Abstract
在不同类型的脑细胞如神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞，少突胶质细胞前体和小胶质细胞的基因表达的检测，可通过缺乏免疫染色特定一次或二次抗体的受到阻碍。这里，我们描述一个协议，以检测在同一脑切片三种不同的基因使用原位杂交双荧光表达两个基因特异性探针，接着用高特异性针对由第三基因编码的蛋白质的抗体的免疫染色。所述Aspartoacyclase（ASPA）基因，其中突变可导致一种罕见的人类白质疾病-卡纳疾病-被认为在少突胶质细胞和小胶质细胞，但不是在星形胶质细胞和神经元中表达。然而，在大脑ASPA的精确表达模式还没有被确立。该协议使我们能够确定ASPA在成熟的少突胶质细胞的一个子集表示第二，可以普遍适用于广泛的基因表达模式的研究。
Introduction
神经胶质细胞，这是最丰富的细胞在中枢神经系统（CNS），包括少突胶质细胞（CNS的髓鞘形成细胞），少突胶质细胞前体（OP的，也被称为“NG2细胞”），星形胶质细胞和小胶质细胞。有在神经胶质细胞和他们的潜在作用的功能越来越大的兴趣在神经性疾病1。例如，卡纳万病（CD）是一种遗传性神经退行性疾病与海绵状脑白质营养不良和神经元的逐渐丧失起步阶段起步早，一般10年之前的2,3岁时导致死亡。在Aspartoacyclase（ASPA）基因突变导致急剧减少ASPA活动4 CD已经确定。 ASPA是催化N-乙酰（NAA）的脱乙酰酶，高度集中在脑的分子，产生乙酸和天冬氨酸5-7。许多CD患者表现出由于缺乏交流ASPA更高水平的NAA拉了一。一些研究推测NAA衍生醋酸可以是脂肪酸/在大脑中脂质的主要来源发育期间和CD可能导致引起NAA未能发展被分解-3,5,6-期间减少髓鞘合成。
ASPA在大脑的肾脏，肝脏和白质主要存在，并给予ASPA的在光盘中的重要作用，在大脑中的这种酶的细胞表达，研究了几个实验室。通过查看在大脑ASPA酶活性，以前的研究发现，脑发育过程中的增加ASPA活性平行髓鞘8-10的时间过程。在细胞水平，对酶的活性，以及原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）测定分析表明，ASPA主要表达在大脑，但不是在神经元或胶质细胞11-16少突胶质细胞。一些研究发现，ASPA也说不定在小神经胶质细胞在CNS 12,14来表示。在有机磷农药对ASPA表达到目前为止的数据是有限的。根据最近的研究，其中在小鼠大脑皮层包括神经元，星形胶质细胞，有机磷农药，新形成的少突胶质细胞，髓鞘少突胶质细胞，小胶质细胞，内皮细胞和周细胞不同的细胞类型的转录由RNA测序17进行了分析，ASPA专门在少突胶质细胞表达，特别是在髓鞘少突胶质细胞（http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html）。尽管在大脑ASPA表达模式这些研究中，一些不确定因素仍然存在。
不同的技术可用于研究基因表达模式。 IHC是用于组织切片检测基因表达的功能的产品（ 即，蛋白质）通常使用的方法。尽管它的巨大效用，这种技术具有局限性，因为它的应用和特异性对象TØ所需的抗体的可用性和特异性。通过比较，ISH具有能够在mRNA水平发现任何基因的表达的优点。然而，它可以是在技术上具有挑战性的，以便定位一个基因的表达，以特定的细胞类型，同时使用几种探针。在这篇文章中，我们描述了一个协议， 原位杂交蛋白质的免疫标记荧光双结合的荧光RNA。我们使用这组技术来检查电力局在小鼠大脑的表达模式。此方法允许使用共聚焦显微镜的基因表达的精确研究。
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Protocol
伦理声明：
鼠标畜牧业和处理都是按照英国内政部规定和UCL伦理委员会的指导方针，与动物（科学程序）英国和它的修订规例2012年1986年法案规定。
注意：所有的解决方案应与焦碳酸二乙酯（DEPC）进行 - 处理后的水破坏任何残留的核糖核酸酶。对于DEPC处理，加入DEPC（1毫升，每公升），用力摇晃直到所有的DEPC球已经消失，然后高压灭菌降解DEPC。
1. RNA探针合成
- 注意：在处理甲酰胺，佩戴个人防护装备（PPE），并使用安全柜。制备杂交缓冲液：DEPC处理，用50％（体积/体积）去离子甲酰胺，200 mM氯化钠，5mM的EDTA，10mM的Tris-盐酸pH为7.5，去离子水的5mM的NaH 2 PO 4，5mM的的 Na 2 HPO 4， 0.01毫克/毫升酵母tRNA，1×Denhardt氏soluti上，和10％w / v的硫酸葡聚糖。
- 选择包含感兴趣的基因在与RNA聚合酶启动子的质粒中的cDNA序列的DNA克隆。对于这个例子，使用的pCMV-SPORT6克隆，IRAVp968C0654D（Genbank登录accessionBC024934），用T7和SP6 RNA聚合酶启动子为电力局 （ 补充图1）。
- 制备线性化质粒DNA为模板。
- 生长的DNA克隆，根据生产商的方案和序列与T7和SP6通用引物与一个小规模的质粒纯化试剂盒提取质粒。
- 消化与切割在cDNA的有义链的5'端的限制性内切酶1020微克质粒DNA。在这个例子中，使用100单元萨尔我消化的pCMV-SPORT6- 电力局质粒。孵育1.5小时在37℃。
- 在琼脂糖凝胶上运行一个小等分，以检查质粒是完全线性化。
- 净化线性化质粒用苯酚 - 氯仿。
- 添加1/10体积的3M乙酸钠，10毫摩尔Tris盐酸（pH 8.0）中的一体积 - 平衡酚和氯仿/异戊醇（IAA）的一个卷（24：1）。
- 离心16,000 xg离心在RT 1分钟（20 - 25℃，RT）和提取上层水相。
- 16,000 xg离心添加氯仿/ IAA，离心机一体积为1分钟，并提取上层水相。
- 重复步骤1.4.3。
- 加入2倍体积的乙醇，在-20℃下1小时或O / N离开。
- 离心机在4℃，16,000g XG 10分钟。弃去上清液。
- 用70％冷乙醇洗涤沉淀，并在TE的每2.5微升近似1微克的cDNA（10毫米的Tris-HCl，1mM EDTA中pH7.5）中再悬浮。
- 合成两个探针，其中一个标与地高辛（DIG）和其他与异硫氰酸荧光素（FITC）。
- 选择适当的RNA聚合酶，使防本身NSE探针（与靶mRNA互补）。对于这个例子，使用T7 RNA聚合酶使电力局探针。
- 制备体外转录反应：添加线性DNA的1微克，4.0微升5×转录缓冲液，6.0微升100mM的DTT，含有的dNTPs 10倍DIG或FITC RNA标记混合2.0微升，1微升RNA酶抑制剂，和20 - 40 RNA聚合酶的单位;使终体积达20微升用DEPC处理过的水。
- 在37℃下1.5小时。
- 在1.0％琼脂糖凝胶的转录反应的RUN1微升，以检查反应工作过。凝胶应显示线性模板和探针的亮带。
- 定容至100微升与杂交缓冲液和储存10微升等分在-80℃。
2，灌注，固定和组织收集
- 注意：在处理多聚甲醛（PFA），固体和水，穿PPE和使用安全柜。通过使用热（55℃）中溶解11％（重量/体积）的PFA成1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液制备甲醛溶液。过滤用滤纸甲醛溶液。
- 通过将20％（重量/体积）在蒸馏水蔗糖制备蔗糖溶液，并添加0.1％（V / V）的DEPC溶液。离开O / N在室温下用一个松散的盖子，然后高压灭菌。
- 由戊巴比妥的腹腔注射（50毫克/千克）末期麻醉鼠标。通过脚趾捏评估麻醉深度和无撤退反射表示深度麻醉。
- 一旦鼠标深度麻醉下，使肋笼下方的切口，并通过在两侧胸廓切开，将其提起，以暴露心脏。
- 插入一个25-G针头插入心脏的左心室。使心脏的右心房一个小切口。
- 灌注用20ml PBS中动物然后再加入40ml甲醛溶液。对于P30和老年人小鼠中，使用12毫升/分的灌注速率，但对于较年轻的动物使用较低的速率（7 - 10ml /分钟）。
- 解剖大脑。
- 通过从耳朵切后断绝老鼠头部手术剪。使皮肤尾部正中切口，并吻侧工作从颅骨去除皮肤。
- 从尾椎部位开始，沿着穿过中线颅骨顶部和虹膜剪眼睛之间切割。通过倾斜每次骨板的一侧和用镊子捕捉它关闭除去壁层和额骨板。
- 轻轻地用镊子前部向上倾斜大脑并切断视神经和其他颅神经。轻轻提起大脑出了头骨。
- 将脑入小鼠大脑冠状矩阵。切片脑入3约4mm件用羽毛刀片。
- 转移切片放入4％PFA解决方案，并在4℃孵育O / N。
- 脑转移切片DEPC-处理20％蔗糖溶液中并在4℃孵育O / N
- 每个脑切片放入干cryomould，环绕以最佳的切削温度（OCT）中，冻结的干冰。存储在-80℃。
3. Cryosectioning
- 切冷冻组织15微米的部分在低温恒温器和收集部分到显微镜载玻片。如果需要的话，润湿部分用DEPC处理过的PBS中，并用细画笔弄平它们。
- 离开载玻片干燥约1小时，以确保该组织附着在滑动。
4.杂交
- 制备65℃洗涤缓冲液：150mM的氯化钠，15mM的钠3 C 3 H 5 O（COO）3（= 1×盐水柠檬酸钠），50％（体积/体积）甲酰胺和0.1％（体积/体积）吐温20。
- 制备MABT缓冲液：100mM的马来酸，150mM的氯化钠，0.1％（体积/体积）吐温20，pH值7.5。
- 稀两个探针（DIG标记和FITC-拉贝里d）在杂交缓冲1 / 1,000预热至65℃，并充分混合。
- 应用约300微升杂交混合到每张幻灯片，coverslipwith烤箱烤制（200℃）和盖玻片在湿盒孵育O / N在65℃。
- 转移滑入含有预热的洗涤缓冲液中的科普林缸。在65℃用洗涤缓冲液洗玻片30分钟两次。
- 在RT洗玻片10分钟以MABT三次。
5.可视化的FITC探头
- 制备ISH封闭缓冲液：MABT用2％封闭试剂和10％热灭活的羊血清。
- 可选：用疏水性笔在幻灯片上绘制周围的组织切片圈，以减少所需的抗体溶液的体积。
- 用原位杂交在湿润的腔室封闭缓冲液孵育1小时的幻灯片在RT。
- 孵育的幻灯片O / N在4℃用辣根过氧化物酶（POD） - 共轭ð抗FITC抗体稀释1/500（体积/体积）中的ISH封闭缓冲液。
- 放置载玻片到含有PBS中的0.1％（体积/体积）吐温20（PBST）一个科普林缸。洗3次，在PBST 10分钟，并用新鲜的PBST替换各一次。
- 临用前，稀释100倍到扩增稀释剂准备荧光酪胺。对于这个例子，使用FITC标记的酪酰胺。
- 这种添加到幻灯片，并留下在室温下10分钟。
- 放置滑入一个科普林缸和在PBST中洗涤3次，每次10分钟。
6.可视化的DIG探头
- 准备0.1M的盐酸三 - 8.2 pH值。
- 孵育ISH封闭缓冲液的幻灯片在RT 1小时。
- 用碱性磷酸酶（AP）孵育载玻片O / N在4℃偶联的抗DIG抗体稀释1/1500（V / V）在ISH封闭缓冲液。
- 与MABT洗10分钟三次。
- 用0.1M的Tris-HCl pH值8.2洗两次，在室温5分钟。
- 在使用之前，立即在0.1米的Tris pH值8.2溶解药片准备快速红色溶液。过滤通过0.22微米过滤器的溶液。
- 用在湿润的腔室快速红溶液孵育载玻片在37℃。作为最佳发展的时间变化，定期检查载玻片用荧光显微镜监测沉淀物的形成。对于这个例子，停止后2中的反应 - 3小时。
- 用PBST洗10分钟三次。
7.免疫组化
- 制备IHC阻断缓冲液：10％（V / V）血清在PBST（不同物种初级抗体主机）。
- 孵育IHC在湿润室中于室温封闭缓冲液1小时幻灯片。
- 准备一抗：稀释一级抗体在PBST中适当的稀释，用5％血清（不同的物种，以初级抗体主机）。对于这个例子，使用兔抗Olig2的抗体以1/400（体积/体积）稀释。
- 孵育在4℃CO / N第一抗体溶液。
- 用PBST洗10分钟三次。
- 制备第二抗体：在PBST适当稀释稀释荧光团共轭次级抗体，用5％（V / V）的血清和0.1％（体积/体积）的Hoechst 33258（一个不同的物种，以初级抗体主机）对于本例使用驴抗兔Alexa647第二抗体以1 / 1,000（体积/体积）稀释。
- 孵育在室温二级抗体溶液1小时。
- 用PBST洗10分钟三次。
8.安装
- 部分干燥在RT载玻片，并用荧光封固介质装入。离开滑动10X下，在共聚焦显微镜干燥，然后图像，20X和使用4个不同的信道使用以下的激发波长63X目标：用于固红570纳米，FITC 488纳米，Olig2的免疫标记647 nm和Hoechst的350纳米。
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Representative Results
本文介绍了一个双荧光原位杂交，然后在鼠脑切片免疫标记的方法。此协议的简要描述在图1中示出的第一步骤是合成特定电力局和MBP（髓鞘碱性蛋白 ）探针。检查该探针已经合成，每个反应中的一小等份在琼脂糖凝胶上运行。微弱的线性模板和大量的RNA探针可以看出（ 图2）。 为 电力局和MBP双荧光原位杂交，其次是Olig2的免疫标记和赫斯特核染色，于小鼠脑切片进行。我们在MBP阳性扫描共焦显微镜的脑切片和缝合图像一起以显示在大脑中的基因表达的信号的分布。 电力局表达整个胸罩观察（MBP +）细胞在（图3）。我们还研究了在使用较高的放大倍率不同的大脑结构电力局表达。 在皮质和胼胝体少突电力局表达示于图4中 。MBP，Olig2的所述的共定位，并且电力局表示电力局是在皮质和胼胝体（图4）成熟少突胶质细胞的一个子集表示。这些结果表明，该协议可以同时检测在脑切片的三个不同的基因的表达。
图1.协议双 荧光原位 杂交免疫染色其次。该协议运行在5天检测三个基因的表达。/files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2.考试 电力局 RNA探针的琼脂糖电泳，线性模板和大量可以观察到较小分子量的RNA探针的 。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.双荧光 小鼠脑切片 原位杂交 电力局 和 MBP。 电力局 （红色）和MBP（绿色）在大脑中的分布。比例尺：500微米请点击此处查看该图的放大版本。
一些与会者表示在皮质和胼胝体少突胶质细胞与Hoechst染色。 电力局结合电力局 的图4.表达 。面板显示来自ISH代表图像为电力局 （红色）和MBP（绿色），其次是Olig2的（蓝色）的免疫染色MBP + / Olig2的+细胞在皮层（A和B）和在胼胝体（C和D），M碱基+ / Olig2的+ / 电力局 +细胞都用箭头指示和MBP + / Olig2的+ / 电力局 -细胞与在放大板（B和D）箭头指示。比例尺：100微米（A和C）; 20微米（B和D）。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1. 顺序和地图电力局克隆的（IRAVp968C0654D）。 电力局的1.5kb的cDNA序列插入的pCMV-SPORT6的质粒（A）中。的pCMV-SPORT6-电力局质粒的图谱显示于（B）中。M /文件/ ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg“目标=”_空白“>请点击这里下载该文件。
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Discussion
该协议提供了一个一步一步的过程原位杂交双RNA后免疫。我们已经用这种协议来确认电力局在几个脑区表达成熟的少突胶质细胞。
这个多步过程有可能影响灵敏度，应该避免了许多潜在的隐患。首先，用于转录反应的所有解决方案和存储缓冲器需要是无RNase。第二，cDNA的模板的选择是重要的，我们在长度大约1kb的偏爱模板。 体外转录之前，有必要进行清理用苯酚/氯仿萃取和中的cDNA模板再沉淀它们。此外，探针的转录需要最佳;如果探针未以足够的量产生的，它会降低ISH的质量。探针的质量可以通过检查它在琼脂糖凝胶上进行检查和良好的质量将由探针频带的亮度强相比，模板带（ 图2）证实。对于双ISH，两个不同标记的探针使用时，通常是用DIG标记的及其他用FITC。 FITC标记的探针被认为是至少可检测的并且其中靶mRNA预计将在组织最高应选择。该探针通常是开发第一和DIG标记的探针第二开发。
另一个关键步骤是组织制备。小鼠灌注DEPC处理的PBS随后4％PFA，后固定在4％PFA O / N，然后在20％蔗糖溶液已DEPC处理以破坏任何残留的RNase低温保护。固定时间是非常重要的;过度或固定可导致较弱的信号，可能是由于减少了探针穿透（过固定）或降解mRNA的（下固定）的。然后，将组织冰冻切片和两个探针杂交O / N。在甲酰胺需要去离子中的杂交缓冲液中使用。在65℃的O / N杂交过程的一个非常重要的考虑是避免杂交混合物的蒸发浓缩，因为它可能破坏灵敏度。在实验中所描述，我们在65 CO / N进行杂交，但如果它似乎是难以检测靶mRNA它可能是值得尝试了不同探针较低的温度。
有试剂的用于检测杂交的探针的选择。永固红是一个敏感的荧光试剂但不耐晒大红的所有批次给出相同的结果。它需要AP的发展，并给出荧光罗丹明激发。在我们的经验，使其新鲜的0.1M的Tris-HCl pH值8.2并在使用前进行过滤是很重要的。非荧光的选择是彩色显影硝基四氮唑蓝（NBT）和与相同的AP缀合的抗体工程5-溴-4-氯-3'- indolyphosphate（BCIP）。肛疗法的选择是使用荧光酪胺进行检测。虽然荧光酪胺系统都不是最灵敏的方法，与辣根过氧化物酶的显影反应是非常快速和有至少三个荧光色素（FITC，花青3和花青5）都可以使用。此协议的一个限制是，有些靶抗原（或表位），特别是低丰度蛋白质，未必是ISH处理后可检测，因此不适合用于IHC ISH之后。在我们的免疫染色，Olig2的抗体检测似乎不受影响。用户需要选择合适的抗体免疫标记以下ISH。
免疫组化和原位杂交通常用于基因表达谱研究技术，并都有利弊。 IHC是用于检测脑切片的基因的细胞表达一个高度敏感的方法，但其对抗体依赖影响其特异性和限制了其应用。相比之下，ISH具有高规格ificity和任何基因的探针可以容易地通过体外转录使用基因特异性cDNA为模板来合成。我们开发的协议利用了这两种方法的优势，双ISH与IHC相结合，实现高特异性基因表达的三重检测。
总之，我们在这里描述的协议使两种mRNA和一种蛋白质的同时染色，因此它提供了用于示出共定位的基因表达的有用工具。尽管表达并不总是与蛋白表达相关，ISH是一个强大的技术，使我们能够审视高特异性基因表达。我们的双荧光原位杂交用IHC组合的协议已被证明是在成年小鼠的脑组织中的少突胶质的一个子集检测电力局表达成功的，并且它可以容易地适应于各种不同的起源和发育阶段的组织。此外，该协议也可以用于检测小RNA的表达，如miRNA的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
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