Abstract
Nachweis der Genexpression in verschiedenen Arten von Gehirnzellen , beispielsweise Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia - Vorläufern kann durch das Fehlen von spezifischen primären oder sekundären Antikörper für Immunfärbungs behindert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll , die Expression von drei verschiedenen Genen im gleichen Hirnschnitt mit doppelseitigem Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit zwei genspezifischen Sonden durch Immunfärbung mit einem Antikörper , der eine hohe Spezifität gegenüber dem durch ein drittes Gen kodierte Protein gerichtet ist, gefolgt zu detektieren. Die Aspartoacyclase (ASPA) Gen, Mutationen , von denen einer seltenen menschlichen Erkrankung der weißen Substanz führen kann - Canavan Krankheit - Es wird angenommen , in Oligodendrozyten und Mikroglia exprimiert werden , aber nicht in Astrozyten und Neuronen. Allerdings hat die genaue Expressionsmuster von ASPA im Gehirn noch etabliert werden. Dieses Protokoll hat uns erlaubt, zu bestimmen, dass ASPA in einer Untergruppe von reifen Oligodendrozyten a ausgedrückt wirdnd sie kann allgemein auf einen weiten Bereich von Genexpressionsmuster Studien angewendet werden.
Introduction
Gliazellen, die die am häufigsten vorkommenden Zellen im zentralen Nervensystem (ZNS) sind, umfassen Oligodendrozyten (die myelinisierenden Zellen von ZNS), Oligodendrozyten Vorläufern (OPs, die auch als "NG2 cells" bekannt), Astrozyten und Mikroglia. Es gibt in den Funktionen von Gliazellen und ihre mögliche Rolle bei neurologischen Krankheiten 1 wachsendes Interesse. Zum Beispiel Canavan - Krankheit (CD) ist eine erbliche früh in der Kindheit beginnen neurodegenerative Erkrankung mit spongiformen Leukodystrophie und einem fortschreitenden Verlust von Nervenzellen, die zum Tode führen in der Regel vor 10 Jahren 2,3. Mutationen im Aspartoacyclase (ASPA) Gen , das drastisch führen zu einer verminderten Aktivität ASPA 4 in CD identifiziert worden. ASPA ist ein Enzym , das Deacetylierung von N-Acetylaspartat (NAA) Katalysieren, ein Molekül stark in Gehirn konzentriert, Erzeugen Acetat und Aspartat 5-7. Viele CD-Patienten zeigen eine höhere NAA wegen des Mangels an ASPA acvität. Einige Studien spekulieren , dass NAA abgeleitete Acetat eine wichtige Quelle von Fettsäuren / Lipiden im Gehirn während der Entwicklung sein könnte und CD können sich aus Myelinsynthese vermindert während durch den Ausfall von NAA verursacht Entwicklung 3,5,6 abgebaut werden.
ASPA wird vorwiegend in der Niere, der Leber und der weißen Substanz des Gehirns und die wichtige Rolle der ASPA in CD gegeben, die zelluläre Expression dieses Enzyms im Gehirn wurde von mehreren Labors untersucht worden. Mit Blick auf ASPA enzymatische Aktivität im Gehirn gefunden früheren Studien , dass die Zunahme in ASPA Aktivität während der Entwicklung des Gehirns verläuft parallel den zeitlichen Verlauf der Myelinisierung 8-10. Auf zellulärer Ebene, Assays für enzymatische Aktivität sowie in situ - Hybridisierung (ISH) und Immunhistochemie (IHC) Analysen legen nahe , dass ASPA hauptsächlich in Oligodendrozyten im Gehirn exprimiert wird , aber nicht in Neuronen oder Astrozyten 11-16. Einige Studien fanden heraus, dass ASPA könnte auchwerden in Mikroglia im ZNS 12,14 ausgedrückt. Bisher Daten über ASPA Ausdruck in OPs sind begrenzt. Nach einer aktuellen Studie , in Transkriptomen verschiedener Zelltypen in der Maus Hirnrinde einschließlich Neuronen, Astrozyten, OPs, neugebildeten Oligodendrozyten, myelinisierenden Oligodendrozyten, Mikroglia, Endothelzellen und Perizyten durch RNA - Sequenzierung analysiert wurden 17 wird ASPA ausschließlich in Oligodendrozyten exprimierten insbesondere Oligodendrozyten in myelinisierende (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Trotz dieser Studien über ASPA Expressionsmuster im Gehirn, noch eine Reihe von Unsicherheiten.
Verschiedene Techniken können zum Studium von Genexpressionsmustern verwendet werden. IHC ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Bestimmung der Funktionsprodukt Erfassen (dh Protein) einer Genexpression in Gewebeschnitten. Trotz seiner großen Nutzen, diese Technik hat seine Grenzen, deren Anwendung und Spezifität Thema t sindo der Verfügbarkeit und Spezifität des Antikörpers erforderlich. Im Vergleich dazu hat ISH den Vorteil, dass sie die Expression eines beliebigen Gens auf mRNA-Ebene zu offenbaren. mehrere Sonden kann es jedoch technisch schwierig zu verwenden, die gleichzeitig um eine Gen-Expression zu speziellen Zelltypen zu lokalisieren. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll RNA Doppel Fluoreszenz in situ - Hybridisierung mit Fluoreszenzimmunmarkierung eines Proteins verbinden. Wir haben diese Reihe von Techniken verwendet , um die Expressionsmuster von Aspa in Maushirn zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die genaue Untersuchung der Genexpression unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie.
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Protocol
Ethik-Statement:
Maushaltung und Handhabung sind in Übereinstimmung mit dem britischen Home Office Vorschriften und UCL Ethikkommission Leitlinien, die Einhaltung der Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 des Vereinigten Königreichs und der Änderung der Verordnungen 2012.
HINWEIS: Alle Lösungen sollten mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) hergestellt werden - behandelte Wasser restliche RNase zu zerstören. Für DEPC Behandlung, fügen DEPC (1 ml pro Liter), kräftig schütteln, bis alle DEPC Globuli verschwunden sind dann im Autoklaven die DEPC abzubauen.
1. RNA-Sondensynthese
- ACHTUNG: Bei der Formamid Handhabung Persönliche Schutzausrüstung (PSA) und ein Sicherheitsgehäuse. Bereiten Hybridisierungspuffer: DEPC-behandeltem deionisiertes Wasser mit 50% (v / v) entionisiertes Formamid, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml Hefe-tRNA, 1 × Denhardt-solution und 10% w / v Dextran-Sulfat.
- Wählen Sie eine DNA-Klon, der die cDNA-Sequenz des Gens von Interesse in einem Plasmid mit RNA Polymerase-Promotoren enthält. Für dieses Beispiel verwenden , um ein pCMV-SPORT6 Klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), mit T7 und SP6 - RNA - Polymerase - Promotoren für Aspa (Supplementary Abbildung 1).
- Bereiten linearisierte Plasmid-DNA als Matrize.
- Wachsen, um die DNA-Klons, extrahieren, die das Plasmid mit einem Plasmid Purification Kit kleinräumige gemäß dem Protokoll des Herstellers und die Sequenz mit dem T7 und Sp6 universellen Primer.
- Digest 1.020 ug Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, das am 5'-Ende des Sense-Strangs der cDNA schneidet. Für dieses Beispiel verwenden 100 Einheiten Sal I das pCMV-SPORT6- Aspa Plasmid zu verdauen. Inkubieren für 1,5 Stunden bei 37 ° C
- Führen Sie einen kleinen aliquoten auf einem Agarose-Gel zu überprüfen, dass das Plasmid vollständig linearisiert.
- Reinige dielinearisierten Plasmids mit Phenol-Chloroform verwendet.
- Hinzufügen 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, ein Volumen von 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - äquilibriert Phenol und einem Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (IAA) (24: 1).
- Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min bei RT (20 - 25 ° C, RT) und Extrahieren obere wässrige Phase.
- Hinzufügen einem Volumen Chloroform / IAA, Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min und die obere wässrige Phase zu extrahieren.
- Wiederholen Sie Schritt 1.4.3.
- Fügen Sie 2 Volumen Ethanol und lassen bei -20 o C für 1 h oder O / N.
- Zentrifuge bei 16.000 × g bei 4 ° C für 10 min. Überstand verwerfen.
- Waschen des Pellets mit 70% kaltem Ethanol und resuspendieren in approximativ 1 ug cDNA pro 2,5 & mgr; l in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
- Synthesize die beiden Sonden ein, markiert mit Digoxigenin (DIG) und die andere mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
- Wählen Sie die entsprechende RNA-Polymerase die anti-se zu machennse Sonde (komplementär zu der Ziel-mRNA). In diesem Beispiel verwenden T7 RNA Polymerase Aspa Sonde zu machen.
- Bereiten Sie in vitro Transkriptionsreaktion: add 1 ug linearisierter DNA, 4,0 ul 5 x Transkriptionspuffer, 6,0 ul 100 mM DTT, 2,0 ul 10x DIG oder FITC RNA Markierungsmischung enthält dNTPs, 1 ul RNase - Inhibitor und 20 bis 40 Einheiten der RNA-Polymerase; machen das endgültige Volumen von bis zu 20 & mgr; l mit DEPC-behandeltem Wasser.
- Inkubieren bei 37 o C für 1,5 Std.
- Run1 ul der Transkriptionsreaktion auf einem 1,0% igen Agarose-Gel zu überprüfen, ob die Reaktion gearbeitet hat. Das Gel sollte die lineare Vorlage und eine helle Band der Sonde zeigen.
- Machen Sie das Volumen bis zu 100 & mgr; l mit Hybridisierungspuffer und Speichern von 10 ul Aliquots bei -80 ° C.
2. Perfusions, Fixierung und Gewebeentnahme
- ACHTUNG: Beim Umgang mit Paraformaldehyd (PFA), sowohl feste als auchwässrige, tragen PPE und ein Sicherheitsgehäuse. Bereiten Formaldehydlösung durch Lösen von 4% (w / v) PFA in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung unter Verwendung von Wärme (55 ° C). Filtern Sie die Formaldehydlösung mit Filterpapier.
- Bereiten Saccharoselösung durch Auflösen von 20% (w / v) Saccharose in destilliertem Wasser und mit 0,1% (v / v) DEPC-Lösung. Lassen Sie O / N bei RT mit einem losen Deckel und dann Autoklaven.
- Unheilbar betäuben eine Maus durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50 mg / kg). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Zehe Prise und das Fehlen von Entzugs Reflex zeigt tiefe Narkose.
- Sobald die Maus unter tiefer Narkose ist, machen einen Schnitt unterhalb des Brustkorbs und durch den Brustkorb auf beiden Seiten abgeschnitten, sie heben das Herz aussetzen.
- Legen Sie eine 25-G-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens.
- Perfuse das Tier mit 20 ml PBS und dann 40 ml Formaldehydlösung. Für P30 und älterMäuse, verwenden Sie eine Perfusions-Rate von 12 ml / min, aber für jüngere Tiere verwenden, um eine niedrigere Rate (7 bis 10 ml / min).
- Präparieren Sie das Gehirn.
- Sever mit der Maus den Kopf mit einer chirurgischen Schere durch einen Schnitt posterior von den Ohren zu machen. Machen Sie einen Schwanzmittelschnitt in der Haut und arbeiten rostral die Haut von Schädel zu entfernen.
- Ausgehend von der Schwanzteil, schneiden durch die Oberseite des Schädels entlang der Mittellinie und zwischen den Augen mit Iris Schere. Entfernen Sie die parietalen und frontalen Knochenplatten von einer Seite einer Knochenplatte Kippen jedes Mal, und schnappen sie mit einer Pinzette aus.
- Kippen Sie vorsichtig das Gehirn nach oben von dem vorderen Teil mit einer Pinzette und schneiden Sie die Sehnerven und andere Hirnnerven. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel.
- Legen Sie das Gehirn in eine Maus koronalen Hirn Matrix. Schneiden Sie das Gehirn in 3 etwa 4 mm Stücke mit einer Feder Rasierklinge.
- Übertragen Sie die Scheiben in 4% PFA-Lösung und Inkubation O / N bei 4 ° C.
- Transfer GehirnScheiben bis 20% Saccharoselösung DEPC-behandeltem und O / N bei 4 ° C inkubieren
- Legen Sie jedes Gehirn Scheibe in einem trockenen cryomould, umgeben mit optimale Schnitttemperatur (OAT) Medium und frieren auf Trockeneis. Bei -80 ° C.
3. Kryoschneiden
- Cut 15 & mgr; m Abschnitte von gefrorenem Gewebe in einem Kryostaten und sammeln die Schnitte auf Objektträger. Bei Bedarf benetzen die Abschnitte mit DEPC-PBS und glätten sie mit einem feinen Pinsel.
- Lassen Sie die Folien für etwa 1 Stunde trocknen, um sicherzustellen, dass das Gewebe auf dem Objektträger anhaftet.
4. Die Hybridisierung
- Vorbereitung 65 ° C Waschpuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x saline Natriumcitrat), 50% (v / v) Formamid und 0,1% (v / v) Tween- 20.
- Bereiten MABT Puffer: 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5.
- Verdünnen Sie die beiden Sonden (DIG-markierten und FITC-labelled) 1 / 1.000 in Hybridisierungspuffer vorgewärmt auf 65 ° C und gut mischen.
- Bewerben um 300 ul Hybridisierungsmischung auf jeder Folie, coverslipwith Ofen gebacken (200 ° C) Deck und Inkubation O / N bei 65 ° C in einer befeuchteten Kammer.
- Die Objektträger in eine Coplin-Gefäß vorgewärmten Waschpuffer enthält. Waschen der Objektträger 30 min zweimal bei 65 ° C mit Waschpuffer.
- Waschen Sie die Objektträger für 10 Minuten dreimal mit MABT bei RT.
5. Visualisierung des FITC-Sonde
- Vorbereitung ISH Blockierungspuffer: MABT mit 2% Blockierungsreagenz und 10% Hitze-inaktiviertes Schafserum.
- Optional: eine hydrophobe Stift Kreise um die Gewebeabschnitte auf der Folie zeichnen das Volumen der Antikörperlösungen zu reduzieren.
- Inkubieren der Objektträger für 1 h bei RT mit ISH-Puffer in einer befeuchteten Kammer blockiert.
- Inkubieren Sie die Dias O / N bei 4 ° C mit einem Meerrettich-Peroxidase (POD) - Konjugatd anti-FITC-Antikörper Blockierungspuffer 1/500 (v / v) in ISH verdünnt.
- Legen Sie die Folien in eine Coplin Gefäß mit PBS mit 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). 3 x waschen für 10 min in PBST und ersetzen mit frischem PBST jedes Mal.
- Unmittelbar vor dem Gebrauch bereiten die fluoreszierende Tyramidesters durch 100-mal in die Amplification Verdünnungsmittel verdünnt wird. Für dieses Beispiel verwenden FITC-Tyramidesters.
- Fügen Sie diese auf den Schlitten und lassen für 10 min bei RT.
- Legen Sie die Folien in eine Glasküvette und waschen 3 Mal in PBST 10 min.
6. Visualisierung der DIG-Sonde
- Bereiten 0,1 M Tris- HCl pH-Wert 8,2.
- Inkubieren der Objektträger mit ISH Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT.
- Inkubieren der Objektträger O / N bei 4 ° C mit einer alkalischen Phosphatase (AP) -konjugiertem anti-DIG-Antikörper, verdünnt 1 / 1.500 (v / v) in ISH Blockierungspuffer.
- Waschen Sie mit MABT für 10 Minuten dreimal.
- Wasche zweimal mit 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 für 5 min bei RT.
- Unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet Fast Red-Lösung, indem die Tabletten in 0,1 M Tris pH 8,2 gelöst wird. Filtern der Lösung durch einen 0,22 um-Filter.
- Inkubieren der Objektträger bei 37 ° C mit Fast Red-Lösung in einer befeuchteten Kammer. Da die Zeit für eine optimale Entwicklung variiert, überprüfen Sie die Dias regelmäßig mit einem Fluoreszenzmikroskop die Bildung von Niederschlag zu überwachen. Für dieses Beispiel Die Reaktion nach 2 - 3 Stunden.
- Waschen mit PBST 10 min dreimal.
7. Immunhistochemie
- Bereiten IHC Blockierungspuffer: 10% (v / v) Serum (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper Host) in PBST.
- Inkubiere Objektträger mit IHC-Puffer für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer blockiert.
- Bereiten primäre Antikörper: den primären Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung in PBST mit 5% Serum verdünnt (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper Host). Für dieses Beispiel verwenden, um ein Kaninchen-Anti-Olig2 Antikörper bei 1/400 (v / v) Verdünnung.
- Inkubieren in der primären Antikörperlösung bei 4 ° CO / N.
- Waschen mit PBST 10 min dreimal.
- Bereiten sekundären Antikörper: Verdünnen ein Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung in PBST mit 5% (v / v) Serum (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper host) und 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Für dieses Beispiel Gebrauch ein Esel-anti-Kaninchen-Alexa647 sekundären Antikörper bei 1 / 1,000 (v / v) Verdünnung.
- Inkubieren in der sekundären Antikörperlösung bei RT für 1 Std.
- Waschen mit PBST 10 min dreimal.
8. Montage
- Trocknen teilweise die Folien bei RT und Halterung mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium. Lassen Sie die Folien Bild, um zu trocknen und dann in einem konfokalen Mikroskop unter 10X, 20X und 63X Ziele unter Verwendung von 4 verschiedenen Kanälen mit den folgenden Anregungswellenlängen: 570 nm für Fast Rot, 488 nm für FITC, 647 nm für Olig2 Immunmarkierung und 350 nm für Hoechst .
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Representative Results
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren für eine ISH Doppelfluoreszenz gefolgt von Immunmarkierung in Mausgehirnschnitte. Eine kurze Beschreibung dieses Protokolls ist in Abbildung 1. Der erste Schritt gezeigt Sonden synthetisieren war spezifisch für Aspa und MBP (myelin basic protein). Um zu überprüfen, dass die Sonden synthetisiert worden war, ein kleines Aliquot jeder Reaktion wurde auf einem Agarosegel laufen gelassen. Das schwache lineare Template und eine große Menge der RNA - Sonde (Figur 2) zu sehen. Doppel Fluoreszenz ISH für Aspa und Mbp, gefolgt von Olig2 Immunmarkierung und Hoechst Kernfärbung wurde auf Maus Hirnschnitten durchgeführt. Wir scannte die Hirnschnitte in einem konfokalen Mikroskop und genähte zusammen Bilder , um die Verteilung der Genexpression Signale im Gehirn zu offenbaren. Aspa Ausdruck in Mbp -positiver (MBP +) Zellen wurde während des gesamten BH beobachtet in (3). Wir untersuchten auch Aspa Expression in verschiedenen Hirnstrukturen eine höhere Vergrößerung verwendet wird . Aspa Expression in Oligodendrozyten im Kortex und Corpus callosum sind in Abbildung 4 dargestellt. Die Co-Lokalisation von MBP, Olig2 und Aspa zeigt an, dass Aspa in einer Untergruppe von reifen Oligodendrozyten in der Hirnrinde und dem Corpus callosum (Abbildung 4) ausgedrückt. diese Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll gleichzeitig die Expression von drei verschiedenen Genen in Hirnschnitten nachweisen kann.
Abbildung 1. Das Protokoll für Doppel Fluoreszenz in situ Hybridisierung Gefolgt von Immunostaining. Dieses Protokoll läuft über 5 Tage und erkennt die Expression von drei Genen./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Prüfung der Aspa RNA - Sonde auf Agarose - Gel. Die lineare Schablone und eine große Menge der RNA - Sonde von einem geringeren Molekulargewicht beobachtet werden kann. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Doppel Fluoreszenz in situ Hybridisierung für Aspa und Mbp in Mäusehirnschnitten. Aspa (rot) und MBP (grün) im Gehirn zeigen , vernäht. Maßstabsbalken:. 500 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Expression von Aspa in Oligodendrozyten im Cortex und dem Corpus Callosum. Panels zeigen repräsentative Bilder von ISH für Aspa (rot) und MBP (grün) , gefolgt von Immunfärbung von Olig2 (blau) kombiniert mit Hoechst - Färbung. Aspa wurde in einigen ausgedrückt MBP + / Olig2 + Zellen in der Hirnrinde (A und B) und im Corpus callosum (C und D). M bp + / Olig2 + / Aspa + Zellen mit Pfeilen und Mbp + / Olig2 + / Aspa angegeben - Zellen sind mit Pfeilspitzen in den vergrößerten Platten (B und D) angegeben. Maßstabsbalken: 100 & mgr; m (A und C); 20 & mgr; m (B und D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1. Reihenfolge und Karte von Aspa Clone (IRAVp968C0654D). 1,5 kb cDNA - Sequenz von Aspa wurde in pCMV-Sport6 Plasmid (A) eingesetzt. Die Karte von pCMV-Sport6-Aspa Plasmid wird in (B) gezeigt.m / files / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Dieses Protokoll stellt eine Schritt- für -Schritt - Verfahren für ein Doppel RNA in situ Hybridisierung von Immunfärbung gefolgt. Wir haben dieses Protokoll verwendet , um zu bestätigen , dass Aspa in reifen Oligodendrozyten in mehreren Bereichen des Gehirns exprimiert wird .
Diese mehrstufigen Verfahren hat viele potenzielle Gefahren, die Empfindlichkeit beeinflussen können und sollten vermieden werden. Zuerst werden alle Lösungen und Speicherpuffer für die Transkriptionsreaktion benötigen RNase-frei sein. Zweitens ist die Wahl der cDNA templates wichtig, und wir bevorzugen templates etwa 1 kb lang. Es ist notwendig , die cDNA - Matrizen mit Phenol / Chloroform - Extraktion und Wieder auszufällen, bevor in - vitro - Transkription zu reinigen. Darüber hinaus muss die Transkription der Sonde optimal zu sein; wenn die Sonde nicht in ausreichender Menge hergestellt wird, wird die Qualität der ISH reduzieren. Die Qualität der Sonde kann durch die Untersuchung auf einem Agarose-Gel und gute Qualität überprüft werden, wirdbelegt durch die starke Helligkeit des Sondenband gegenüber dem Schablonenband (Abbildung 2). Für Doppel ISH, zwei unterschiedlich markierten Sonden verwendet werden, man in der Regel mit DIG und das andere mit FITC markiert. Der FITC-markierte Sonde wird als die am wenigsten detektierbar sein und sollte gewählt werden, wenn die Ziel-mRNA zu erwarten ist am höchsten in dem Gewebe sein. Diese Sonde ist in der Regel zuerst entwickelt und die DIG-markierte Sonde zweite entwickelt.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Gewebepräparation. Die Mäuse werden perfundiert mit DEPC behandeltem PBS, gefolgt von 4% PFA, nachfixiert in 4% PFA O / N und dann in 20% Saccharoselösungen kryogeschützt, die DEPC-behandelt wurden, um einen Rest RNase zu zerstören. Fixation Es ist sehr wichtig; Über- oder Unter Fixierung kann durch reduzierte Sonde Eindringen auf ein schwächeres Signal, vielleicht führen (über Fixierung) oder Abbau der mRNA (unter Fixierung). Das Gewebe wird dann gefriergeschnitten und zwei Sonden hybridisiert sind, O / N. das Formamidverwendet wird, muss in dem Hybridisierungspuffer entionisiert werden. Eine sehr wichtige Überlegung während der O / N-Hybridisierung bei 65 ° C ist die Verdampfung und Konzentration der Hybridisierungsmischung zu vermeiden, da es die Empfindlichkeit beeinträchtigen könnten. In dem Experiment beschrieben wir die Hybridisierung bei 65 CO / N durchgeführt, aber es könnte versuchen, niedrigere Temperaturen für verschiedene Sonden wert sein, wenn es schwierig zu sein, scheint die Ziel-mRNA zu erkennen.
Es gibt eine Auswahl an Reagenzien für die hybridisierten Sonden zu detektieren. Fast Red ist ein empfindliches fluoreszierenden Reagens, aber nicht alle Chargen von Fast Red das gleiche Ergebnis. Es braucht AP für die Entwicklung und gibt Fluoreszenz mit Rhodamin Anregung. Unserer Erfahrung nach ist es wichtig, es frisch mit 0,1 zu machen M Tris-HCl pH 8,2 und Filter vor dem Gebrauch. Eine nicht-fluoreszierendes Option ist die Farbentwicklung mit Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3'-indolyphosphate (BCIP), die mit demselben AP-konjugierten Antikörper funktioniert. Another Option ist fluoreszierend Tyramidesters für Detektion. Obwohl fluoreszierende Tyramid Systeme nicht die empfindlichsten Methoden sind, ist die Entwicklungsreaktion mit Meerrettich-Peroxidase sehr schnell und es gibt mindestens drei Leuchtfarben (FITC, Cyanine 3 und Cyanin 5), die verwendet werden können. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist es, dass einige Zielantigene (oder Epitope), insbesondere geringer Menge Proteine, nicht nach der ISH Verfahren nachweisbar sein können und sind daher nicht geeignet für IHC nach ISH. In unserem Immunfärbung scheint Antikörper-Nachweis von Olig2 unberührt. Der Benutzer muss den richtigen Antikörper für Immunmarkierung folgende ISH zu wählen.
IHC und ISH sind Techniken für die Genexpressionsmuster Studien häufig verwendet, und beide haben Vor- und Nachteile. IHC ist ein hochempfindliches Verfahren zur Bestimmung der zellulären Expression von Genen in Hirnschnitten erfassen, aber die Abhängigkeit von dem Antikörper seine Spezifität beeinträchtigt und begrenzt ihre Anwendung. Im Gegensatz dazu hat die ISH eine hohe specificity und die Sonde eines beliebigen Gens kann leicht durch in - vitro - Transkription unter Verwendung der Gen - spezifischen cDNA als Matrize synthetisiert werden. Das Protokoll, das wir entwickelt nutzt beide Methoden Doppel ISH mit IHC Kombination Dreifachdetektion der Genexpression mit hoher Spezifität zu erreichen.
Kurz gesagt, ermöglicht es das Protokoll, die wir hier beschreiben gleichzeitige Färbung von zwei mRNAs und ein Protein, so stellt sie ein nützliches Werkzeug zur Veranschaulichung kolokalisiert Genexpression. Trotz der Tatsache, dass die mRNA-Expression immer mit Protein-Expression korreliert nicht, ist ISH eine leistungsfähige Technik, die uns die Genexpression mit hoher Spezifität zu untersuchen erlaubt. Unser Protokoll der Doppelfluoreszenz ISH mit IHC Kombination hat sich bewährt bei der Erkennung Aspa Expression in einer Untergruppe von Oligodendrozyten in Hirngewebe adulter Mäuse zu sein, und es kann leicht für eine Vielzahl von Geweben verschiedener Herkunft und Entwicklungsstufen angepasst werden. Darüber hinaus dieses Protokollkönnen auch zum Nachweis der Expression von kleinen RNAs wie miRNA verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
