Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
התגובה של תאים בודדים לתרופות אנטי-סרטניות תורמת באופן משמעותי בקביעת תגובת האוכלוסייה, ולכן הוא גורם מרכזי תורם בתוצאה הכללית. Immunoblotting, cytometry זרימה וניסויי תא קבוע משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד כיצד תאים מגיבים לתרופות אנטי-סרטניות. שיטות אלה חשובות, אבל יש להם חסרונות רבים. משתנה הם תגובות סמים בין סרטן תאים נורמלים, ובין תאים ממוצא הסרטן שונה, וחולף ותגובות נדירות שקשה להבין באמצעות מבחני מיצוע אוכלוסייה וללא יכולת לעקוב ישירות ולנתח אותם אורכים. המיקרוסקופ הוא גם מתאים במיוחד לתאים חיים תמונה. התקדמות הטכנולוגיה מאפשרת לנו תאי תמונה שגרתי ברזולוציה המאפשרת לא מעקב תא בלבד, אלא גם את התצפית של מגוון תגובות הסלולר. אנו מתארים גישה בפירוט המאפשר הדמיה זמן לשגות רציפה שלתאים במהלך תגובת התרופה בעצם כל עוד רצוי, בדרך כלל עד 96 שעות. באמצעות וריאציות של הגישה, ניתן לנטר תאים במשך שבועות. עם העסקה של תהליכים רבים biosensors פלורסנט מקודד גנטי, שבילים ותגובות יכולה להיות אחריו. אנו מציגים דוגמאות הכוללות מעקב וכימות של גדילת התא התקדמות מחזור התא, דינמיקה כרומוזום, נזק לדנ"א, מוות של תאים. כמו כן נדונו וריאציות של הטכניקה והגמישות שלה, ולהאיר כמה מלכודות נפוצות.
מיקרוסקופיה Live- תא מעקב אורך של תאים בודדים היא לא טכניקה חדשה. מתוך המיקרוסקופים המוקדמים, חובבי מדענים הבחינו ולומדים תאים בודדים ואורגניזמים, ההתנהגויות שלהם, ופיתוח 1-3. דוגמה מפורסמת מן דיוויד רוג'רס המנוח באוניברסיטת ונדרבילט בשנת 1950 מראה נויטרופילים האדם כתם דם רודפים חיידק סטפילוקוקוס ולבסוף בתהליך של phagocytosis 4. חי בסרט תא זו הוא המחשה מצוינת לאופן שבו מספר רב של תהליכים שניתן לצפות בקורלציה בניסוי יחיד: חישה של שיפוע כימי, מכניקה ומהירות תנועתיות תא, תא מעצבת דינמיקה, הדבקה, ואת phagocytosis של פתוגן.
הופעתו של מיקרוסקופים אוטומטיים לחלוטין ומצלמות דיגיטליות רגישות גבוהה הביאה מספר גדל והולך של חוקרים באמצעות מיקרוסקופ לשאול שאלות יסוד f החל הביולוגיה של תאrom כיצד תאים להעביר 5,6 ולחלק 7,8 כדי אברון הדינמיקה וסחר הממברנה 9-11. ללא פלורסנט, מיקרוסקופיה brightfield, כולל שלב בניגוד (PC), אשר זכה בפרס נובל פריץ Zernike בשנת 1953, ואת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) לאפשר תצפית של תאים גרעינים, אלא גם במבנים המשנה הסלולר כולל חבילות microtubule , כרומוזומים, nucleoli, דינמיקת אברון, וסיבים יקטינו עבים 12. מקודד גנטית חלבוני ניאון לבין התפתחות של צבעי ניאון נגד אברונים השפיעו באופן דרמטי זמן לשגות מיקרוסקופית 13-15. אמנם לא המוקד של מאמר זה, הדמית spheroids תא באתרו (מיקרוסקופיה intravital) באמצעות confocal במיקרוסקופ multiphoton מייצגת הרחבה נוספת של הגישה, ויש מאמרים מצטיינים המשתמשים ולדון הגישות הללו 16-19.
התגובות של תאי אל-canc אנטיתרופות אה או מוצרים טבעיים נקבעות על הסולם המולקולרי תאי. לאחר טיפול תגובות גורלות תא הבנה כרוך לעתים קרובות מבחני מיצוע אוכלוסייה (למשל., Immunoblotting, אמצעים היטב שלמים), או בזמן נקודות קבועות עם זיהוי immunofluorescent ו cytometry זרימה, אשר מודדים תאים בודדים. הטרוגניות בתגובות תא בודדות לסמים בקרב אוכלוסייה, בפרט בגידולים, עשויות להסביר חלק ההשתנות בתגובה לראות פני שורות תאים וגידולים כי מטופלים עם התרופה הזהה ב רוויה. לטווח ארוך גישות האורך לעקוב תא בודד נתון או אוכלוסייה של תאים הוא גישה נפוצה פחות, אבל רב עצמה המאפשרת לחקר הישיר של מסלולי תגובה מולקולריים, פנוטיפים שונים (למשל., מוות של תאים או חלוקת תא), תצפית של תא אל תא השתנות בתוך אוכלוסייה, ואיך הגורמים הללו תורמים דינמיקה בתגובת אוכלוסיית 20-22. באופטימיות, יכולתלהתבונן ולכמת התגובות תא בודד יעזור לשפר את הבנתנו כיצד תרופות לעבוד, למה הם לפעמים נכשלים, וכיצד להשתמש בהם בצורה הטובה ביותר.
הטכניקה של מיקרוסקופיה לטווח ארוכת זמן לשגות, מעקב אורך, וניתוח תגובות סמים היא העומד לרשות חוקרים רבים והוא יכול להיות פשוט, באמצעות אור המועבר רק להתבונן תגובות פנוטיפ 20,21. הרכיבים העיקריים של הגישה כוללים: ההיערכות מתאימה של התאים בעלי עניין, מיקרוסקופ אוטומטי עם תא סביבתי, מצלמה משולבת עם מחשב לרכוש ולאחסן את התמונות, ותוכנה לעיין לשגות זמן למדוד ולנתח את התאים וכל biosensors ניאון. אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם טיפים רבים לניהול מיקרוסקופיה זמן לשגות של תאים בתרבית למשך עוד כמה ימים באמצעות brightfield ו / או מיקרוסקופיה epifluorescent widefield. פרוטוקול זה יכול לשמש לכל שורת תאים שניתן גדלים בתרביתללמוד התגובות שלהם לטיפולים אנטי-סרטניים. אנו מספקים דוגמאות של נתונים רכשה ונותחו באמצעות חיישנים ביולוגיים פלורסנט גנטית בקידוד שונה מרובים דוגמה מיקרוסקופיה שלב בניגוד, לדון סוגים שונים בקצרה של בדיקות, את היתרונות והחסרונות של זמן לשגות לטווח ארוך ומעקב האורך, מה יכול להיות מלומדת הגישה הזאת כי קשה להבין מן הערוצים הלא ישירים, וכמה וריאציות שאנו מקווים יהיה עניין וערך לחוקרים מנוסים שלא נחשבו בגישה, וכדי חוקרים מנוסים.
יתרונות של זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב לאורך שנים
המיקרוסקופ הוא מכשיר אידיאלי עבור מחקרים ארוכי טווח התגובה התרופה כפי שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תאים בודדים גורלם וכן את כלל האוכלוסייה. השתנות בתגובת סמים בתוך אוכ…
The authors have nothing to disclose.
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
Nikon laser launch | Nikon | ||
SOLA light engine | lumencor | ||
iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |