Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
استجابة الخلايا وحيدة إلى الأدوية المضادة للسرطان تساهم بشكل كبير في تحديد استجابة السكان، وبالتالي تعتبر عاملا رئيسيا يسهم في النتيجة الإجمالية. Immunoblotting، التدفق الخلوي والتجارب خلية ثابتة وغالبا ما تستخدم لدراسة كيفية استجابة الخلايا للأدوية المضادة للسرطان. وهذه الأساليب هي مهمة، ولكن لديهم العديد من أوجه القصور. التباين في ردود المخدرات بين السرطان والخلايا الطبيعية، وبين خلايا المنشأ السرطانية المختلفة، وعابرة وردود نادرة من الصعب أن نفهم باستخدام فحوصات المتوسط السكان ودون أن تكون قادرة على تتبع مباشرة وتحليلها بشكل طولي. المجهر بشكل خاص مناسبة تماما لصورة الخلايا الحية. التطورات في مجال التكنولوجيا تمكننا من روتيني خلايا الصورة في القرار الذي تمكن ليس فقط تتبع الخلية، ولكن أيضا مراقبة مجموعة متنوعة من الاستجابات الخلوية. وصفنا هذا النهج في التفاصيل التي تسمح للتصوير المستمر الوقت الفاصل بينالخلايا خلال الاستجابة للدواء لفي الأساس طالما رغبت في ذلك، عادة ما يصل إلى 96 ساعة. استخدام الاختلافات في النهج، وخلايا يمكن رصدها لأسابيع. مع توظيف المشفرة وراثيا أجهزة الاستشعار الفلورسنت العديد من العمليات، ومسارات والاستجابات يمكن اتباعها. وتبين لنا الأمثلة التي تشمل تتبع النوعي والكمي لنمو الخلايا وتقدم دورة الخلية، وديناميات كروموسوم، الحمض النووي من التلف، وموت الخلايا. نحن أيضا مناقشة الاختلافات في الأسلوب ومرونته، وتسليط الضوء على بعض المخاطر المشتركة.
المجهر الخلية الحية وتتبع طولية من الخلايا واحدة ليست تقنية جديدة. من أقرب المجاهر، وقد لاحظ المتحمسين والعلماء ودرس الخلايا وحيدة والكائنات، تصرفاتهم، والتنمية 1-3. ومن الأمثلة الشهيرة من أواخر ديفيد روجرز في جامعة فاندربيلت في 1950s يظهر العدلات الإنسان في بقعة من الدم مطاردة بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية، وفي نهاية المطاف عملية البلعمة (4). هذا الفيلم الخلية الحية هو مثال ممتاز لكيفية عمليات متعددة يمكن ملاحظتها والمترابطة في تجربة واحدة: الاستشعار من التدرج الكيميائية، والميكانيكا وسرعة الحركة خلية، خلية الأشكال ديناميكية، التصاق، والبلعمة من العوامل المسببة للأمراض.
وقد أدى ظهور المجاهر مؤتمتة بالكامل والكاميرات الرقمية حساسة للغاية في أعداد متزايدة من المحققين باستخدام المجهر لطرح الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الخلية تتراوح ومدمج كيف تتحرك خلايا 5،6 و 7،8 تنقسم إلى العضيم ديناميات والاتجار غشاء 9-11. غير الفلورسنت، المجهري brightfield، بما في ذلك على النقيض من المرحلة (PC)، الذي حصل على جائزة نوبل للفريتس زيرنيكه في عام 1953، وعلى النقيض تدخل الفرق (DIC) تسمح لمراقبة خلايا ونوى ولكن أيضا الهياكل الفرعية الخلوية بما في ذلك حزم أنيبيب ، الكروموسومات، نويات، وديناميات العضيم، وألياف الأكتين سميكة 12. المشفرة وراثيا البروتينات الفلورية وتطوير الأصباغ الفلورية ضد عضيات أثرت بشكل كبير الوقت الفاصل بين المجهري 13-15. في حين لم يكن التركيز في هذه المادة، والتصوير في الكروية خلية وفي الموقع (intravital المجهري) باستخدام متحد البؤر والفحص المجهري multiphoton تمثل توسع آخر لهذا النهج، وهناك مواد المعلقة التي تستخدم ومناقشة هذه النهج 16-19.
