демиелинизация может быть вызван, например , с медью хелатор cuprizone 42. Эта модель приводит конкретно к demyeliнации, потому что cuprizone нападает на олигодендроциты и ведет, таким образом, к активации астроглию и микроглии, а воспалительные процессы играют лишь незначительную роль. После клиренса токсина, новые олигодендроциты генерируются и новый миелиновой оболочки образуется. Использование этих трех моделей, взаимодополняющим образом, позволяет оценить эффекты наркотиков по различным аспектам патогенеза МС, так как модели различаются в отношении воспалительных и иммунных и демиелинизирующих процессов. В EAE и вирус-индуцированной модели, воспаления и аутоиммунных процессах, прежде всего, привод заболевание, в то время как в токсин-индуцированной модели, демиелинизирующих и remyelinating процессы являются преобладающими. Для доклинических испытаний потенциальных лекарственных препаратов для лечения рассеянного склероза, по крайней мере, три модели, токсин-индуцированной модели, обострений и ремиссий EAE и первичной прогрессивной EAE или вирусно-индуцированной модели следует использовать для проверки эффективности препарата.

Модель EAE описал еее может быть использован для получения более глубокое представление о механизме развития процесса MS-подобного заболевания, выявление ключевых клеточных драйверов заболевания, такие как Th1, Th17 и В - клеток 43,44. Чем лучше понимание воспалительных и иммунных процессов, участвующих в развитии МС и процессов, которые способствуют и устранить повреждения, тем больше вероятность того, что новые стратегии лечения могут быть разработаны.

Тем не менее, модель EAE, описанный здесь просто имеет некоторые общие черты с рассеянным склерозом, а также имеет несколько четких отличий от болезни человека. Наиболее заметным отличием является то, пациенты с РС широко варьируются в презентации болезни, которая не воспроизводится в модели EAE. Это может быть связано с различными формами поражения у больных рассеянным склерозом и мышей EAE и к тому, что мыши являются инбредные штаммы. У мышей, EAE, однородные поражения наиболее заметны в спинном мозге, тогда как у пациентов с рассеянным склерозом, в первую очередь гетерогенные пораженияв мозге 45,46. Кроме того, мобильная станция и EAE разделяют важный вклад Th1 клеток и клеток Th17 для их развития, но в отличие от MS, CD8 + Т - клетки играют незначительную роль в EAE патологии 33. В заключение отметим, что модель EAE сосредоточена главным образом на комбинированных эффектов аутоиммунитете, воспалительных процессов и нейродегенеративные тогда демиелинизирующие процессы менее поддаются выборочной оценкой. Таким образом, другие животные модели , такие как модель cuprizone могут быть использованы для Отчетливый исследование демиелинизирующих процессов 47. Модель EAE несовершенен, но , тем не менее, полезная модель MS 33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
  13. Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Tags

Immunology выпуск 111 экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит MOG рассеянный склероз проточной цитометрии Т-клетки В-клетки нейтрофилы моноциты макрофаг
Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, … More

Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter