Abstract
Detectie van genexpressie in verschillende hersencellen bijvoorbeeld neuronen, astrocyten, oligodendrocyten, oligodendrocyt voorlopers en microglia, kan worden belemmerd door het gebrek aan specifieke primaire of secundaire antilichamen voor immunokleuring. Hier beschrijven we een protocol voor de expressie van drie verschillende genen in dezelfde hersenpreparaat met dubbelzijdige fluorescentie in situ hybridisatie detecteren met twee genspecifieke probes, gevolgd door immunokleuring met een antilichaam met hoge specificiteit die is gericht tegen het eiwit dat wordt gecodeerd door een derde gen. De Aspartoacyclase (ASPA) gen, mutaties die leiden tot een zeldzame menselijke wittestofziekte - ziekte Canavan - wordt gedacht te worden uitgedrukt in oligodendrocyten en microglia, maar niet in astrocyten en neuronen. De precieze expressiepatroon van ASPA in de hersenen nog niet vastgesteld. Dit protocol heeft ons in staat gesteld om te bepalen dat ASPA wordt uitgedrukt in een subset van volwassen oligodendrocyten eennd kan algemeen worden toegepast op een breed scala van genexpressiepatroon studies.
Introduction
Gliacellen, die de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel (CNS) zijn, omvatten oligodendrocyten (de myeliniserende cellen van CNS), oligodendrocyten precursors (OP's, ook bekend als "NG2 cellen"), astrocyten en microglia. Er is toenemende interesse in de functies van gliacellen en hun potentiële rol bij neurologische aandoeningen 1. Bijvoorbeeld, ziekte van Canavan (CD) is een erfelijke neurodegeneratieve aandoening de aanvang van de kinderjaren met spongiforme leukodystrofie en een progressief verlies van neuronen, wat leidt tot de dood gewoonlijk voor 10 jaar 2,3. Mutaties in de Aspartoacyclase (ASPA) gen die leiden drastisch verminderde activiteit ASPA 4 CD geïdentificeerd. ASPA is een enzym katalyseert de deacetylering van N-acetylaspartate (NAA), een molecuul sterk geconcentreerd in de hersenen, het genereren acetaat en aspartaat 5-7. Veel cd patiënten vertonen hogere NAA door gebrek aan ASPA acteit. Sommige studies speculeren dat NAA-afgeleide acetaat een belangrijke bron van vetzuren / lipiden in de hersenen tijdens de ontwikkeling zou kunnen zijn en CD gevolg kunnen zijn van verminderde myeline synthese tijdens de ontwikkeling veroorzaakt door het falen van NAA worden afgebroken 3,5,6.
ASPA wordt vooral aangetroffen in de nieren, de lever en witte stof van de hersenen, en gezien de belangrijke rol van ASPA in CD, heeft de cellulaire expressie van dit enzym in de hersenen bestudeerd door verschillende laboratoria. Door te kijken naar ASPA enzymatische activiteit in de hersenen, eerdere studies bleek dat de toename van ASPA activiteit tijdens hersenontwikkeling loopt parallel met het tijdsverloop van myelinisatie 8-10. Op cellulair niveau assays voor enzymactiviteit als in situ hybridisatie (ISH) en immunohistochemie (IHC) analyses blijkt dat ASPA vooral uitgedrukt in oligodendrocyten in de hersenen, maar niet in neuronen en astrocyten 11-16. Een paar studies bleek dat ASPA zou ookuitgedrukt in microglia in het CZS 12,14. Tot nu toe gegevens over ASPA meningsuiting in OP's zijn beperkt. Volgens een recente studie waarin transcriptomes verschillende celtypen bij muizen cerebrale cortex inclusief neuronen, astrocyten, OP's, nieuw gevormde oligodendrocyten, myeliniserende oligodendrocyten, microglia, endotheelcellen en pericyten werden geanalyseerd door RNA sequentie 17 wordt ASPA uitsluitend uitgedrukt in oligodendrocyten , in het bijzonder in myelinating oligodendrocyten (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Ondanks deze studies ASPA expressiepatroon in de hersenen, een aantal onzekerheden blijven.
Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om genexpressie patronen bestuderen. IHC is een algemeen gebruikte werkwijze voor het detecteren van functionele product (dwz eiwit) van genexpressie in weefselcoupes. Ondanks zijn grote nut, deze techniek heeft beperkingen als de toepassing ervan en specificiteit zijn afhankelijk van to de beschikbaarheid en specificiteit van het antilichaam nodig is. Ter vergelijking, ISH heeft het voordeel dat de expressie van elk gen onthullen op het mRNA-niveau. Het kan echter technisch moeilijk om meerdere probes tegelijkertijd om een genexpressie tot specifieke celtypen te lokaliseren. In dit artikel beschrijven we een protocol combineert dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie met fluorescentie immunolabel van een eiwit. We hebben deze set van technieken die worden gebruikt om de expressie patroon van Aspa in muizenhersenen te onderzoeken. Deze methode kan de precieze studie van genexpressie met behulp van confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring:
Muis veehouderij en de behandeling zijn in overeenstemming met de Britse ministerie van Binnenlandse Zaken verordeningen en de UCL richtlijnen ethische commissie, die voldoet aan de Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 van het Verenigd Koninkrijk en zijn amendement Regulations 2012.
LET OP: Alle oplossingen moeten worden gemaakt met diethylpyrocarbonaat (DEPC) - behandeld water om eventueel achtergebleven RNase vernietigen. Voor DEPC behandeling, voeg DEPC (1 ml per liter), schud krachtig tot alle DEPC bolletjes vervolgens verdwenen Autoclaveer de DEPC degraderen.
1. RNA Probe Synthesis
- LET OP: Bij het hanteren van formamide, Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en gebruik een veiligheidskabinet. Bereid hybridisatiebuffer:-DEPC behandeld gedeïoniseerd water met 50% (v / v) gedeïoniseerd formamide, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml gist tRNA, 1 x Denhardt's solution, en 10% w / v dextran sulfaat.
- Kies een DNA kloon die de cDNA-sequentie van het gen van belang in een plasmide met RNA polymerase promoters bevat. Voor dit voorbeeld, gebruik dan een pCMV-sport6 kloon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), met T7 en Sp6 RNA-polymerase promoters voor Aspa (aanvullende figuur 1).
- Bereid gelineariseerd plasmide-DNA als template.
- Groeien de DNA-kloon, extraheer het plasmide met een kleinschalige plasmide zuivering kit volgens het protocol van de fabrikant en de sequentie met T7 en Sp6 universele primers.
- Digest 1020 ug plasmide-DNA met een restrictie enzym dat knipt op het 5'-uiteinde van de sense streng van het cDNA. Voor dit voorbeeld gebruiken 100 unit Sall aan de pCMV-SPORT6- Aspa plasmide verteren. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 oC
- Voer een kleine hoeveelheid op een agarosegel om te controleren of het plasmide volledig lineair.
- Zuiver hetgelineariseerde plasmide met behulp van fenol-chloroform.
- Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaat, één volume 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) - geëquilibreerde fenol en één volume chloroform / isoamylalcohol (IAA) (24: 1).
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur (20 - 25 ° C, RT) en extraheer bovenste waterfase.
- Dient een hoeveelheid chloroform / IAA, centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 min en extraheer bovenste waterfase.
- Herhaal stap 1.4.3.
- Voeg 2 volumina ethanol en laat bij -20 ° C gedurende 1 uur of O / N.
- Centrifugeer bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant.
- Was de pellet met 70% koude ethanol en resuspendeer in bij benadering 1 ug cDNA per 2,5 pl in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
- Synthetiseren de twee probes, een gelabeld met digoxigenine (DIG) en een met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC).
- Selecteer de geschikte RNA polymerase om de anti-se makenNSE probe (complementair aan het doel mRNA). Voor dit voorbeeld gebruikt T7 RNA polymerase te maken Aspa probe.
- Bereid in vitro transcriptiereactie: voeg 1 ug van het gelineariseerde DNA, 4,0 ui 5 x transcriptiebuffer, 6,0 pl 100 mM DTT, 2,0 ui 10X DIG of FITC RNA labeling mix met dNTPs, 1 pl RNase inhibitor, en 20 - 40 eenheden van RNA-polymerase; de uiteindelijke volume tot 20 ul met DEPC behandeld water.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5 uur.
- Run1 ul van de transcriptie reactie op een 1,0% agarosegel om te controleren of de reactie heeft gewerkt. De gel moet de lineaire sjabloon en een lichte band van de sonde te laten zien.
- Voeg een volume van 100 ul met hybridisatiebuffer en bewaar 10 gl aliquots bij -80 ° C.
2. Perfusie, Fixatie en Tissue Collection
- LET OP: Bij het hanteren van paraformaldehyde (PFA), zowel vast alswaterige, slijtage PPE en het gebruik van een veiligheidskabinet. Bereid formaldehyde oplossing door het oplossen van 4% (w / v) PFA in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing met warmte (55 ° C). Filter de formaldehyde-oplossing met filter papier.
- Bereid sucrose oplossing door het oplossen van 20% (w / v) sucrose in gedestilleerd water en voeg 0,1% (v / v) DEPC oplossing. Laat O / N bij kamertemperatuur met een losse deksel en vervolgens autoclaaf.
- Terminaal verdoven een muis door intraperitoneale injectie van pentobarbiton (50 mg / kg). Beoordeel de diepte van de anesthesie door teen knijpen en de afwezigheid van de terugtrekking reflex duidt diepe narcose.
- Zodra de muis onder diepe narcose, een insnijding onder de ribbenkast en doorsnijden de ribbenkast aan beide zijden te tillen om het hart bloot te leggen.
- Plaats een 25-G naald in de linker ventrikel van het hart. Maak een kleine incisie in de rechterboezem van het hart.
- Perfuseren het dier met 20 ml PBS en 40 ml formaldehyde-oplossing. Voor P30 en oudermuizen, gebruikt een perfusie snelheid van 12 ml / min maar jonge dieren gebruiken een lagere (7-10 ml / min).
- Ontleden de hersenen.
- Sever de muis hoofd met chirurgische schaar door het maken van een snede posterior uit de oren. Maak een caudale middellijn incisie in de huid en werken rostraal om de huid van de schedel te verwijderen.
- Vanaf het caudale deel, dwars door de bovenkant van de schedel middellijn langs en tussen de ogen met Iris schaar. Verwijder de pariëtale en frontale bot platen door het kantelen van de ene kant van een bot plaat elke keer en snapping het af met een pincet.
- Kantel de hersenen naar boven uit het voorste deel met een pincet en snijd de optische zenuwen en andere hersenzenuwen. Til de hersenen uit de schedel.
- Plaats de hersenen in een muis coronale hersenen matrix. Snijd de hersenen in het 3 ongeveer 4 mm stuks met een veer scheermesje.
- Breng de plakjes in 4% PFA-oplossing en incubeer O / N bij 4 ° C.
- overdracht hersenenplakjes DEPC-behandeld 20% sucrose-oplossing en incubeer O / N bij 4 ° C
- Plaats elke hersenen slice in een droge cryomould, omringen met optimale snij-temperatuur (LGO) medium en vries op droog ijs. Bewaar bij -80 ° C.
3. cryosectioning
- Snij 15 micrometer secties van ingevroren weefsel in een cryostaat en het verzamelen van de secties op microscoop dia's. Indien nodig, nat van de secties met DEPC behandeld PBS en druk ze plat met een fijn penseel.
- Laat de dia's drogen gedurende ongeveer 1 uur zodat het weefsel hecht aan de dia.
4. hybridisatie
- Bereid 65 ° C wasbuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x saline natriumcitraat), 50% (v / v) formamide en 0,1% (v / v) Tween- 20.
- Bereid MABT buffer: 100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5.
- Verdun de twee sondes (DIG gemerkte en FITC-gelabelded) 1/1000 in hybridisatiebuffer voorverwarmd tot 65 ° C en meng.
- Toepassen ongeveer 300 gl hybridisatiemengsel op elke dia coverslipwith oven gebakken (200 ° C) dekglaasjes en geïncubeerd O / N bij 65 ° C in een bevochtigde kamer.
- Overdracht van de dia's in een Coplin pot met voorverwarmde wasbuffer. Was de dia's voor 30 minuten tweemaal bij 65 ° C met wasbuffer.
- Was de dia's voor 10 min driemaal met MABT bij kamertemperatuur.
5. Visualisatie van de FITC Probe
- Bereid ISH blokkeerbuffer: MABT met 2% blokkeerreagens en 10% door warmte geïnactiveerd serum schapen.
- Optioneel: gebruik een hydrofoob pen om cirkels rond de weefselcoupes maken van de schuif naar volume antilichaam oplossingen vereist verminderen.
- Incubeer de glaasjes gedurende 1 uur bij KT met ISH blokkerende buffer in een bevochtigde kamer.
- Incubeer de glaasjes O / N bij 4 ° C met een mierikswortel peroxidase (POD) - conjugaatd anti-FITC antilichaam verdund 1/500 (v / v) in blokkeerbuffer ISH.
- Plaats de objectglaasjes in een Coplin pot met PBS met 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). Was 3 keer voor 10 min in PBST en vervangen door verse PBST elke keer.
- Vlak voor het gebruik, de voorbereiding van de fluorescerende tyramide door verdunning 100 keer in de Amplification verdunner. Voor dit voorbeeld gebruiken FITC-tyramide.
- Voeg dit toe aan de dia en laat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de objectglaasjes in een Coplin jar en was 3 keer in PBST gedurende 10 minuten.
6. Visualisatie van de DIG Probe
- Bereid 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
- Incubeer de glaasjes met ISH blokkerende buffer gedurende 1 uur bij KT.
- Incubeer de glaasjes O / N bij 4 ° C met alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd anti-DIG antilichaam verdund 1/1500 (v / v) in blokkeerbuffer ISH.
- Wassen met MABT gedurende 10 min driemaal.
- Was tweemaal met 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Vlak voor het gebruik, voor te bereiden Fast Rode oplossing door het oplossen van de tabletten in 0,1 M Tris pH 8,2. Filtreer de oplossing door een 0,22 pm filter.
- Incubeer de glaasjes bij 37 ° C met Fast Red-oplossing in een bevochtigde kamer. Aangezien de tijd voor een optimale ontwikkeling varieert, controleer de objectglaasjes regelmatig met een fluorescentiemicroscoop om de neerslagvorming te controleren. Voor dit voorbeeld, stop de reactie na 2-3 uur.
- Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal.
7. Immunohistochemie
- Bereid IHC blokkerende buffer: 10% (v / v) serum (van een andere soort dan primair antilichaam host) in PBST.
- Incubeer dia's met IHC blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
- Bereid primaire antilichaam: verdun het primaire antilichaam in een geschikte verdunning in PBST met 5% serum (van een andere soort dan primaire antilichaam host). Voor dit voorbeeld, gebruik maken van een konijn anti-Olig2 antilichaam bij 1/400 (v / v) verdunning.
- Incubeer in het primaire antilichaamoplossing bij 4 ° CO / N.
- Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal.
- Bereid secundair antilichaam: verdun een fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam bij een passende verdunning in PBST met 5% (v / v) serum (van een andere soort dan primair antilichaam host) en 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Voor dit voorbeeld gebruik een ezel anti-konijn secundair antilichaam bij Alexa647 1/1000 (v / v) verdunning.
- Incubeer in het secundaire antilichaamoplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Wassen met PBST gedurende 10 min driemaal.
