Abstract
איתור של ביטוי גני סוגים שונים של תאים במוח למשל, נוירונים, האסטרוציטים, oligodendrocytes, מבשרי oligodendrocyte ו microglia, ניתן הקשה על ידי חוסר נוגדנים ספציפיים ראשוניים או משניים עבור immunostaining. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזהות את הביטוי של שלושה גנים שונים באותו סעיף המוח באמצעות קרינה כפולה הכלאה באתרו עם שתי חלליות גן ספציפי ואחריו immunostaining עם נוגדן של סגוליות גבוהות המכוונות נגד החלבון מקודד על ידי גן שלישי. Aspartoacyclase (ASPA) הגן, מוטציות של מה שעלולות להוביל מחל חומר לבנה אנושית נדירה - מחלת קנבן - נחשב להתבטא oligodendrocytes ו microglia אבל לא האסטרוציטים ונוירונים. עם זאת, את דפוס הביטוי המדויק של ASPA במוח טרם הוקם. פרוטוקול זה אפשר לנו לקבוע כי ASPA מתבטא קבוצת משנה של oligodendrocytes הבוגרתnd זה יכול להיות מיושם בדרך כלל מגוון רחב של מחקרי דפוס ביטוי גנים.
Introduction
תאי גלייה, אשר הוא התאים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), מהווים oligodendrocytes (תאי myelinating של CNS), מבשרי oligodendrocytes (OPS, הידוע גם בשם "תאי NG2"), האסטרוציטים ו microglia. יש עניין הולך וגובר את הפונקציות של תאי גלייה ותפקידים הפוטנציאל שלהם במחלות נוירולוגיות 1. לדוגמה, מחלת קנבן (CD) היא הפרעה תורשתית ניוונית של מערכת העצבים מתחיל מוקדם בינקות עם leukodystrophy ע"ש וכן אובדן מתמשך של נוירונים, המובילה למוות בדרך כלל לפני גיל 10 2,3. מוטציות בגן Aspartoacyclase (ASPA) שמובילות באופן דרסטי פעילות ASPA 4 ב CD זוהה. ASPA הוא אנזים catalysing deacetylation של N-acetylaspartate (NAA), מולקולה מאוד מרוכז במוח, אצטט שהניבו ו aspartate 5-7. חולי CD רבים מראים רמות גבוהות יותר של NAA בשל חוסר ASPA activity. כמה מחקרים משער כי יצטט נגזרות NAA יכול להיות מקור עיקרי של חומצות שומן / שומנים במוח במהלך פיתוח CD לנבוע ירד סינתזה המיאלין במהלך ההתפתחות שנגרמה על ידי הכישלון של NAA להיות מפורק 3,5,6.
ASPA נמצא בעיקר בכליות, בכבד בחומר הלבן של המוח, ולנוכח התפקיד החשוב של ASPA ב CD, הביטוי התאי של אנזים זה במוח נחקרה על ידי מספר מעבדות. על ידי הסתכלות על הפעילות האנזימטית ASPA במוח, מחקרים קודמים מצאו כי העלייה בפעילות ASPA במהלך התפתחות המוח מקביל את מהלך הזמן של מעטפת המיאלין 8-10. ברמה התאית, מבחני עבור הפעילות האנזימטית וכן הכלאה באתרו (שאני עורך) אימונוהיסטוכימיה (IHC) ניתוחי מראים כי ASPA מתבטאת בעיקר oligodendrocytes במוח אבל לא בנוירונים או האסטרוציטים 11-16. מספר מחקרים מצאו כי ASPA אולי גםלהתבטא microglia במערכת העצבים המרכזית 12,14. אז נתונים כה על הביטוי ASPA ב OPS מוגבלים. על פי מחקר שנערך לא מכבר ובו transcriptomes של תאים מסוגים שונים בקליפת המוח העכבר כולל נוירונים, האסטרוציטים, OPS, oligodendrocytes שהוקמה זה עתה, oligodendrocytes myelinating, microglia, תאי אנדותל, ואת pericytes נותחו על ידי רצף RNA 17, ASPA מתבטא באופן בלעדי oligodendrocytes , בפרט ב myelinating oligodendrocytes (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). למרות המחקרים הללו על דפוס הביטוי ASPA במוח, מספר הוודאות להישאר.
ניתן להשתמש בטכניקות שונות כדי ללמוד דפוסי ביטוי גנים. IHC היא שיטה נפוצה לאיתור המוצר הפונקציונלי (כלומר, חלבון) של ביטוי גנים בסעיפי רקמות. למרות השירות שלה גדול, טכניקה זו יש מגבלות כיישום והספציפי שלה כפופה to הזמינה הספציפי של הנוגדן הצורך. לשם השוואה, שאני עורך יש את היתרון של להיות מסוגל לחשוף את הביטוי של כל גן ברמת mRNA. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית להשתמש כמה בדיקות בו זמנית על מנת למקם ביטוי גני סוגי תאים ספציפיים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול המשלב RNA קרינה הכפולה הכלאה באתרו עם הקרינה immunolabelling של חלבון. השתמשנו זו קבוצה של טכניקות כדי לבחון את דפוס הביטוי של Aspa במוח העכבר. שיטה זו מאפשרת המחקר המדויק של ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה:
בעלי וטיפול Mouse הם בהתאם לתקנות משרד הפנים בבריטניה והנחיות ועדת האתיקה UCL, עולות בקנה אחד עם בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986 של הממלכה המאוחדת ותקנות תיקון ל -2012.
הערה: כל הפתרונות צריכה להיעשות עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) - מים מטופלים להרוס כל RNase שיורית. לטיפול DEPC, להוסיף DEPC (1 מ"ל לליטר), לנער במרץ עד שכל כדוריות DEPC נעלמו אז החיטוי כדי לבזות את DEPC.
סינתזה 1. RNA Probe
- זהירות: בעת טיפול לפוראמיד, ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) ולהשתמש בארון בטיחות. הכן חיץ הכלאה: מים ללא יונים DEPC שטופלו עם 50% (v / v) לפוראמיד deionized, 200 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 מ"מ לאא 2 4 PO, 5 מ"מ Na 2 HPO 4, 0.01 מ"ג / tRNA שמרים מיליליטר, 1 × soluti של Denhardtעל, ו -10% w / v סולפט dextran.
- בחר שיבוט DNA המכיל את רצף cDNA של הגן של עניין פלסמיד עם היזמים RNA פולימראז. בדוגמה זו, השתמש שיבוט pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), עם T7 ומקדמי פולימראז SP6 רנ"א עבור Aspa (איור 1 משלים).
- הכן את ה- DNA פלסמיד לינארית כתבנית.
- לגדל את שיבוט DNA, לחלץ את הפלסמיד עם ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה קטן פי פרוטוקול ורצף של היצרן עם T7 ו פריימרים אוניברסלי SP6.
- תקציר פלסמיד דנ"א 1,020 מיקרוגרם עם אנזים הגבלה שחותך בסוף '5 של גדיל תחושה של cDNA. בדוגמה זו, השתמש 100 יחידת סאל לי לעכל את הפלסמיד Aspa pCMV-SPORT6-. דגירה של 1.5 שעות ב 37 מעלות צלסיוס
- הפעל aliquot קטן על ג'ל agarose לבדוק כי פלסמיד לינארית לגמרי.
- לטהר אתהפלסמיד לינארית באמצעות כלורופורם פנול.
- להוסיף 1/10 נפח של נתרן אצטט M 3, כרך אחד של 10 מ"מ טריס HCl (pH 8.0) - פנול equilibrated ונפח אחד של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (רש"ת) (24: 1).
- צנטריפוגה ב XG 16,000 דקות 1 ב RT (20 - 25 ° C, RT) ולחלץ בשלב מימי עליון.
- להוסיף נפח אחד של כלורופורם / רשות עתיקה, צנטריפוגות ב XG 16,000 דקות 1 ולחלץ בשלב מימי עליון.
- חזור על שלב 1.4.3.
- מוסיפים 2 כרכים של אתנול ולהשאיר ב -20 o צלזיוס במשך שעה 1. או O / N.
- צנטריפוגה ב XG 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בטל supernatant.
- שטפו את הכדור עם אתנול קר 70% מחדש להשעות ב cDNA approximatively 1 מיקרוגרם לכל 2.5 μl ב TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5).
- לסנתז את שתי בדיקות, אחת שכותרתו עם Digoxigenin (DIG) והשני עם isothiocyanate והעמסת (FITC).
- בחר את RNA פולימראז המתאימה לעשות את-se אנטיחללית NSE (משלימה היעד mRNA). בדוגמה זו, השתמש RNA פולימראז T7 לעשות בדיקה Aspa.
- הכן בתגובה שעתוק במבחנה: להוסיף 1 מיקרוגרם של ה- DNA לינארית, 4.0 μl 5 חיץ שעתוק x, 6.0 μl של 100 מ"מ DTT, 2.0 μl של 10x תערובת תיוג RNA DIG או FITC dNTPs המכיל, 1 מעכב RNase μl, ו 20 - 40 יחידות של RNA פולימראז; להפוך את עוצמת הקול הסופי עד 20 μl במים שטופלו DEPC.
- לדגור על 37 מעלות צלסיוס במשך 1.5 שעות.
- μl Run1 של תגובת השעתוק על ג'ל agarose 1.0% לבדוק שהתגובה עבדה. הג'ל צריך להראות את התבנית לינארית להקה בהירה של החללית.
- הפוך את עוצמת הקול עד 100 μl עם חיץ הכלאה ולאחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C.
2. זלוף, קיבוע אוסף רקמות
- זהירות: בעת טיפול paraformaldehyde (PFA), הן מוצקותמימית, ללבוש PPE ולהשתמש בארון בטיחות. כן פתרון פורמלדהיד ידי המסת 4% (w / v) PFA לתוך 1x בופר פוספט (PBS) פתרון באמצעות חום (55 מעלות צלזיוס). סנן פתרון פורמלדהיד עם נייר סינון.
- כן תמיסת סוכרוז על ידי המסת 20% (w / v) סוכרוז במים מזוקקים ולהוסיף 0.1% (v / v) פתרון DEPC. השאר O / N ב RT עם מכסה רופף ולאחר מכן חיטוי.
- סופני לטשטש עכבר ידי הזרקה תוך הצפק של pentobarbitone (50 מ"ג / ק"ג). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן והיעדר רפלקס נסיגה מצביע הרדמה עמוקה.
- לאחר העכבר הוא בהרדמה עמוקה, עושה חתך מתחת לבית החזה וחתך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים, להרים אותו כדי לחשוף את הלב.
- הכנס מחט 25-G לתוך החדר השמאלי של הלב. ביצוע חתך קטן העלייה הימנית של הלב.
- Perfuse החיה עם 20 מ"ל PBS ולאחר מכן 40 בתמיסת פורמלדהיד מ"ל. עבור P30 ומעלהעכברים, השתמש שיעור זלוף של 12 מ"ל / דקה אלא גם לבעלי חיים צעירים להשתמש בשיעור נמוך יותר (7 - 10 מ"ל / דקה).
- מנתח את המוח.
- לנתק את ראש העכבר עם מספרי כירורגיות על ידי יצירה אחורית לחתוך מהאוזניים. ביצוע חתך קו אמצע זנב בעור ולעבוד rostrally להסיר את העור מפני גולגולת.
- החל מחלק הזנב, לחתוך דרך החלק העליון של הגולגולת לאורך קו אמצע בין העיניים עם מספרי איריס. הסר את הקודקודית וצלחות עצם הפרונטלית ידי הטיית צד אחד של לוחית עצם בכל פעם ומאכל את זה עם פינצטה.
- בעדינות להטות את המוח כלפי מעלה מהחלק הקדמי עם פינצטה וחותכי עצבי הראייה ואת עצבי גולגולת אחרים. הרם בעדינות את המוח מתוך הגולגולת.
- מניח את המוח לתוך מטריצת מוח עטרת עכבר. פורסים את המוח לחתיכות 3 כ 4 מ"מ עם סכין גילוח נוצה.
- מעבירים את פרוסות לתוך פתרון 4% PFA דגירה O / N ב 4 ° C.
- מוח העברהפרוסות DEPC שטופלו 20% תמיסת סוכרוז דגירה O / N ב 4 ° C
- מניח כל פרוסת מוח לתוך cryomould יבש, להקיף עם מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי (אוקטובר) ו הקפאת קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
3. Cryosectioning
- חותכים 15 מיקרומטר חלקים של הרקמה הקפואה בתוך cryostat ולאסוף את החלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. במידת הצורך, להרטיב את החלקים עם PBS DEPC שטופלו ולשטח אותם עם מכחול בסדר.
- השאר את השקופיות להתייבש במשך כ 1 hr על מנת להבטיח כי הרקמה שומרת על השקופית.
הכלאה 4.
- הכן 65 ° C לשטוף חיץ: 150 מ"מ NaCl, 15 מ"מ Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= נתרן ציטרט מלוחים 1x), 50% (v / v) לפוראמיד ו -0.1% (v / v) Tween- 20.
- הכן חיץ MABT: 100 חומצה maleic מ"מ, 150 מ"מ NaCl, 0.1% (v / v) Tween-20, pH 7.5.
- לדלל את שתי חלליות (DIG שכותרתו FITC-Labelleד) 1 / 1,000 במאגר הכלאה מחומם מראש ל 65 מעלות צלזיוס ומערבבים היטב.
- החל בסביבות 300 μl של תערובת הכלאה על כל שקופית, coverslipwith אפויים בתנור (200 מעלות צלסיוס) coverslips דגירה O / N ב 65 מעלות צלזיוס בתא humidified.
- העברת שקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל חיץ לשטוף מחומם מראש. שטפו את השקופיות למשך 30 דקות פעמיים ב 65 מעלות צלזיוס עם חיץ לשטוף.
- שטפו את השקופיות עבור 10 דקות שלוש פעמים עם MABT ב RT.
ויזואליזציה 5. של החללית FITC
- הכין חיץ חסימה שאני עורך: MABT עם מגיב חסימת 2% ו -10% בסרום כבשי חום מומת.
- אופציונלי: להשתמש בעט הידרופובי לצייר עיגולים סביב קטעי רקמה בשקופית כדי לצמצם את היקף פתרונות נוגדנים הנדרשים.
- דגירה השקופיות במשך שעה 1 ב RT עם ISH חיץ חסימת בתא humidified.
- דגירה השקופיות O / N ב 4 ° C עם peroxidase חזרת (POD) - המצומדנוגדן אנטי FITC ד בדילול 1/500 (v / v) ב ISH חסימת חיץ.
- מניחים את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל PBS עם 0.1% (v / v) Tween-20 (PBST). לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות ב PBST ולהחליף PBST טרי בכל פעם.
- מיד לפני השימוש, להכין את tyramide ניאון על ידי דילול 100 פעמים לתוך diluent הגברה. בדוגמה זו, השתמש FITC-tyramide.
- הוסף את זה את השקופיות ולהשאיר למשך 10 דקות ב RT.
- מניחים את השקופיות לתוך צנצנת Coplin לשטוף 3 פעמים ב PBST במשך 10 דקות.
ויזואליזציה 6. של החללית DIG
- כן 0.1 M כמה העצוב HCl pH 8.2.
- דגירת השקופיות עם חיץ חסימה שאני עורך עבור שעה 1 ב RT.
- דגירה השקופיות O / N ב 4 ° C עם phosphatase אלקליין (AP), מצומדות נוגדן אנטי DIG בדילול 1/1500 (v / v) ב ISH חסימת חיץ.
- לשטוף עם MABT במשך 10 דקות שלוש פעמים.
- שטפו פעמיים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 במשך 5 דקות ב RT.
- מייד לפני השימוש, להכין פתרון אדום מהיר על ידי המס את הטבליות 0.1 M טריס pH 8.2. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
- דגירת השקופיות ב 37 ° C עם פתרון אדום מהיר בתא humidified. ככל שהזמן לפיתוח אופטימלי משתנה, לבדוק את השקופיות באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח על היווצרות של המשקע. בדוגמה זו, לעצור את התגובה לאחר 2 - 3 שעות.
- לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים.
7. אימונוהיסטוכימיה
- הכן חיץ חסימת IHC: 10% (V / V) בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני) ב PBST.
- דגירה שקופיות עם IHC חסימת חיץ במשך שעה 1 ב RT בתא humidified.
- הכין נוגדן ראשוני: לדלל את הנוגדן הראשוני על דילול מתאים ב PBST עם 5% בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני). בדוגמה זו, השתמש נוגדן אנטי Olig2 הארנב 1/400 (v / v) דילול.
- מדגירים את הפתרון נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N.
- לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים.
- כן נוגדנים משני: לדלל נוגדנים משני fluorophore מצומדות ב דילול מתאים ב PBST עם 5% (v / v) בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני) ו -0.1% (v / v) Hoechst 33258. לדוגמה זה , להשתמש חמור ארנבת אנטי Alexa647 נוגדנים משני ב 1 / 1,000 (v / v) דילול.
- מדגירים את הפתרון נוגדנים משני ב RT עבור שעה 1.
- לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים.
שמה 8.
- חלקית לייבש את השקופיות ב RT, ולעגן עם הרכבה בינוני קרינה. השאירו את השקופיות להתייבש ואז התמונה מיקרוסקופ confocal תחת 10X, 20X ו 63X מטרות באמצעות 4 ערוצים שונים עם אורכי גל עירור הבאים: 570 ננומטר עבור Fast האדום, 488 ננומטר עבור FITC, 647 ננומטר עבור immunolabelling Olig2 ו -350 ננומטר עבור Hoechst .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאמר זה מתאר שיטה עבור ISH קרינה כפולה ואחריו immunolabelling בסעיפים במוח עכבר. להלן תיאור קצר של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. הצעד הראשון היה לסנתז בדיקות ספציפיות כדי Aspa ו MBP (חלבון המיאלין הבסיסי). כדי לבדוק כי הבדיקות היו מסונתזות, aliquot קטן של כל תגובה נדרס על ג'ל agarose. התבנית ליניארי הקלושה וכמות גדולה של חללית RNA ניתן לראות (איור 2). שאני עורך הקרינה זוגי Aspa ו MBP, ואחריו immunolabelling Olig2 ו Hoechst מכתים גרעיני, בוצע על חלקים במוח העכבר. סרקנו את סעיפי מוח מיקרוסקופ confocal ותפרו את התמונות יחד כדי לחשוף את חלוקת אותות ביטוי גנים במוח. ביטוי Aspa ב -positive MBP (MBP +) תאים נצפו לאורך החזייה ב (איור 3). גם בדקנו ביטוי Aspa במבנים שונים במוח באמצעות גדלה גבוהה. Aspa ביטוי oligodendrocytes ב callosum קליפת קורפוס מוצגים באיור 4. את שיתוף לוקליזציה של MBP, Olig2, ו Aspa עולה כי Aspa מתבטא משנה של oligodendrocytes בוגרת בקליפת ואת כפיס המוח (איור 4). תוצאות אלו מראות כי בפרוטוקול זה יכול לזהות את הביטוי בו זמני של שלושה גנים שונים חלקים במוח.
פרוטוקול באיור 1. לכפיל הקרינה הכלאה באתרו ואחריו Immunostaining. פרוטוקול זה פועל מעל 5 ימים ומזהה את הביטוי של שלושה גנים./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. בחינת Aspa RNA Probe על Agarose ג'ל. התבנית לינארית כמות גדולה של החללית RNA של משקל מולקולרי נמוך יותר ניתן לצפות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. קרינה זוגית ב כלאה באתרו עבור Aspa ו MBP בסעיפי מוח עכבר. Aspa (אדום) ו MBP (ירוק) במוח. סרגל קנה מידה:. 500 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ביטוי איור 4. Aspa ב Oligodendrocytes בקליפה ואת כפיס המוח. פנלים להציג תמונות נציג שאני עורך עבור Aspa (אדום) ו MBP (ירוק) ואחריו immunostaining של Olig2 (כחול) בשילוב עם מכתים Hoechst. Aspa התבטא בכמה MBP + / Olig2 + תאים בקליפת (A ו- B) ובסופו של כפיס המוח (C ו- D). M נ"ב + / Olig2 + / Aspa + תאים מסומנים עם חצי MBP + / Olig2 + / Aspa - תאים מסומנים עם ראשי חץ של לוחות המוגדלים (B ו- D). ברי סולם: 100 מיקרומטר (A ו- C); 20 מיקרומטר (B ו- D). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
רצף משלים באיור 1. ומפת Aspa Clone (IRAVp968C0654D). רצף cDNA 1.5KB של Aspa הוכנס לתוך pCMV-Sport6 פלסמיד (א). מפת פלסמיד pCMV-Sport6-Aspa מוצג (B).מ '/ קבצים / ftp_upload / 53,976 / 53976supfig1large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק הליך צעד-אחר-צעד עבור RNA כפול הכלאה באתרו ואחריו immunostaining. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לאשר Aspa מתבטא oligodendrocytes בוגרת בכמה אזורים במוח.
יש הליך רב שלבים זה בעיות פוטנציאליות רבות שיכולים להשפיע רגישות וכן יש להימנע. ראשית, כל הפתרונות ואת מאגרים לאחסון התגובה שעתוק צריך להיות RNase חינם. שנית, הבחירה של תבניות cDNA חשובה ואנחנו מעדיפים תבניות כ 1KB באורך. יש צורך לנקות את תבניות cDNA עם מיצוי פנול / כלורופורם מחדש לזרז אותם לפני שעתוק במבחנה. בנוסף, התעתיק של החללית צריך להיות אופטימלי; אם החללית אינה מיוצרת בכמות מספקת, היא תפחית את האיכות שאני עורך. האיכות של החללית ניתן לבדוק על ידי בחינה אותו על ג'ל agarose ואיכות טובה תהיהשמעיד הבהירות החזקה של להקת הבדיקה לעומת להקת התבנית (איור 2). לקבלה שאני עורך כפול, שתי בדיקות שכותרתו שונה משמשות, בדרך כלל אחד שכותרתו עם DIG ושני עם FITC. החללית שכותרתו FITC נחשבת המעטה לגילוי ו צריך להיבחר שבו mRNA היעד צפוי להיות גבוה ביותר בתוך הרקמה. בדיקה זו היא בדרך כלל פתחה לראשונה את החללית שכותרתו DIG מפותחת שנייה.
עוד צעד קריטי הוא הכנה רקמות. עכברים הם perfused עם DEPC שטופלו PBS ואחריו PFA 4%, שלאחר קבוע PFA 4% O / N ואז cryoprotected בפתרונות סוכרוז 20% כי כבר DEPC שטופלו להרוס כל RNase שיורית. זמן קיבוע חשוב מאוד; יתר או תת-קיבעון יכול להוביל אות חלשה, אולי בגלל חדירת בדיקה מופחתת (יתר הקיבוע) או שפלה של mRNA (תחת קיבוע). הרקמה היא cryosectioned אז שתי חלליות הם כלת O / N. לפוראמידהשתמש במאגר הכלאה צריך להיות לא מיונן. שיקול חשוב מאוד במהלך כלת O / N ב 65 C הוא כדי למנוע אידוי וריכוז של תערובת ההכלאה כיוון שהוא עלול לסכן רגישות. בניסוי המתואר ביצענו הכלאה ב 65 CO / N, אבל זה יכול להיות שווה לנסות בטמפרטורות נמוכות יותר עבור בדיקות שונות אם זה נראה קשה לזהות את ה- mRNA היעד.
יש בחירה של חומרים כימיים לגילוי חלליות ההכלאה. אדום מהיר הוא מגיב ניאון רגיש אבל לא כל אצוות של אדום מהיר יביא לתוצאה הזהה. הוא זקוק AP לפיתוח ונותן קרינה עם עירור rhodamine. מניסיוננו, חשוב לעשות את זה טרי עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 ולסנן אותו לפני השימוש. כתב אופציה לא ניאון הוא פיתוח צבע עם ניטרו-כחול tetrazolium (NBT) ו 5-bromo-4-כלורו-3'-indolyphosphate (BCIP) אשר עובד עם אותו נוגדן AP מצומדות. Anoאפשרות יס היא באמצעות tyramide פלורסנט לגילוי. בעוד שמערכות tyramide פלורסנט אינן השיטות הרגישות ביותר, תגובת הפיתוח עם peroxidase חזרת מאוד מהירה ויש לפחות שלושה צבעי ניאון (FITC, Cyanine 3 ו Cyanine 5), שניתן להשתמש בם. הגבלה של פרוטוקול זה היא שחלק אנטיגנים היעד (או אפיטופים), במיוחד חלבונים שפע נמוך, ייתכן שלא ניתן יהיה לקלוט לאחר תהליך שאני עורך ומכאן אינם מתאימים IHC לאחר שאני עורך. בשנת immunostaining שלנו, זיהוי הנוגדן של Olig2 מופיע מעושה. המשתמש יצטרך לבחור את הנוגדן המתאים immunolabelling שאני ערך הבא.
IHC ו שאני עורך משמשים טכניקות נפוצות ללימודי דפוס ביטוי גנים, ושניהם יש יתרונות וחסרונות. IHC היא שיטה רגישה מאוד לזיהוי הביטוי התאי של גנים חלקים במוח, אבל הסתמכותו על הנוגדן משפיע הספציפיות שלו ומגביל את תחולתו. בניגוד לכך, שאני עורך יש spec גבוהificity ואת החללית של כל גן יכול להיות מסונתז בקלות על ידי שעתוק במבחנה באמצעות cDNA גן ספציפי כתבנית. הפרוטוקול שפתחנו מנצל בשתי השיטות, שילוב שאני עורך כפול עם IHC להשיג זיהוי משולש של ביטוי גנים עם סגוליות גבוהות.
בקיצור, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר מכתים במקביל של שני תעתיקים וחלבון אחד, כך שהוא מספק כלי שימושי אשר ימחיש ביטוי גנים-מקומי שיתוף. למרות העובדה כי ביטוי mRNA לא תמיד לתאם עם ביטוי חלבון, שאני עורך היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת לנו לבחון ביטוי גנים עם סגוליות גבוהה. הפרוטוקול שלנו של ISH קרינה הכפולה משולבת עם IHC הוכיח להיות הצלחה באיתור ביטוי Aspa משנה של oligodendrocytes ברקמת המוח של עכברים בוגרים, וזה יכול בקלות להיות מותאם עבור מגוון רחב של רקמות ממוצא שונה שלב התפתחות. בנוסף, פרוטוקול זהגם יכול לשמש לזיהוי ביטוי RNA הקטן כגון מירנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al.
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
