Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
मस्तिष्क की कोशिकाओं जैसे, न्यूरॉन्स, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte व्यापारियों और microglia के विभिन्न प्रकारों में जीन अभिव्यक्ति की जांच, immunostaining के लिए विशिष्ट प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी की कमी आड़े आती जा सकता है। यहाँ हम दो जीन विशेष जांच उच्च विशिष्टता प्रोटीन एक तिहाई जीन द्वारा इनकोडिंग के खिलाफ निर्देशित की एक एंटीबॉडी के साथ immunostaining द्वारा पीछा के साथ सीटू संकरण में डबल प्रतिदीप्ति का उपयोग एक ही मस्तिष्क खंड में तीन अलग-अलग जीनों की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। Aspartoacyclase (ASPA) जीन, जिनमें से म्यूटेशन एक दुर्लभ मानव सफेद पदार्थ रोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं – Canavan रोग – oligodendrocytes और microglia में लेकिन astrocytes और न्यूरॉन्स में नहीं व्यक्त किया जा करने के लिए सोचा है। हालांकि, मस्तिष्क में ASPA की सटीक अभिव्यक्ति पैटर्न अभी तक स्थापित किया जाना है। इस प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए कि ASPA परिपक्व oligodendrocytes एक के एक सबसेट में व्यक्त किया जाता है हमें अनुमति दी गई हैएन डी यह आम तौर पर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है।
Glial कोशिकाओं है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं रहे हैं, oligodendrocytes (सीएनएस के myelinating कोशिकाओं), oligodendrocytes व्यापारियों (ऑप्स, भी "NG2 कोशिकाओं" के रूप में जाना जाता है), astrocytes और microglia शामिल। वहाँ मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 1 में glial कोशिकाओं और उनके संभावित भूमिकाओं के कार्यों में रुचि बढ़ रही है। उदाहरण के लिए, Canavan रोग (सीडी) एक वंशानुगत neurodegenerative विकार स्पाँजिफार्म leukodystrophy और न्यूरॉन्स के एक प्रगतिशील हानि के साथ प्रारंभिक अवस्था में शीघ्र शुरू करने, आम तौर पर 2,3 उम्र के 10 साल से पहले मौत के लिए अग्रणी है। Aspartoacyclase (ASPA) जीन में उत्परिवर्तन कि नेतृत्व काफी ASPA गतिविधि 4 कम करने के लिए सीडी में पहचान की गई है। ASPA एक एंजाइम एन acetylaspartate (NAA) की deacetylation उत्प्रेरित करने, एक अणु अत्यधिक मस्तिष्क में केंद्रित पैदा एसीटेट और aspartate 5-7 है। कई सीडी रोगियों ASPA एसी की कमी के कारण NAA के उच्च स्तर दिखानेtivity। कुछ अध्ययनों से अटकलें NAA व्युत्पन्न एसीटेट विकास के दौरान फैटी एसिड / मस्तिष्क में लिपिड का एक प्रमुख स्रोत हो सकता है और NAA की विफलता की वजह से विकास 3,5,6 टूट किया जा करने के दौरान माइलिन संश्लेषण में कमी आई सीडी से परिणाम हो सकता है कि।
ASPA मुख्य रूप से गुर्दे, जिगर और मस्तिष्क के सफेद पदार्थ में पाया जाता है, और सीडी में ASPA की महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए मस्तिष्क में इस एंजाइम की सेलुलर अभिव्यक्ति कई प्रयोगशालाओं द्वारा अध्ययन किया गया है। मस्तिष्क में ASPA enzymatic गतिविधि को देख कर, पहले के अध्ययनों में पाया गया कि मस्तिष्क के विकास के दौरान ASPA गतिविधि में वृद्धि myelination 8-10 के समय पाठ्यक्रम समानताएं। सेलुलर स्तर पर, enzymatic गतिविधि के लिए के रूप में अच्छी तरह से सीटू संकरण (ISH) और immunohistochemistry (आईएचसी) में assays का सुझाव विश्लेषण करती है कि ASPA मुख्य रूप से मस्तिष्क में है, लेकिन न्यूरॉन्स या astrocytes 11-16 में नहीं oligodendrocytes में व्यक्त किया जाता है। कुछ अध्ययनों में पाया गया कि शायद यह भी ASPAसीएनएस 12,14 में microglia में व्यक्त किया। ऑप्स में ASPA अभिव्यक्ति पर अब तक डेटा सीमित हैं। एक ताजा अध्ययन में जहां न्यूरॉन्स, astrocytes, ऑप्स, नवगठित oligodendrocytes, myelinating oligodendrocytes, microglia, endothelial कोशिकाओं, और pericytes सहित माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के transcriptomes आरएनए अनुक्रमण 17 से विश्लेषण किया गया के अनुसार, विशेष रूप से ASPA oligodendrocytes में व्यक्त किया जाता है , oligodendrocytes myelinating में विशेष रूप से (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html)। मस्तिष्क में ASPA अभिव्यक्ति पैटर्न पर इन अध्ययनों के बावजूद, अनिश्चितताओं के एक नंबर रहते हैं।
विभिन्न तकनीकों जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आईएचसी ऊतक वर्गों में एक जीन अभिव्यक्ति के कार्यात्मक उत्पाद (यानी, प्रोटीन) का पता लगाने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि है। अपनी महान उपयोगिता के बावजूद, इस तकनीक सीमाएँ हैं के रूप में अपने आवेदन और विशिष्टता विषय टी रहे हैंउपलब्धता और एंटीबॉडी की जरूरत की विशिष्टता ओ। तुलना करके, ईश mRNA स्तर पर किसी भी जीन की अभिव्यक्ति प्रकट करने में सक्षम होने का लाभ दिया है। हालांकि, यह तकनीकी रूप से आदेश विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक जीन अभिव्यक्ति स्थानीयकरण करने में ही समय में कई जांच का प्रयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस अनुच्छेद में, हम एक प्रोटीन की प्रतिदीप्ति immunolabelling साथ स्वस्थानी संकरण में संयोजन डबल प्रतिदीप्ति आरएनए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम माउस मस्तिष्क में Aspa की अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करने के लिए तकनीक के इस सेट का इस्तेमाल किया है। इस विधि confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग जीन अभिव्यक्ति की सटीक अध्ययन की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल सीटू संकरण में एक डबल आरएनए immunostaining के द्वारा पीछा के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया प्रदान करता है। हम पुष्टि करते हैं कि Aspa कई मस्तिष्क क्षेत्रों में परिपक्व oligodendrocytes में व्यक्त किया ज?…
The authors have nothing to disclose.
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
SalI | New England Biolabs | R0138 | |
Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
Transcription buffer | Promega | P118B | |
100mM DTT | Promega | P117B | |
UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
Rnasin | Promega | N251B | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
Sucrose | Sigma | 59378 | |
Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
Iris scissors | Weiss | 103227 | |
No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
Cryostat/microtome | Bright | ||
Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
.22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
Mounting medium | Dako | S3023 | |
Leica SP2 confocal microscope | Leica |