8. Montage
- Gedeeltelijk Droog de glaasjes bij kamertemperatuur, en monteer met een fluorescentie montage medium. Laat de dia's beeld, 20X en 63X doelstellingen gebruikt 4 verschillende kanalen met de volgende golflengten drogen en in een confocale microscoop onder 10X: 570 nm voor Fast Red, 488 nm voor FITC, 647 nm voor Olig2 immunolabeling en 350 nm voor Hoechst .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel beschrijft een werkwijze voor dubbel fluorescentie ISH gevolgd door immunolabeling in muizenhersenen secties. Een korte beschrijving van dit protocol wordt getoond in figuur 1. De eerste stap was probes specifiek voor Aspa en Mbp (myeline basisch eiwit) synthetiseren. Nagaan of de probes waren gesynthetiseerd, een kleine hoeveelheid van elke reactie werd over agarose gel. De zwakke lineaire template en een groot deel van de RNA probe te zien (figuur 2). Dubbele fluorescentie ISH voor Aspa en Mbp, gevolgd door Olig2 immunolabeling en Hoechst nucleaire kleuring, werd uitgevoerd op muizen hersenen secties. We gescande de hersenen secties in een confocale microscoop en de naden aan de afbeeldingen samen om de verdeling van genexpressie onthullen signalen in de hersenen. Aspa expressie in Mbp -positieve (Mbp +) cellen werd waargenomen gedurende de beha (Afbeelding 3). We onderzochten ook Aspa expressie in verschillende hersenstructuren met een sterkere vergroting. Aspa expressie in oligodendrocyten in de cortex en het corpus callosum worden getoond in Figuur 4. De co-localisatie van Mbp, Olig2 en aspa aan dat Aspa expressie wordt gebracht in een subset van volwassen oligodendrocyten in de cortex en het corpus callosum (figuur 4). deze resultaten demonstreren dat dit protocol gelijktijdig de expressie van drie verschillende genen kan detecteren in hersencoupes.
Figuur 1. Protocol voor Double Fluorescence In Situ Hybridization Aansluitend Immunokleuring. Dit protocol loopt over 5 dagen en de expressie van drie genen gedetecteerd./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Onderzoek van Aspa RNA Probe op agarosegel. De lineaire template en een groot deel van de RNA probe van mindere moleculair gewicht kan worden waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Double fluorescentie in situ hybridisatie voor Aspa en Mbp in muizenhersenen secties. Aspa (rood) en Mbp (groen) in de hersenen vertonen. Schaal bar:. 500 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Expressie van Aspa in oligodendrocyten in de cortex en het corpus callosum. Panelen tonen representatieve beelden van ISH voor Aspa (rood) en Mbp (groen), gevolgd door immunokleuring van Olig2 (blauw) gecombineerd met Hoechst kleuring. Aspa werd uitgedrukt in een aantal MBP + / Olig2 + cellen in de cortex (A en B) en in het corpus callosum (C en D). M bp + / + Olig2 / Aspa + cellen worden aangegeven met pijlen en Mbp + / + Olig2 / Aspa - cellen worden aangegeven met pijlpunten in de vergrote panelen (B en D). Schaalbalken: 100 urn (A en C); 20 pm (B en D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Figuur 1. Sequence en kaart van Aspa Clone (IRAVp968C0654D). 1,5 kb cDNA sequentie van Aspa werd geïnsereerd in plasmide pCMV-sport6 (A). De kaart van pCMV-sport6-Aspa plasmide wordt getoond in (B).m / files / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol wordt stap-voor-stap procedure voor een dubbele RNA in situ hybridisatie gevolgd door immunokleuring. We hebben dit protocol dat wordt gebruikt om te bevestigen dat Aspa wordt uitgedrukt in mature oligodendrocyten in verschillende hersengebieden.
Deze multi-step procedure vele valkuilen die gevoeligheid kan beïnvloeden en moeten worden vermeden. Ten eerste, alle oplossingen en buffers voor opslag transcriptiereactie nodig RNase-vrij zijn. Ten tweede, de keuze van cDNA-templates is belangrijk en we liever templates ongeveer 1 kb lang. Er moet schoonmaken van de cDNA-templates met fenol / chloroform extractie en het opnieuw neerslaan voordat in vitro transcriptie. Bovendien is de transcriptie van de probe moet optimaal zijn; Als de sonde niet in voldoende hoeveelheden, zal de kwaliteit van ISH verminderen. De kwaliteit van de probe kan worden gecontroleerd door het onderzoeken van het op een agarosegel en goede kwaliteit zijnduidelijk uit de grote helderheid van de probe band ten opzichte van de sjabloon band (figuur 2). Voor dubbele ISH, zijn twee verschillend gemerkte probes gebruikt, meestal een gemerkt met DIG en de andere met FITC. De FITC-gelabelde probe wordt beschouwd als de minst detecteerbaar te zijn en worden gekozen wanneer het doel-mRNA verwachting het hoogst in het weefsel. Deze sonde wordt meestal ontwikkeld eerste en de DIG-gemerkte probe wordt tweede ontwikkeld.
Een andere belangrijke stap is het weefsel voorbereiding. Muizen geperfuseerd met DEPC-behandeld PBS gevolgd door 4% PFA, post-gefixeerd in 4% PFA O / N en cryobeschermd in 20% sucrose oplossingen zijn DEPC-behandeld om eventuele RNase vernietigen. Fixatie tijd is heel belangrijk; over- of fixatie kan leiden tot een zwakker signaal, wellicht als gevolg van verminderde sondepenetratie (over-fixatie) of afbraak van het mRNA (onder-fixatie). Het weefsel wordt vervolgens cryosectioned en twee probes gehybridiseerd O / N. de formamidegebruikt in de hybridisatiebuffer moet gedeïoniseerd. Een belangrijke overweging in de O / N hybridisatie bij 65 ° C om verdamping en concentratie van het hybridisatiemengsel vermijden dat de gevoeligheid gevaar kunnen brengen. In het experiment beschreven voerden wij hybridisatie bij 65 CO / N, maar het zou proberen waard lagere temperaturen voor verschillende probes als blijkt moeilijk te zijn aan het doel mRNA te detecteren.
Er is een keuze van de reagentia voor het detecteren van de gehybridiseerde probes. Fast Red is een fluorescente reagens, maar niet alle batches van Fast Red hetzelfde resultaat. Het moet AP ontwikkelings- en geeft fluorescentie met excitatie rhodamine. Onze ervaring is het belangrijk om het vers met 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 te maken en daarna filteren gebruikt. Een niet-fluorescerende optie kleurontwikkeling met nitro blauw tetrazolium (NBT) en 5-broom-4-chloor-3'-indolyphosphate (BCIP) dat werkt met dezelfde AP-geconjugeerd antilichaam. anoTher optie is met fluorescerende tyramide voor detectie. Hoewel fluorescerende tyramide systemen niet de meest gevoelige methoden, de derde reactie met mierikswortelperoxidase is zeer snel en er zijn ten minste drie kleuren fluorescerende (FITC, Cyanine 3 en Cyanine 5) die kan worden gebruikt. Een beperking van dit protocol is dat sommige specifieke antigenen (of epitopen), bijzonder lage abundantie proteïnen, niet detecteerbaar na de ISH proces kan zijn en dus niet geschikt voor IHC na ISH. In onze immunokleuring, antilichaam detectie van Olig2 verschijnt onaangetast. De gebruiker moet de juiste antilichaam te kiezen voor immunolabel volgende ISH.
IHC en ISH worden vaak gebruikt technieken voor het genexpressie patroon studies, en beide hebben voor- en nadelen. IHC is een zeer gevoelige methode voor het detecteren van de expressie van cellulaire genen in hersenpreparaten, maar de afhankelijkheid van het antilichaam beïnvloedt de specificiteit en de toepassing ervan beperkt. Daarentegen ISH heeft een hoge specificity en de probe van elk gen kan gemakkelijk worden gesynthetiseerd door in vitro transcriptie met behulp van de genspecifieke cDNA als matrijs. Het protocol dat we ontwikkeld maakt gebruik van beide methoden, een combinatie van dubbele ISH met IHC triple detectie van genexpressie met een hoge specificiteit te bereiken.
Kortom, het protocol dat we hier beschrijven maakt gelijktijdige kleuring van twee mRNA's en één eiwit, zodat het een nuttig instrument voor het illustreren van co-gelokaliseerde genexpressie. Hoewel mRNA expressie niet altijd correleert met eiwitexpressie ISH is een techniek die het mogelijk maakt om genexpressie met hoge specificiteit te onderzoeken. Ons protocol dubbele fluorescentie ISH gecombineerd met IHC heeft bewezen succesvol in het opsporen Aspa expressie in een subset van oligodendrocyten in hersenweefsel van volwassen muizen, en kan gemakkelijk worden aangepast voor een verscheidenheid van weefsels van verschillende oorsprong en ontwikkelingsstadia. Bovendien, dit protocolkan ook worden gebruikt voor het detecteren van expressie van kleine RNAs zoals miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al.
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