ردود الخلايا لمكافحة كانكونيتم تحديد المخدرات إيه أو المنتجات الطبيعية على المستوى الجزيئي والخلوي. العلاج فهم استجابات الخلايا ومصائر التالية غالبا ما ينطوي على المقايسات سكان المتوسط (على سبيل المثال، immunoblotting، تدابير جيدا الكاملة)، أو الوقت نقطة ثابتة مع كشف مناعي والتدفق الخلوي، التي تقيس الخلايا وحيدة. الاختلاف في استجابة خلية واحدة إلى المخدرات ضمن مجموعة من السكان، ولا سيما في الأورام، قد يفسر بعض التباين في استجابة ينظر عبر خطوط الخلايا والأورام التي يتم التعامل مع نفس الدواء في التشبع. على المدى الطويل نهج طولية لمتابعة خلية واحدة معينة أو مجموعة من الخلايا هو نهج أقل شيوعا ولكنها قوية جدا التي تسمح للدراسة مباشرة لمسارات استجابة الجزيئية، الظواهر المختلفة (على سبيل المثال، موت الخلية أو انقسام الخلية)، ومراقبة تقلب الخلية الى خلية ضمن مجموعة من السكان، وكيف أن هذه العوامل تساهم في ديناميات استجابة السكان 20-22. بتفاؤل، أن تكون قادرةلمراقبة وقياس ردود خلية واحدة سوف تساعد على تحسين فهمنا لكيفية عمل الأدوية، لماذا فشلوا في بعض الأحيان، وكيفية استخدامها أفضل.
تقنية طويلة الأجل الوقت الفاصل بين المجهري، وتتبع الطولي، وتحليل استجابات المخدرات هي متاحة لكثير من المحققين ويمكن أن تكون بسيطة، وذلك باستخدام الضوء فقط تنتقل إلى مراقبة ردود النمط الظاهري 20،21. المكونات الرئيسية لهذا النهج ما يلي: إعداد مناسب من الخلايا من الفائدة، المجهر الآلي مع الغرفة البيئية، متكاملة الكاميرا مع جهاز الكمبيوتر للحصول على وتخزين الصور، وبرامج لإعادة النظر في الوقت الفاصل بين وقياس وتحليل الخلايا وأية أجهزة الاستشعار الفلورسنت. ونحن نقدم بروتوكول مفصلة مع العديد من النصائح لإجراء الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الخلايا المستزرعة لطالما عدة أيام باستخدام brightfield و / أو widefield المجهر epifluorescent. ويمكن استخدامها في أي خط الخلية التي يمكن زراعتها في ثقافة هذا البروتوكوللدراسة ردودهم على العلاجات المضادة للسرطان. نحن نقدم أمثلة على البيانات التي حصل عليها وتحليلها باستخدام متعددة مختلفة أجهزة الاستشعار الفلورسنت المشفرة وراثيا ومثال على المرحلة المجهري على النقيض، ومناقشة لفترة وجيزة أنواع مختلفة من تحقيقات، ومزايا وعيوب على المدى الطويل الوقت الفاصل بين وتتبع الطولي، ما يمكن أن يكون علمت لهذا النهج الذي يصعب فهمه من النهج غير المباشرة، وبعض الاختلافات التي نأمل أن تكون ذات فائدة وقيمة للباحثين عديمي الخبرة الذين لا يعتبر استخدام هذا النهج، والباحثين من ذوي الخبرة.
مزايا المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية
المجهر هو أداة مثالية للدراسات طولية من الاستجابة للدواء كما أنه يسمح للمحققين لتعقب الخلايا الفردية ومصائرهم وكذلك السكان. التغير في الاستجابة للدواء ضمن مجموعة من الخلايا ه…
The authors have nothing to disclose.
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
Nikon laser launch | Nikon | ||
SOLA light engine | lumencor | ||
iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |