Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Responsen av enkle celler til kreftmedisiner bidrar i vesentlig grad ved bestemmelse av populasjonen respons, og derfor er en viktig medvirkende faktor i det totale resultat. Immunoblotting, flowcytometri og faste celleforsøk blir ofte brukt for å studere hvordan celler reagerer på anti-kreft medikamenter. Disse metodene er viktig, men de har flere ulemper. Variasjon i narkotika reaksjoner mellom kreft og normale celler, og mellom celler av forskjellig kreft opprinnelse, og forbigående og sjelden svar er vanskelig å forstå ved hjelp av befolkningen gjennomsnitts analyser og uten å være i stand til å direkte spore og analysere dem på langs. Mikroskopet er spesielt godt egnet til bilde levende celler. Fremskritt i teknologi gjør oss i stand til å rutinemessig bildet celler med en oppløsning som gjør det mulig ikke bare celle sporing, men også observasjon av en rekke cellulære responser. Vi beskriver en tilnærming i detalj som gjør det mulig for den kontinuerlige time-lapse avbildning av-celler i løpet av medikamentrespons for i hovedsak så lenge som ønskelig, typisk opp til 96 timer. Ved hjelp av variasjoner av tilnærming, kan cellene bli overvåket i flere uker. Med ansettelsen av genetisk kodet fluorescerende biosensorer mange prosesser, stier og svar kan følges. Vi viser eksempler som inkluderer sporing og kvantifisering av cellevekst og cellesyklusprogresjon, kromosom dynamikk, DNA-skade og celledød. Vi diskuterer også variasjoner av teknikk og sin fleksibilitet, og fremheve noen vanlige fallgruver.
Levende-celle mikroskopi og lengde sporing av enkeltceller er ikke en ny teknikk. Fra de tidligste mikroskoper, har entusiaster og forskere observert og studert enkeltceller og organismer, deres atferd og utvikling 1-3. Et kjent eksempel fra sent David Rogers ved Vanderbilt University i 1950 viser et menneske nøytrofile i et blodutstryk jage en Staphylococcus aureus bakterie og til slutt prosessen med fagocytose 4. Denne live-cell filmen er en utmerket illustrasjon av hvordan flere prosesser kan observeres og korrelert i et enkelt eksperiment: sensing av en kjemisk gradient, mekanikk og hastigheten på cellemotilitet, figurer celle dynamikk, heft og fagocytose av et patogen.
Ankomsten av fullt automatiserte mikroskoper og svært sensitive digitale kameraer har resultert i et økende antall etterforskere bruker mikroskop for å stille grunnleggende spørsmål i cellebiologi alt from hvor cellene flytte 5,6 og dele 7,8 til organelle dynamikk og membran trafficking 9-11. Non-fluorescerende, lysfelt mikroskopi, inklusive fase-kontrast (PC), som fått Nobelprisen for Frits Zernike i 1953, og differensial interferens kontrast (DIC) gir mulighet for observasjon av celler og kjerner, men også sub-cellulære strukturer inkludert mikrotubulidynamikk bunter , kromosomer, nukleoli, organelle dynamikk, og tykke aktin fibre 12. Genetisk kodet fluorescerende proteiner og utvikling av fluorescerende fargestoffer mot organeller har dramatisk påvirket time-lapse mikros 13-15. Selv ikke fokus for denne artikkelen, bildebehandling i celleklumper og in situ (intramikroskopi) ved hjelp av konfokal og multiphoton mikros representerer en annen utvidelse av tilnærming, og det er utestående artikler som bruker og diskuterer disse tilnærmingene 16-19.
Svarene av celler til anti-cancere legemidler eller naturprodukter er fastsatt på molekylær og cellulær skala. Forstå celle responser og skjebner etter behandling innebærer ofte befolknings gjennomsnitts-analyser (f.eks., Immunoblottingforsøk, hele brønntiltak), eller faste tidspunkter med immunfluorescens deteksjon og flowcytometri, som måler enkeltceller. Heterogenitet i encellete respons på medikamenter innenfor en befolkning, spesielt i tumorer, kan forklare noen av variasjonen i respons sett på tvers av cellelinjer og svulster som er behandlet med det samme stoffet ved metning. Long-term langsgående tilnærminger for å følge en gitt enkelt celle eller en populasjon av celler som er en mindre vanlig, men meget kraftig metode som gjør det mulig for den direkte studium av molekylrespons trasé, forskjellige fenotyper (f.eks., Celledød eller celledelingen), observasjon av celle-til-celle variasjon innenfor en populasjon, og hvordan disse faktorene bidrar til befolkningen respons dynamikk 20-22. Optimistisk, å kunneå observere og kvantifisere encellete svar vil bidra til å forbedre vår forståelse av hvordan stoffene virker, hvorfor de noen ganger mislykkes, og hvordan du best kan bruke dem.
Teknikken av langsiktig time-lapse mikroskopi, langsgående sporing og analyse av narkotika reaksjoner er tilgjengelig for mange etterforskere og kan være enkle, med bare overført lys til å observere fenotype svar 20,21. De viktigste komponentene i tilnærmingen inkluderer: passende forberedelse av cellene av interesse, en automatisert mikroskop med miljøkammer, et kamera integrert med en datamaskin til å erverve og lagre bilder og programvare for å gjennomgå time-lapse og måle og analysere cellene og eventuelle fluorescerende biosensorer. Vi tilbyr en detaljert protokoll med mange tips for å drive time-lapse mikroskopi av dyrkede celler så lenge som flere dager ved hjelp av lysfelt og / eller Widefield epifluorescent mikroskopi. Denne protokollen kan anvendes for en hvilken som helst cellelinje som kan dyrkes i kulturfor å studere deres svar på anti-kreft terapi. Vi gir eksempler på data innhentet og analysert ved hjelp av flere forskjellige genetisk kodet fluorescerende biosensorer og et eksempel på fasekontrastmikroskopi, kort diskutere ulike typer sonder, fordeler og ulemper ved langsiktig time-lapse og lengde sporing, hva kan være lærte for denne tilnærmingen som er vanskelig å forstå fra ikke-direkte tilnærminger, og noen varianter som vi håper vil være av interesse og verdi for uerfarne forskere som ikke har vurdert å bruke tilnærming, og til erfarne forskere.
Fordeler med Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking
Mikroskopet er et ideelt instrument for longitudinelle studier av legemiddelrespons som gjør det mulig etterforskere for å spore individuelle celler og deres skjebner, samt hele befolkningen. Variasjon i narkotika svar innen en populasjon av celler er et stort problem for anti-kreft terapeutisk design. Langsgående sporing av enkeltceller gjør at etterforskerne å observere denne variasjonen og begynne å forstå…
The authors have nothing to disclose.
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
Nikon laser launch | Nikon | ||
SOLA light engine | lumencor | ||
iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |