Abstract
Beyin hücreleri, örneğin nöronlar, astrositler, oligodendrositler, oligodendrosit öncüleri ve mikroglia farklı gen ifadesinin saptanması, immün spesifik primer ya da sekonder antikorların yokluğuyla engellenebilir. Burada üçüncü geni tarafından kodlanan proteine karşı yöneltilmiş yüksek özgüllük bir antikor ile immün ardından, iki gen spesifik problar ile in situ hibridizasyon, çift floresan kullanılarak aynı beyin kısmında üç farklı gen ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol açıklar. Aspartoacyclase (ASPA) geni, mutasyonlar nadir insan beyaz madde hastalığı neden olabilir - Canavan hastalığı - oligodendrositler ve mikroglia ancak astrositler ve nöron ifade edilmesi düşünülmektedir. Bununla birlikte, beyinde ASPA kesin ifade deseni henüz belirlenmemiştir zorundadır. Bu protokol ASPA olgun oligodendrosit a bir alt kümesi olarak ifade edildiğini belirlemek için bize izin verdiND genellikle gen ekspresyon paterni çalışmalar çeşitli uygulanabilir.
Introduction
Merkezi sinir sisteminde (CNS) içinde en bol hücrelerdir glial hücreler, oligodendrositlerin (CNS myelinating hücreleri), oligodendrositler öncüleri (aynı zamanda "NG2 hücreler" olarak da bilinir OP), astrositler ve mikroglia içermektedir. Nörolojik hastalıklarda 1 glial hücreler ve bunların potansiyel rolleri fonksiyonları artan bir ilgi vardır. Örneğin, Canavan hastalığı (CD) genellikle yaş 2,3 10 yıl önce ölüme yol açan, erken süngersi leukodystrophy ve nöronların ilerleyici kaybı ile bebeklik döneminde başlayan bir kalıtsal nörodejeneratif bir hastalıktır. Yol Aspartoacyclase (ASPA'nın) genindeki mutasyonlar ölçüde CD ASPA'nın aktivitesi 4 düşürülen tespit edilmiştir. ASPA N-asetilaspartat (NAA) deasetilasyonu katalize bir enzim, yüksek beyin içinde konsantre molekülü üreten asetat, aspartat 5-7. Birçok CD hasta nedeniyle ASPA ac eksikliği NAA daha yüksek olduğunu göstermektedirtivity. Bazı çalışmalar NAA türetilmiş asetat gelişimi sırasında yağ asitleri / beyinde lipidlerin önemli bir kaynağı olabilir ve 3,5,6 aşağı kırılması NAA yetmezliği nedeniyle gelişimi sırasında miyelin sentezi azaldığı CD neden olabilir spekülasyon.
ASPA ağırlıklı beyin böbrek, karaciğer ve beyaz cevherde bulunan ve CD'deki ASPA önemli rolü verilir, beyindeki bu enzimin hücre ifadesi birkaç laboratuvarlar tarafından incelenmiştir. Beyinde ASPA enzimatik aktivite bakarak, daha önceki çalışmalarda beyin gelişimi sırasında ASPA aktivite artışı miyelinasyon 8-10 zaman sürecini paralellik bulundu. Hücresel düzeyde, enzimatik aktivitesi için hem de in situ hibridizasyon (ISH) ve immünohistokimya (IHC) deneyleri ASPA'nın esas olarak beyinde konumlandığı, fakat nöronlar veya astrosit 11-16 oligodentrositler ifade olduğunu göstermektedir analizleri. Birkaç çalışmalarda ASPA da olabilir oCNS 12,14 olarak mikroglia olarak ifade edilebilir. Operasyonel olarak ASPA ifadesine Şimdiye kadar veriler sınırlıdır. Nöronlar, astrositler, OP'lerle, yeni kurulan oligodendrositler, myelinating oligodendrositler, mikroglia, endotelyal hücreler ve perisitlere dahil fare serebral korteks farklı hücre tiplerinin transcriptomes RNA sıralanması 17 ile analiz edildi Yeni bir araştırmaya göre, ASPA sadece oligodendrositlere ifade edilir , oligodendrositlerin myelinating özellikle (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Beyinde ASPA ifade deseni bu çalışmalara rağmen, belirsizliklerin bir dizi kalır.
Farklı teknikler gen ekspresyonu incelemek için kullanılabilir. IHC doku kesitlerinde bir gen ekspresyonunun işlevsel bir ürün (örneğin, protein) tespit etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. uygulama ve özgünlüğü tabi t gibi onun büyük yarar rağmen, bu tekniğin sınırlamaları vardırihtiyaç duyulan antikorun mevcudiyeti ve özgünlüğü o. Buna karşılık, ISH mRNA düzeyinde bir genin ekspresyonunu ortaya çıkarmak mümkün olma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, özel hücre tipleri için bir gen ekspresyonunu lokalize etmek için aynı anda birden fazla prob kullanımı teknik olarak zor olabilir. Bu yazıda, bir proteinin floresan immüno ile in situ hibridizasyon çift floresan RNA birleştiren bir protokol açıklar. Biz fare beyninde Aspa salgılanma modelini incelemek için teknikler bu dizi kullandık. Bu yöntem, konfokal mikroskopi kullanılarak gen ekspresyonunun hassas çalışma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı:
Fare hayvancılık ve taşıma Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler), Birleşik Krallık ve Değişiklik Yönetmeliği 2012 Yasası 1986 ile uyumlu, UK Home Office düzenlemeleri ve UCL etik komite kurallarına uygundur.
NOT: Tüm çözümler dietil pyrocarbonate (DEPC) ile yapılmalıdır - herhangi bir kalıntı RNAaz ari yok etmek için arıtılmış su. tüm DEPC globülleri sonra kayboldu DEPC aşağılamak için otoklav kadar DEPC tedavi için, DEPC (litre başına 1 ml) ekleyin, şiddetle çalkalanır.
1. RNA Probe Sentezi
- DİKKAT: formamid tutarken, Kişisel Koruyucu Ekipman (KKE) aşınma ve güvenlik kabini kullanın. Hibridizasyon tamponu hazırlayın: DEPC ile muamele edilmiş% 50 (h / h) deiyonize formamid, mM Tris-HCI, pH 7.5, 200 mM NaCI, 5 mM EDTA, 10 ile, iyonu giderilmiş suyun 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na-2 HPO 4, 0.01 mg / ml maya tRNA, 1 x Denhardt solutiilgili ve% 10 / h dekstran sülfat ağ.
- RNA polimeraz promotörüne sahip bir plazmid olarak, ilgi konusu genin cDNA dizisini ihtiva eden bir DNA klonu seçin. Bu örnek için, Aspa için T7 ve SP6 RNA polimeraz promoterleri (Ek Şekil 1) sahip bir pCMV-SPORT6 klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934) kullanın.
- şablon olarak doğrusallaştırılmış plazma DNA hazırlanır.
- DNA klonunun büyütün T7 ve SP6 evrensel primerler ile üreticinin protokolüne ve sırasına göre, küçük-ölçekli bir plazmid arındırma kiti ile plazmid ekstrakte edin.
- cDNA'nın yönlü sarmal kolunun 5 'ucunda kesen bir sınırlama enzimi ile 1.020 | ig plazmid DNA Digest. Bu örnek için, pCMV-SPORT6- Aspa plazmid sindirimi 100 birim SalI kullanın. 37 o C'de 1.5 saat süreyle inkübe edin
- plazmid tamamen doğrusallaştırılmış olup olmadığını kontrol etmek bir agaroz jel üzerinde küçük bir kısım çalıştırın.
- arındırmakfenol-kloroform kullanılarak doğrusallaştırılmış plazmit kullanmak avantajlıdır.
- 3 M sodyum asetatın 1/10 hacmi, 10 mM Tris HCI (pH 8.0), bir hacim ekleyin - dengelenmiş fenol ve kloroform / izoamil alkol (IAA), bir hacim (24: 1).
- (- 25 ° C, RT 20) ve özü, üst sulu faz, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin.
- 1 dakika için 16,000 x g'de kloroform / IAA, santrifüj, bir hacim ekleyin ve üst akıcı faz ekstrakte edin.
- Adımı tekrarlayın 1.4.3.
- Etanol 2 hacimleri ekleyin ve 1 saat ya da O / N -20 o C'de bırakın.
- 10 dakika boyunca 4 ° C'de 16,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
- % 70 soğuk etanol ile pelet yıkanır ve TE içinde 2.5 ul başına approximatively 1 ug cDNA (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7.5) yeniden askıya.
- İki prob, digoxigenin (DIG) ile etiketlenmiş bir ve flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile diğer sentez.
- Anti-se yapmak için uygun RNA polimeraz seçin(Hedefe mRNA tamamlayıcı) nse sonda. Bu örnek için, Aspa probu yapmak için T7 RNA polimerazını kullanır.
- In vitro transkripsiyon reaksiyonu hazırlayınız: 1 linearize DNA ug, 4.0 ul 5 x transkripsiyon tamponu, 100 mM DTT, 6.0 ul 10x DIG ya da FITC RNA işaretleme karışımı içeren dNTP 2.0 ul, 1 ul RNaz inhibitörü ve 20 - Tr 40 RNA polimerazının birim; DEPC arıtılmış su ile 20 ul son hacmi oluşturuyor.
- 1.5 saat 37 o C'de inkübe edin.
- % 1.0 agaroz jeli üzerinde transkripsiyon reaksiyonunun IKAZ1 ul reaksiyon çalıştığı kontrol etmek için. Jel doğrusal şablonu ve prob parlak bir bant göstermesi gerekir.
- melezleme tamponu ile 100 ul birimi oluşturacak ve -80 ° C'de 10 ul alikotları saklayın.
2. perfüzyon, Fiksasyon ve Doku Koleksiyonu
- DİKKAT: (PFA) paraformaldehid taşırken hem katı hem deSulu, PPE giymek ve bir güvenlik kabini kullanın. ısı (55 ° C) PFA 1x olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (ağ / hac)% 4 çözülmesiyle formaldehid çözeltisi hazırlayın. filtre kağıdı ile formaldehit çözüm Filtre.
- damıtılmış su içinde sükroz (ağ / hac)% 20 eritilerek sukroz çözeltisi hazırlayın ve% 0.1 (h / h) DEPC çözeltisi ilave edilir. gevşek kapaklı ve otoklav ile oda sıcaklığında O / N bırakın.
- Son aşamada pentobarbitonun intra-peritoneal enjeksiyonu (50 mg / kg) ile fare uyuşturan. ayak tutam anestezi derinliği değerlendirmek ve geri çekme refleksi yokluğu derin anestezi gösterir.
- Fare derin anestezi altına alındıktan sonra, göğüs kafesine altında bir kesi yapmak ve her iki tarafta göğüs kafesinin kesti, kalp maruz kaldırın.
- kalbin sol ventrikül içine 25 G iğne takın. kalbin sağ atrium küçük bir kesi yapmak.
- 20 mi, PBS ile hayvan ve daha sonra 40 mi formaldehid çözeltisi serpmek. P30 ve üzerifareler, 12 ml / dk'lık bir perfüzyon oranı kullanıldığında daha genç hayvanlar daha düşük bir oranı kullanım için (7-10 ml / dakika).
- beyin teşrih.
- Kulağımıza gelen bir kesim posterior yaparak cerrahi makas ile fare kafasını Sever. deride bir kaudal orta hat kesi yapmak ve kafatası cilt kaldırmak için rostrally çalışır.
- kaudal kısmından başlayarak, orta hat boyunca kafatasının üst kısmından ve İris makasla gözler arasındaki kesti. Bir kemik plaka bir tarafını her zaman devrilir ve cımbız ile kapalı yakalamaya tarafından parietal ve frontal kemik plakaları çıkarın.
- Yavaşça cımbız ile ön kısmından yukarı doğru beyin tilt ve optik sinirleri ve diğer kranial sinirler kesilir. Yavaşça kafatası dışına beyin kaldırın.
- Bir fare koronal beyin matriks içine beyin yerleştirin. Bir tüy jilet ile 3 yaklaşık 4 mm parçalar halinde beyin dilimleyin.
- % 4 PFA çözeltisi içine dilim aktarın ve 4 ° C'de O / N inkübe edin.
- aktarım beyindilim-DEPC işlenmiş% 20 sukroz çözeltisi ve 4 ° C 'de, O / N kuluçkalanması
- kuru cryomould içine her beyin dilim koyun, optimum kesme sıcaklığı (OCT) orta ile çevreleyen ve kuru buz üzerinde dondurma. -80 ° C'de saklayın.
3. Cryosectioning
- Bir kriyostat içinde donmuş doku 15 mikron bölümleri kesmek ve mikroskop lamı üzerine bölümleri toplamak. Eğer gerekirse, DEPC ile muamele edilmiş, PBS ile bölümleri ıslak ve ince bir fırça ile düzleştirin.
- Doku slayt uygun olduğundan emin olmak için yaklaşık 1 saat boyunca kurumaya slaytlar bırakın.
4. Melezleme
- 65 ° C yıkama tamponu hazırlayın: 150 mM NaCI, 15 mM Na-3 Cı 3H 5 O (COO) 3 (= 1x tuzlu su, sodyum sitrat), 50% (h / h) formamid ile% 0.1 (h / h) Tween 20.
- 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI,% 0.1 (h / h) Tween-20, pH 7,5: MABT tamponu hazırlayın.
- DIG etiketli ve FITC-işaretlenmiş (iki prob seyreltind) hibridizasyon tampon maddesi içinde 1 / 1.000 65 ° C'ye önceden ısıtılmış ve iyice karıştırın.
- Her bir slayt, coverslipwith fırında pişmiş (200 ° C) lamelleri üzerine hibritleme karışımının yaklaşık 300 ul uygulayın ve nemli bir oda içinde 65 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin.
- önceden ısıtılmış yıkama tampon içeren bir Coplin kavanoza slaytlar aktarın. Yıkama tamponu ile 65 ° C 'de iki kez 30 dakika için slaytlar yıkayın.
- Oda sıcaklığında, 10 dakika süreyle MABT ile üç kez slaytlar yıkayın.
FITC Probe 5. Görselleştirme
- ISH engelleme tamponu hazırlayın: MABT% 2 bloke reaktif ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş koyun serumu.
- İsteğe bağlı: Gerekli antikor çözümleri hacmini azaltmak için slayt doku bölümleri etrafında daireler çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın.
- ISH nemlendirilmiş bir odada Blokaj tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat için slaytlar inkübe edin.
- bir yaban turbu peroksidaz ile 4 ° C'de (POD) de slaytlar O / N inkübe - konjugatD, anti-FITC antikoru 1/500 (h / h) ISH engelleme tamponu seyreltilmiştir.
- % 0.1 (h / h) Tween-20 (PBST) ile PBS içeren bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin. her PBST içinde 10 dakika süre ile 3 kere yıkayın ve taze PBST ile değiştirin.
- Kullanımdan hemen önce, Amplifikasyon seyreltici olarak 100 kez seyreltilmesi ile floresan tiramid hazırlar. Bu örnek için, FITC-tiramid kullanımı.
- slaytlar bu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
- Bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin ve 10 dakika süre ile PBST içinde 3 kez yıkayın.
DIG Probe 6. Görselleştirme
- 0.1 M Tris-HCl, pH 8.2 hazırlanır.
- Oda sıcaklığında 1 saat için ISH bloke edici tampon ile slaytlar inkübe edin.
- bir alkalin fosfataz (AP) ile 4 ° C'de slaytlar O / N inkübe seyreltildi 1 / 1.500 (h / h) ISH engelleme tamponu, anti-DIG antikoru ile konjüge edilmiş.
- 10 dakika için üç kez MABT ile yıkayınız.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 M Tris-HCI pH 8.2 ile iki kez yıkanır.
- Kullanımdan hemen önce, 0.1 M Tris, pH 8.2 tabletler çözülmesiyle Hızlı Kırmızı solüsyon hazırlanır. 0.22 um'lik bir filtreden filtre solüsyonu.
- nemli bir oda içinde Hızlı Kırmızı çözelti ile 37 ° C'de slaytlar inkübe edin. uygun gelişimi için geçen sürenin de, çökeltinin oluşumuna izlemek için flüoresan mikroskop ile düzenli slaytlar edin. 3 saat - Bu örnekte, 2, sonra reaksiyonu durdurun.
- 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır.
7. İmmünhistokimya
- IHC bloke tamponu hazırlayın:% 10 PBST (birincil antikor konak için farklı türlerin) (h / h) serum.
- IHC nemlendirilmiş bir odada, oda sıcaklığında 1 saat süre ile blokaj tamponu ile slaytlar inkübe edin.
- Primer antikor hazırlanması (birincil antikor konakçıya farklı türlerin)% 5 serum ile PBST içinde, uygun bir seyreltme oranında primer antikor seyreltin. Bu örnekte, 1/400 (h / h) seyreltmede bir tavşan anti-olig2 antikor kullanımı.
- 4 ° de CO / N primer antikor çözeltisi içinde inkübe edin.
- 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır.
- İkincil antikor hazırlanması: Bu örnekte ve% 0.1 (h / h) Hoechst 33258. (farklı bir birincil antikor konak türlerin)% 5 ile PBST içinde, uygun bir seyreltme oranında (hac / hac), serum, bir florofor-konjuge sekonder antikor seyreltik 1 / 1.000 (h / h) seyreltmede ikincil antikor Alexa647 bir eşek anti-tavşan kullanın.
- 1 saat boyunca oda sıcaklığında ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin.
- 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır.
8. Montaj
- Kısmen oda sıcaklığında slaytlar kuru ve, floresan montaj ortamına sahip monte edilir. Hızlı Red için 570 nm, FITC için 488 nm, olig2 immüno için 647 nm ve Hoechst için 350 nm: 10X altında konfokal mikroskop sonra, 20X ve aşağıdaki uyarma dalga boyları ile 4 farklı kanalları kullanarak 63X hedefleri görüntü kuru ve slaytlar bırakın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede, bir fare beyin bölümlerinde immüno ardından çift flüoresan ISH için bir yöntem tarif eder. Bu protokolün kısa bir açıklama ilk adım Aspa ve MBP (miyelin bazik proteini) özel problar sentezlemek oldu Şekil 1'de gösterilmiştir. Probes sentezlenmiş olduğunu kontrol etmek için, her bir reaksiyonun küçük bir kısım, bir agaroz jel üzerinde yürütülmüştür. Hafif lineer şablonu ve RNA probu büyük miktarda (Şekil 2) görülebilir. Olig2 immüno Hoechst nükleer boyama ardından Aspa ve MBP için çift flüoresan ISH fare beyin kesitleri üzerinde yapıldı. Biz konfokal mikroskop beyin bölümleri taranmış ve beyinde gen ifade sinyallerin dağılımını ortaya çıkarmak için bir araya görüntüleri dikişli. Aspa ifade Mbp pozitif olarak (Mbp +) hücreleri sutyen boyunca gözlendi (Şekil 3). Ayrıca, daha yüksek bir büyütme kullanılarak, farklı beyin yapılarında Aspa ifadesini inceledi. Korteks ve korpus kallozumda oligodendrositler içinde Aspa sentezleme. Şekil 4'te MBP, olig2 ko-lokalizasyonunu gösterilmiştir ve Aspa Aspa korteks ve tek başına KK (Şekil 4) 'de yetişkin oligodendrositlerin bir alt ifade olduğunu gösterir. Bu sonuçlar, bu protokol, aynı zamanda beyin bölümlerinde üç farklı gen ifadelerini saptamak de göstermektedir.
İn Situ Hibridizasyon Çift Floresan Şekil 1. Protokol immunboyama izledi. Bu protokol, 5 gün boyunca çalışan ve üç genlerin ifade algılar./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Agaroz Jel. Lineer şablonu ve görülebilir bir az moleküler ağırlığa RNA prob büyük miktarda üzerinde Aspa RNA Probe 2. incelenmesi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fare Beyin bölümlerde Aspa ve MBP için In situ Hibridizasyon Şekil 3. Çift Floresan. Aspa (kırmızı) ve MBP (yeşil) dağılımını göstermek için bir araya dikişli bulundu. Ölçek çubuğu:. 500 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Korteks ve korpus kallosum oligodentrositler içinde Aspa Şekil 4. ifadesi. Paneller olig2 (mavi) immün ardından Aspa (kırmızı) ve MBP (yeşil) için ISH temsilcisi görüntüleri göstermek Hoechst boyama. Aspa ile birlikte bazı ifade edildi MBP + / olig2 + hücreleri korteks (A ve B) ve korpus kallozumda (C ve D). M bp + / olig2 + / Aspa + oklar ve Mbp + / olig2 + / Aspa ile gösterilir hücreler - hücrelerin genişlemiş paneller (B ve D) ok uçları ile gösterilir. Ölçek çubukları: 100 um (A ve C); 20 mikron (B ve D). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 1. Sıra ve Aspa Clone Haritası (IRAVp968C0654D). Aspa bölgesinin 1,5KB cDNA dizisidir pCMV-Sport6 plazmid (A) içine sokuldu. PCMV-Sport6-Aspa plasmidinin haritası (B) 'de gösterilmektedir.m / files / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol immün tarafından takip In situ hibridizasyon çift RNA için bir adım-adım prosedürü sağlar. Biz Aspa birkaç beyin bölgelerindeki olgun oligodendrosit ifade edilmektedir onaylamak için bu protokolü kullanılır.
Bu çok aşamalı prosedür hassasiyetini etkileyebilir ve kaçınılmalıdır pek çok potansiyel tuzaklar vardır. İlk olarak, transkripsiyon reaksiyonu için tüm çözümleri ve depolama tamponlar RNaz ücretsiz olması gerekir. İkinci olarak, cDNA şablonları seçimi önemlidir ve biz uzunluğu yaklaşık 1kb şablonları tercih ederim. Bu fenol / kloroform ekstraksiyon ve cDNA şablonları temizlemek için gerekli olan in vitro transkripsiyon önce onları yeniden hızlandırabilir. Buna ek olarak, sondanın transkripsiyon uygun olması gerekir; Sonda yeterli miktarda üretilen değilse, o ISH kalitesini azaltacaktır. prob kalitesi bir agaroz jeli üzerinde inceleyerek kontrol edilebilir ve kaliteli olurŞablon bandı (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında prob grubun güçlü parlaklık kanıtladığı. çift ISH, iki farklı etiketli sondalar, genellikle DIG etiketli bir ve FITC ile diğer kullanılmaktadır. FITC-işaretli prob az saptanabilir ve hedef mRNA dokuda yüksek olması beklenmektedir burada seçilmelidir olarak kabul edilir. Bu sonda genellikle ilk geliştirilmiş ve DIG etiketli prob, ikinci geliştirilmiştir.
Diğer önemli adım doku hazırlıktır. Fareler% 4 PFA, ardından DEPC ile muamele edilmiş, PBS ile perfüze edilir,% 4 PFA O / N sabit yazılan ve daha sonra herhangi bir kalıntı RNAaz ari yok etmek DEPC ile muamele edilmiş olan% 20 şeker çözeltisinin cryoprotected. Tespit süresi oldukça önemlidir; aşırı veya eksik tespit nedeniyle mRNA (altı fiksasyon) indirgenmiş sondası (aşırı fiksasyon) nüfuz etmesine veya bozunmaya belki de daha zayıf bir sinyal yol açabilir. Daha sonra doku cryosectioned ve iki prob N / O melezleşmiştir. formamidhibridizasyon tamponu içinde kullanılan deiyonize gerekmektedir. Bu duyarlılık tehlikeye atabilir olarak 65 ° C'de O / N hibridizasyon sırasında çok önemli bir göz hibritleme karışımının buharlaşma ve konsantrasyonu kaçınmaktır. deneyde 65 CO / N de melezleme gerçekleştirildi açıklanan, ancak hedef mRNA tespit etmek zor gibi görünüyor eğer farklı problar için düşük sıcaklıklara denemeye değer olabilir.
melezleştirilmiş sondalar tespit edilmesi için reaktif bir seçim var. Fast Red hassas bir floresan reaktif değil Fast Red tüm toplu aynı sonucu verir. Bu gelişme AP ihtiyacı ve rodamin uyarma ile floresan verir. Bizim deneyimlerimize göre, 0.1 M Tris-HCI pH 8.2 ile taze yapmak ve kullanmadan önce bu filtre önemlidir. Bir floresan olmayan bir seçenek nitro-mavisi tetrazolyum (NBT) ile aynı AP-konjüge edilmiş antikor ile birlikte çalışır, 5-bromo-4-kloro-3'-indolyphosphate (BCIP) ile renkli bir gelişmedir. another seçenek tespiti için floresan tiramid kullanıyor. floresan tiramid sistemleri en hassas yöntemler olmamakla birlikte, yaban turpu peroksidaz ile gelişen reaksiyon çok hızlı ve en az üç floresan renkler kullanılabilir (FITC, Siyanin 3 ve Siyanin 5) vardır. Bu protokolün bir sınırlama bazı hedef antijenleri (ya da epitopları), özellikle de düşük bolluk proteinleri, ISH işleminden sonra tespit edilemez ve bu nedenle ISH sonra IHC için uygun değildir olmasıdır. Bizim immün olarak, olig2 antikor tespiti etkilenmemiş görünüyor. kullanıcı aşağıdaki ISH immünoişaretleme için doğru antikor seçmeniz gerekir.
İHK ve ISH yaygın gen ifadesi desen çalışmaları için teknikler kullanılır ve her iki artıları ve eksileri var. IHC beyin bölümlerinde genlerin hücresel ekspresyonunu tespit etmek için bir çok hassas bir yöntemdir, ancak antikor üzerindeki bağımlılığı özgüllüğü etkiler ve bunun uygulanmasını kısıtlar. Buna karşılık, ISH yüksek spec vardırspesifite ve herhangi bir genin probu kolaylıkla şablon olarak gene özgü cDNA kullanılarak, in vitro transkripsiyonu ile sentezlenebilir. Geliştirdiğimiz protokol yüksek özgüllük ile gen ifadesinin üçlü algılama ulaşmak için İHK çift ISH birleştirerek, her iki yöntemin yararlanır.
Kısacası, biz burada açıklamak protokol iki mRNA ve bir proteinin aynı anda boyama sağlar, bu yüzden birlikte lokalize gen ekspresyonunu gösteren için yararlı bir araç sağlar. mRNA ifadesinin her zaman protein ifadesi ile ilişkili değildir gerçeğine rağmen, ISH bize yüksek özgüllük ile gen ifadesini incelemek için olanak sağlayan güçlü bir tekniktir. İHK ile birlikte çift floresan ISH bizim protokol erişkin farelerin beyin dokusundaki oligodendrosit bir alt kümesi Aspa ifadesini tespit bir başarı olduğunu kanıtlamıştır ve kolayca farklı kökenlerden ve gelişim aşamaları dokuların çeşitli adapte edilebilir. Buna ek olarak, bu protokolAyrıca miRNA küçük RNA'ların ekspresyonunu tespit etmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
