Abstract
الكشف عن التعبير الجيني في أنواع مختلفة من خلايا الدماغ على سبيل المثال، الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، قليلة التغصن، السلائف دبقية قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة، التي يمكن أن تعوق عدم وجود الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية محددة لالمناعية. نحن هنا تصف بروتوكول للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات مختلفة في قسم المخ نفسه باستخدام مضان مزدوجة في الموقع التهجين مع تحقيقين جينات محددة تليها المناعية مع الأجسام المضادة من نوعية عالية الموجهة ضد البروتين المشفرة بواسطة الجينات الثالث. ويعتقد أن يتم التعبير عنها قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة ولكن ليس في الخلايا النجمية والخلايا العصبية - وAspartoacyclase (ASPA) الجينات، والطفرات التي يمكن أن تؤدي إلى مرض المادة البيضاء البشري النادر - مرض كانافان. ومع ذلك، لم يتم بعد تأسيس نمط التعبير الدقيق للASPA في الدماغ. وقد سمح لنا هذا البروتوكول لتحديد ما ASPA يتم التعبير في مجموعة فرعية من الخلايا قليلة التغصن ناضجة لالثانية يمكن تطبيقه بصفة عامة إلى مجموعة واسعة من الدراسات نمط التعبير الجيني.
Introduction
تتكون الخلايا الدبقية، وهي الخلايا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، قليلة التغصن (الخلايا myelinating من CNS)، قليلة التغصن السلائف (مكتب خدمات المشاريع، التي تعرف أيضا باسم "خلايا NG2")، الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. هناك اهتمام متزايد في وظائف الخلايا الدبقية وأدوارهم المحتملة في الأمراض العصبية 1. على سبيل المثال، مرض كانافان (CD) هو اضطراب وراثي الاعصاب تبدأ في مرحلة الطفولة مع حثل المادة البيضاء الإسفنجي والفقدان التدريجي للخلايا العصبية في وقت مبكر، مما يؤدي إلى الموت عادة قبل 10 سنة من العمر 2،3. طفرات في الجين Aspartoacyclase (ASPA) التي تؤدي إلى انخفاض شديد في النشاط ASPA 4 في مؤتمر نزع السلاح تم تحديدها. ASPA هو انزيم تحفيز deacetylation من N-acetylaspartate (NAA)، وهو جزيء تتركز بشكل كبير في الدماغ، وتوليد خلات واسبارتاتي 5-7. تظهر العديد من المرضى CD مستويات أعلى من ناه بسبب عدم وجود ASPA ميلانالناقلية. بعض الدراسات أن يخمن خلات المستمدة ناه-يمكن أن تكون مصدرا رئيسيا من الأحماض الدهنية / الدهون في الدماغ أثناء التطور ومؤتمر نزع السلاح قد تنجم عن انخفاض تركيب المايلين خلال تطوير الناجمة عن فشل ناه إلى تقسيمها 3،5،6.
ASPA وجدت في الغالب في الكلى والكبد والمادة البيضاء في الدماغ، ونظرا للدور الهام من الإقليمين في مؤتمر نزع السلاح، وقد درس التعبير الخلوية من هذا الانزيم في الدماغ عن طريق عدة مختبرات. من خلال النظر في النشاط الأنزيمي ASPA في الدماغ، وجدت دراسات سابقة أن الزيادة في النشاط ASPA أثناء نمو المخ يوازي مدار الساعة من تكون الميالين 8-10. على المستوى الخلوي، المقايسات للنشاط الأنزيمي وكذلك الموقع التهجين (ISH) والمناعية (IHC) في التحليلات تشير إلى أن ASPA يعبر عنها بشكل رئيسي في الخلايا قليلة التغصن في الدماغ ولكن ليس في الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية 11-16. وقد وجدت بعض الدراسات أن ASPA ربما أيضايمكن التعبير عنها في الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي 12،14. بيانات حتى الآن على التعبير ASPA في مكتب خدمات المشاريع محدودة. وفقا لدراسة حديثة حيث تم تحليل ترنسكربيتوم من أنواع مختلفة من الخلايا في قشرة الدماغ الماوس بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، مكتب خدمات المشاريع، قليلة التغصن التي شكلت حديثا، myelinating قليلة التغصن، الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية، وpericytes التي كتبها RNA التسلسل 17، وأعرب عن ASPA حصرا في الخلايا قليلة التغصن ، ولا سيما في myelinating قليلة التغصن (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). وعلى الرغم من هذه الدراسات على نمط التعبير ASPA في الدماغ، لا يزال هناك عدد من الشكوك.
تقنيات مختلفة يمكن استخدامها لدراسة أنماط التعبير الجيني. IHC هو طريقة تستخدم عادة للكشف عن المنتجات وظيفية (أي البروتين) من التعبير الجيني في أقسام الأنسجة. وعلى الرغم من فائدتها كبيرة، وهذا الأسلوب له قيود تطبيقه وخصوصية ور تخضعس توافر ونوعية الأجسام المضادة اللازمة. وعلى سبيل المقارنة، ISH لديها ميزة كونها قادرة على الكشف عن التعبير عن أي الجينات على مستوى مرنا. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون تحديا تقنيا لاستخدام عدة تحقيقات في نفس الوقت من أجل توطين التعبير الجيني لأنواع معينة من الخلايا. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول الجمع مزدوج RNA مضان في الموقع التهجين مع immunolabelling مضان من البروتين. وقد استخدمنا هذه مجموعة من التقنيات لدراسة نمط التعبير عن الإقليمين في مخ الفأر. وتسمح هذه الطريقة دراسة دقيقة في التعبير الجيني باستخدام متحد البؤر المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أخلاقيات الإعلان:
الماوس تربية والتعامل معها هي وفقا للوائح المملكة المتحدة وزارة الداخلية والمبادئ التوجيهية لجنة الأخلاقيات كلية لندن الجامعية، والامتثال لقانون 1986 من المملكة المتحدة واللوائح التعديل لعام 2012 الحيوانات (الإجراءات العلمية).
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول مع اثيل pyrocarbonate (DEPC) - المياه المعالجة لتدمير أي ريبونوكلياز المتبقية. لتلقي العلاج DEPC، إضافة DEPC (1 مل لكل لتر)، يهز بقوة حتى اختفت جميع الكريات DEPC ثم الأوتوكلاف إلى تدهور DEPC.
1. RNA التحقيق التجميعي
- تنبيه: عند التعامل مع الفورماميد، وارتداء معدات الوقاية الشخصية (PPE) واستخدام خزانة السلامة. إعداد العازلة التهجين: الماء منزوع الأيونات مع 50٪ (ت / ت) منزوع الأيونات الفورماميد، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، المعالجة DEPC 5 ملي ناه 2 ص 4 و 5 ملي نا 2 هبو 4، 0.01 ملغ / الحمض الريبي النووي النقال الخميرة مل، 1 × soluti دينهارت لعلى، و 10٪ ث / ت ديكستران كبريتات.
- اختيار استنساخ الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل كدنا] من الجين من الفائدة في البلازميد مع المروجين بوليميريز الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، استخدم نسخة pCMV-SPORT6، IRAVp968C0654D (بنك الجينات accessionBC024934)، مع T7 وSP6 RNA المروجين البلمرة لالإقليمين (الشكل التكميلي 1).
- إعداد البلازميد خطي كقالب.
- تنمو استنساخ الحمض النووي، واستخراج البلازميد مع نطاق صغير عدة تنقية البلازميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والتسلسل مع T7 والاشعال عالمية SP6.
- هضم 1020 ميكروغرام DNA البلازميد مع انزيم التقييد الذي يمر في نهاية 5 'من حبلا معنى كدنا]. على سبيل المثال، استخدم 100 وحدة سال أنا لهضم البلازميد pCMV-SPORT6- الإقليمين. احتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تشغيل قسامة صغيرة على هلام الاغاروز للتأكد من أن البلازميد هو خطي تماما.
- تنقيةالبلازميد خطي باستخدام الفينول الكلوروفورم.
- إضافة 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم، وحجم واحد من 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) - الفينول معايرتها وحجم واحد من كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (IAA) (24: 1).
- أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة في RT (20 - 25 درجة مئوية، RT) واستخراج المرحلة المائية العليا.
- إضافة مجلد واحد من كلوروفورم / IAA، الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة، واستخراج المرحلة المائية العليا.
- كرر الخطوة 1.4.3.
- إضافة 2 مجلدات من الايثانول وترك في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو O / N.
- أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف.
- غسل بيليه مع الايثانول البارد 70٪ وإعادة تعليق في تقريبي 1 ميكروغرام [كدنا في 2.5 ميكرولتر في TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA 7.5 درجة الحموضة).
- تجميع تحقيقات اثنين، واحد المسمى مع Digoxigenin (DIG) والآخر مع ثيوسيانات فلوريسئين (FITC).
- حدد البلمرة RNA المناسب لجعل مكافحة حد ذاتهاالتحقيق NSE (مكمل لهدف مرنا). على سبيل المثال، استخدام T7 RNA البلمرة لجعل ASPA التحقيق.
- إعداد في المختبر رد فعل النسخ: إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي خطي، 4.0 ميكرولتر 5 العازلة النسخ س، 6.0 ميكرولتر من 100 ملي DTT، 2.0 ميكرولتر من 10X DIG أو FITC RNA وضع العلامات مزيج يحتوي على dNTPs، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، و20 - 40 وحدات البلمرة RNA. جعل الحجم النهائي يصل إلى 20 ميكرولتر مع المياه المعالجة DEPC.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
- ميكرولتر Run1 من رد فعل النسخ على هلام الاغاروز 1.0٪ للتحقق من أن رد الفعل عملت. يجب أن تظهر هلام القالب الخطي والفرقة مشرق لجنة التحقيق.
- جعل حجم ما يصل الى 100 ميكرولتر مع العازلة التهجين وتخزين 10 مكل في -80 درجة مئوية.
2. الإرواء، التثبيت ومجموعة الأنسجة
- تنبيه: عند التعامل مع بارافورمالدهيد (PFA)، على حد سواء الصلبة ومائي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام خزانة السلامة. يعد حل الفورمالديهايد عن طريق إذابة 4٪ (ث / ت) PFA في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل باستخدام الحرارة (55 درجة مئوية). تصفية حل الفورمالديهايد مع ورق الترشيح.
- تحضير محلول السكروز عن طريق إذابة 20٪ (ث / ت) السكروز في الماء المقطر وإضافة 0.1٪ (ت / ت) الحل DEPC. ترك O / N في RT مع غطاء فضفاض ثم الأوتوكلاف.
- الميؤوس تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتون (50 ملغ / كلغ). تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميها، وغياب المنعكس انسحاب يشير التخدير العميق.
- وبمجرد أن الفأر هو تحت التخدير العميق، وجعل شق تحت القفص الصدري وقطع طريق القفص الصدري على كلا الجانبين، ورفعه لفضح القلب.
- ادخال ابرة 25-G إلى البطين الأيسر للقلب. إجراء شق صغير في الأذين الأيمن من القلب.
- يروي هذا الحيوان مع 20 مل PBS ثم حل الفورمالديهايد 40 مل. لP30 وكبار السنالفئران، استخدام معدل نضح من 12 مل / دقيقة ولكن للحيوانات الشابة استخدام معدل أقل (7-10 مل / دقيقة).
- تشريح الدماغ.
- قطع رأس الفأر مع مقص جراحي عن طريق جعل الخلفي قطع من الأذنين. جعل شق خط الوسط الذيلية في الجلد والعمل rostrally لإزالة الجلد من الجمجمة.
- بدءا من الجزء الذيلية، وقطع من خلال الجزء العلوي من الجمجمة على طول خط الوسط وبين العينين مع مقص القزحية. إزالة الجدارية واللوحات العظام الأمامية عن طريق إمالة جانب واحد من لوحة العظام في كل مرة والعض تشغيله مع ملاقط.
- إمالة بلطف الدماغ أعلى من الجزء الأمامي مع ملاقط وقطع الأعصاب البصرية وغيرها من أعصاب في الجمجمة. رفع بلطف الدماغ من الجمجمة.
- وضع الدماغ في الماوس الاكليلية مصفوفة الدماغ. شريحة الدماغ إلى 3 حوالي 4 قطع ملم بشفرة الحلاقة ريشة.
- نقل الشرائح في 4٪ حل PFA واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
- نقل الدماغشرائح لDEPC المعالجة 20٪ محلول السكروز واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية
- وضع كل شريحة الدماغ إلى cryomould الجافة، تحيط مع أفضل درجة حرارة القطع (أكتوبر) المتوسطة وتجميد الثلج الجاف. تخزين في -80 درجة مئوية.
3. Cryosectioning
- قطع 15 ميكرومتر أقسام الأنسجة المجمدة في ناظم البرد وجمع المقاطع على الشرائح المجهر. إذا لزم الأمر، والرطب الأقسام مع المعالجة DEPC برنامج تلفزيوني وتسحقهم مع الفرشاة الجميلة.
- ترك الشرائح لتجف لمدة حوالي 1 ساعة للتأكد من أن الأنسجة تلتزم الشريحة.
4. التهجين
- إعداد 65 ° C غسل العازلة: 150 مم كلوريد الصوديوم، و 15 ملي نا 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1X المالحة الصوديوم سترات)، 50٪ (ت / ت) الفورماميد و 0.1٪ (ت / ت) Tween- 20.
- إعداد MABT عازلة: 100 ملم حمض الماليك، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ (ت / ت) توين-20، ودرجة الحموضة 7.5.
- تمييع تحقيقات اثنين (DIG-وصفت وFITC-ابيلد) 1/1000 في المخزن التهجين قبل تحسنت إلى 65 درجة مئوية، وتخلط جيدا.
- تطبيق 300 ميكرولتر من خليط التهجين على كل شريحة، coverslipwith (C 200 س) coverslips فرن خبز واحتضان O / N عند 65 درجة مئوية في غرفة ترطيب.
- نقل الشرائح في جرة Coplin تحتوي على غسل العازلة قبل تحسنت. تغسل الشرائح لمدة 30 دقيقة مرتين في 65 درجة مئوية مع غسل العازلة.
- تغسل الشرائح لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات مع MABT في RT.
5. التصور FITC التحقيق
- إعداد عازلة تمنع ISH: MABT مع 2٪ عرقلة كاشف و 10٪ الحرارة المعطل مصل الأغنام.
- اختياري: استخدام قلم مسعور لرسم الدوائر حول أقسام الأنسجة على الشريحة للحد من حجم الحلول الأجسام المضادة المطلوبة.
- احتضان الشرائح لمدة 1 ساعة على RT مع ISH حظر عازلة في غرفة ترطيب.
- احتضان الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية مع البيروكسيديز الفجل (POD) - المترافقةد مكافحة FITC الأجسام المضادة المخفف 1/500 (ت / ت) عازلة في ISH الحجب.
- ضع الشرائح في وعاء Coplin تحتوي على برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ (ت / ت) توين-20 (PBST). يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة في PBST واستبدالها مع PBST جديد في كل مرة.
- مباشرة قبل الاستعمال، وإعداد tyramide الفلورسنت من خلال تمييع 100 مرة في مخفف التضخيم. على سبيل المثال، استخدام FITC-tyramide.
- هذا إضافة إلى الشرائح وتترك لمدة 10 دقيقة في RT.
- ضع الشرائح في وعاء Coplin ويغسل 3 مرات في PBST لمدة 10 دقيقة.
6. التصور DIG التحقيق
- تحضير 0.1 M Tris- حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2.
- احتضان الشرائح العازلة مع ISH حجب لمدة 1 ساعة على RT.
- احتضان الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية مع الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) -conjugated-DIG مكافحة الأجسام المضادة المخفف 1/1500 (ت / ت) عازلة في ISH الحجب.
- يغسل مع MABT لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.
- يغسل مرتين مع 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2 لمدة 5 دقائق على RT.
- مباشرة قبل الاستعمال، وإعداد حل الأحمر السريع عن طريق إذابة أقراص في 0.1 م تريس درجة الحموضة 8.2. تصفية حل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
- احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية مع حل سريع الأحمر في غرفة ترطيب. كما يختلف الوقت للنماء، والتحقق من الشرائح بانتظام مع المجهر الفلورسنت لمراقبة تشكيل راسب. على سبيل المثال، والتوقف عن رد الفعل بعد 2-3 ساعة.
- يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.
7. المناعية
- إعداد IHC عازلة حظر: 10٪ (ت / ت) في مصل الدم (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية) في PBST.
- احتضان الشرائح مع IHC عازلة تمنع لمدة 1 ساعة على RT في غرفة ترطيب.
- إعداد الأجسام المضادة الأولية: تمييع الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المناسبة في PBST مع 5٪ مصل (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية). على سبيل المثال، استخدام أرنب مكافحة Olig2 الأجسام المضادة في 1/400 (/ ت ت) التخفيف.
- احتضان في حل الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات CO / N.
- يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.
- إعداد الأجسام المضادة الثانوية: تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق في التخفيف المناسبة في PBST مع 5٪ (ت / ت) في مصل الدم (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية) و 0.1٪ (ت / ت) هويشت 33258. على سبيل المثال ، استخدم حمار المضادة للأرنب Alexa647 الضد الثانوية في 1/1000 (/ ت ت) التخفيف.
- احتضان في حل الضد الثانوية في RT لمدة 1 ساعة.
- يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.
8. تركيب
- تجف جزئيا الشرائح في RT، وجبل مع تصاعد المتوسط مضان. ترك الشرائح لتجف ثم الصورة في المجهر متحد البؤر تحت 10X، 20X و63X الأهداف باستخدام 4 قنوات مختلفة مع موجات الإثارة التالية: 570 نانومتر للأحمر سريع، 488 نانومتر لFITC، 647 نانومتر لOlig2 immunolabelling و 350 نانومتر للهويشت .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توضح هذه المقالة طريقة لISH مضان مزدوجة تليها immunolabelling في أقسام مخ الفأر. ويرد وصف موجز لهذا البروتوكول في الشكل 1. وكانت الخطوة الأولى لتجميع تحقيقات محددة لالإقليمين وم ب ب (بروتين النخاعين الأساسي). للتأكد من أن تحقيقات قد تم توليفها، تم تشغيل قسامة صغيرة من كل رد فعل على هلام الاغاروز. قالب الخطي خافت وكمية كبيرة من التحقيق RNA يمكن رؤية (الشكل 2). ISH مضان مزدوج لالإقليمين وم ب ب، تليها Olig2 immunolabelling وتلطيخ النووي هويشت، وقد أجريت على أقسام مخ الفأر. نحن تفحص أقسام الدماغ في مجهر متحد البؤر ومخيط الصور معا للكشف عن توزيع إشارات التعبير الجيني في الدماغ. التعبير الإقليمين في م ب ب -positive لوحظ (م ب ب +) الخلايا في جميع أنحاء البرازيل في (الشكل 3). كما درسنا التعبير الإقليمين في هياكل الدماغ المختلفة باستخدام أعلى التكبير. وترد ASPA التعبير في الخلايا قليلة التغصن في القشرة والإحضار الثفني في الشكل (4). وشارك في توطين م ب ب، Olig2، وASPA يشير إلى أن الإقليمين وأعرب في مجموعة فرعية من الخلايا قليلة التغصن ناضجة في القشرة والجسم الثفني (الشكل 4). هذه النتائج تثبت أن هذا البروتوكول يمكن الكشف في وقت واحد التعبير عن ثلاثة جينات مختلفة في أقسام الدماغ.
الشكل 1. بروتوكول مزدوجة الإسفار في الموقع التهجين تعقبها المناعية. يعمل هذا البروتوكول على مدى 5 أيام، وبالكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. فحص ASPA RNA التحقيق في الاغاروز جل. القالب الخطية وكمية كبيرة من التحقيق RNA من الوزن الجزيئي أقل يمكن ملاحظتها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الإسفار مزدوجة في الموقع التهجين لالإقليمين وم ب ب في أقسام مخ الفأر. الإقليمين (الحمراء)، وم ب ب (الأخضر) في الدماغ. شريط مقياس: 500 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وأعرب عن الشكل 4. التعبير عن الإقليمين في الخلايا قليلة التغصن في اللحاء وكوربوس الثفني. وحات تظهر الصور التمثيلية من ISH للالإقليمين (الحمراء)، وم ب ب (الأخضر) تليها المناعية من Olig2 (الأزرق) جنبا إلى جنب مع هويشت تلطيخ. الإقليمين في بعض م ب ب + / + Olig2 الخلايا في القشرة (A و B) وفي الجسم الثفني (C و D). M بي بي + / + Olig2 / ASPA + الخلايا المشار إليها مع السهام وم ب ب + / + Olig2 / ASPA - يشار إلى الخلايا مع النصال في لوحات مكبرة (B و D). الحانات مقياس: 100 ميكرون (A و C)؛ 20 ميكرون (B و D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التكميلي الشكل 1. تسلسل وخريطة ASPA استنساخ (IRAVp968C0654D). تم إدراج 1.5kb تسلسل [كدنا من الإقليمين إلى pCMV-Sport6 البلازميد (A). يظهر خريطة pCMV-Sport6-ASPA البلازميد في الفقرة (ب).م / الملفات / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لRNA المزدوج في الموقع التهجين تليها المناعية. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتأكيد أن الإقليمين يعبر عنه قليلة التغصن ناضجة في العديد من مناطق الدماغ.
هذا الإجراء متعددة الخطوات لديها كثير من المزالق المحتملة التي يمكن أن تؤثر على الحساسية ويجب تجنبها. أولا، يجب أن تكون خالية ريبونوكلياز كل الحلول ومخازن تخزين للتفاعل النسخ. الثانية، واختيار القوالب [كدنا مهم ونحن نفضل القوالب حوالي 1KB في الطول. فمن الضروري لتنظيف القوالب [كدنا مع الفينول / استخراج الكلوروفورم وإعادة يعجل لهم قبل النسخ في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، النسخ لجنة التحقيق يجب أن يكون الأمثل. إذا لم يتم إنتاجها التحقيق بكميات كافية، وسوف يقلل من جودة ISH. نوعية التحقيق ويمكن التحقق من خلال دراسة على هلام الاغاروز وذات نوعية جيدة ستكونيتضح من سطوع قوي من الفرقة التحقيق بالمقارنة مع الفرقة قالب (الشكل 2). لISH المزدوج، وتستخدم تحقيقين صفت بشكل مختلف، عادة واحدة وصفت مع DIG والآخر مع FITC. يعتبر التحقيق FITC المسمى ليكون الأقل كشفها ويجب أن يتم اختياره حيث من المتوقع أن يكون أعلى في أنسجة مرنا الهدف. هذا التحقيق هو عادة أول من طور وضعت المسبار المسمى DIG الثانية.
خطوة حاسمة أخرى هي إعداد الأنسجة. و perfused الفئران مع برنامج تلفزيوني DEPC معاملة تليها PFA 4٪، وظيفة ثابتة في 4٪ PFA O / N ثم cryoprotected في 20٪ حلول السكروز التي تم التعامل DEPC لتدمير أي ريبونوكلياز المتبقية. وقت التثبيت مهم جدا؛ الإفراط أو تحت تثبيت يمكن أن يؤدي إلى إشارة أضعف، وربما يرجع ذلك إلى انخفاض نسبة انتشار التحقيق (أكثر من التثبيت) أو تدهور مرنا (تحت تثبيت). ثم يتم cryosectioned الأنسجة، وتهجين تحقيقين O / N. والفورماميدالمستخدمة في المخزن المؤقت التهجين يجب المتأينة. وهناك اعتبار مهم جدا أثناء O / N التهجين في 65 ج هو تجنب التبخر وتركيز الخليط التهجين كما يمكن أن يقلل من حساسية. في تجربة وصفها أجرينا التهجين في 65 CO / N، ولكن قد يكون من المفيد محاولة درجات حرارة منخفضة للتحقيقات مختلفة لو أنه يبدو أن من الصعب الكشف عن مرنا الهدف.
هناك خيار من الكواشف للكشف عن تحقيقات المهجنة. سريع الأحمر هو كاشف الفلورسنت حساس ولكن ليس كل دفعات من الأحمر سريع تعطي نفس النتيجة. انها تحتاج AP للتنمية ويعطي مضان مع الإثارة رودامين. في تجربتنا، فمن المهم لجعله جديدة مع 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2 وتصفية قبل الاستخدام. وثمة خيار غير فلوري هو التنمية اللون مع نيترو الأزرق نتروبلو (NBT) و 5-برومو-4-كلورو-3'-indolyphosphate (BCIP) الذي يعمل مع نفس الأجسام المضادة AP-مترافق. آنوالخيار ذر هو استخدام tyramide الفلورية للكشف. على الرغم من أن أنظمة tyramide الفلورسنت ليست هي الأساليب الأكثر حساسية، فإن رد الفعل النامية البيروكسيديز الفجل هو سريع جدا، وهناك على الأقل ثلاثة ألوان الفلورسنت (FITC، Cyanine 3 و Cyanine 5) التي يمكن استخدامها. وجود قيود على هذا البروتوكول هو أن بعض المستضدات الهدف (أو الحواتم)، وخاصة البروتينات وفرة منخفضة، قد لا يكون اكتشافها بعد عملية ISH، وبالتالي ليست مناسبة للIHC بعد ISH. في المناعية لدينا، والكشف عن الأجسام المضادة من Olig2 يبدو غير متأثر. سوف يحتاج المستخدم لاختيار الأجسام المضادة المناسب لimmunolabelling ISH التالية.
تستخدم IHC وISH عادة تقنيات للدراسات نمط التعبير الجيني، وكلاهما إيجابيات وسلبيات. IHC هو طريقة حساسة للغاية للكشف عن التعبير الخلوية من الجينات في أقسام الدماغ، ولكن اعتمادها على الأجسام المضادة يؤثر على خصوصيته ويحد من استخدامه. على النقيض من ذلك، ISH لديها مواصفات عاليةificity والتحقيق في أي الجينات يمكن بسهولة أن تصنع عن طريق النسخ في المختبر باستخدام الجينات [كدنا محدد كقالب. البروتوكول الذي وضعنا يستفيد من كلتا الطريقتين، والجمع بين ISH المزدوج مع IHC إلى تحقيق كشف الثلاثي في التعبير الجيني مع خصوصية عالية.
وباختصار، فإن البروتوكول وصفنا هنا يمكن تلطيخ وقت واحد من اثنين من mRNAs واحد من البروتين، لذلك يوفر أداة مفيدة لتوضيح التعبير الجيني المترجمة التعاون. على الرغم من أن التعبير مرنا لا تتطابق دائما مع تعبير البروتين، ISH هي تقنية قوية تسمح لنا لدراسة التعبير الجيني مع خصوصية عالية. وقد ثبت لدينا بروتوكول للISH مضان مزدوج جنبا إلى جنب مع IHC أن يكون النجاح في الكشف عن التعبير الإقليمين في مجموعة فرعية من الخلايا قليلة التغصن في أنسجة المخ من فئران بالغة، وأنه يمكن أن تتكيف بسهولة لمجموعة متنوعة من الأنسجة من أصول مختلفة ومراحل النمو. وبالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكولويمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن التعبير من الرنا الصغيرة مثل ميرنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al.
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
