Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
anti-kanser ilaçları ile tek hücre yanıtı Popülasyon yanıtı belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır ve bu nedenle genel bir sonuç önemli bir faktördür. Bağışıklık, akım sitometri ve sabit hücre deneyleri genellikle hücreler anti-kanser ilaçlar nasıl tepki incelemek için kullanılır. Bu yöntemler önemlidir, ancak onlar birkaç eksiklikler var. kanser ve normal hücreler arasındaki ve farklı kanser kaynaklı hücreler ve geçici ve nadir yanıtları arasındaki ilaç yanıtları değişkenlik nüfus ortalama analizleri kullanılarak doğrudan izlemek ve uzunlamasına bunları analiz edebilmek olmadan anlamak zordur. mikroskop, özellikle de görüntü canlı hücreler için uygundur. teknolojideki ilerlemeler, sadece hücre izleme değil, aynı zamanda hücresel yanıtların çeşitli gözlem sağlayan bir çözünürlükte rutin görüntü hücreleri sağlamaktadır. Biz sürekli time-lapse görüntüleme sağlayan detaylı bir yaklaşım tarifesasen sürece genellikle 96 saat kadar istediğiniz gibi ilaç yanıtı sırasında hücreler. yaklaşımın çeşitleri kullanılarak, hücreler hafta içinde izlenebilir. genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler sayısız süreçler, yolları ve tepkilerinin istihdam ile takip edilebilir. Bu izleme ve hücre büyümesi ve hücre döngüsü ilerlemesinin, kromozom dinamiği, DNA hasarının ölçme ve hücre ölümünü içerir örnekleri göstermektedir. Biz de teknik ve esnekliği çeşitlerini tartışmak ve bazı ortak tuzaklar vurgulayın.
Introduction
Canlı hücre mikroskopi ve tek hücre boyuna izleme yeni bir teknik değildir. Erken mikroskoplar, meraklıları ve bilim adamları tek hücreler ve organizmalar, onların davranışlarını ve gelişimini 1-3 gözlenen ve inceledik. 1950'lerde Vanderbilt Üniversitesi'nde geç David Rogers ünlü bir örnek, bir Staphylococcus aureus bakterisi ve fagositoz 4 sonunda sürecini kovalayan bir kan yaymasında bir insan nötrofil gösterir. Bu canlı hücre film tek bir deneyde gözlenen ve korelasyon nasıl birden çok işlem mükemmel bir örnektir: Bir kimyasal degrade, mekanik ve hücre hareketi hızı algılama, hücre dinamikleri, yapışma, ve bir patojenin fagositozu şekillendirir.
tam otomatik mikroskopları ve son derece hassas dijital kameralar gelişi hücre biyolojisi değişen f temel soru sormak için mikroskobu kullanarak araştırmacılar bir çok artan sayılarda sonuçlandıHücreler 5,6 taşımak ve dinamikleri ve membran ticaretini 9-11 organel 7,8 bölmek nasıl rom. Floresan olmayan, 1953 yılında Frits Zernike için Nobel Ödülü topladı faz-kontrast (PC), ve diferansiyel girişim kontrast da dahil olmak üzere aydınlık mikroskobu (DIC) mikrotübül demetleri dahil hücre ve çekirdeklerin aynı zamanda alt hücresel yapıların gözlem için izin , kromozomlar, nükleol, organel dinamikleri ve kalın aktin lifleri 12. Genetik floresan proteinleri kodlanmış ve organeller karşı floresan boyaların geliştirilmesi önemli ölçüde time-lapse mikroskopi 13-15 etkiledi. Bu yazının odağı değil iken, hücre sferoidler ve in situ (Intravital mikroskopi) konfokal ve multiphoton mikroskopi kullanılarak görüntüleme yaklaşımının başka genişleme temsil ve kullanımı ve bu yaklaşımları 16-19 tartışmak seçkin makaleleri vardır.
Anti-Canc hücre tepkilerier ilaçlar veya doğal ürünler moleküler ve hücresel ölçekte belirlenir. Anlamak hücre yanıtları ve kaderleri aşağıdaki tedavisi genellikle tek hücreleri ölçmek nüfus ortalama deneyleri (örn., Immünoblotting, bütün kuyu ölçüleri), ya da immunofluorescent algılama ile sabit zaman noktaları ve akım sitometri, içerir. bir popülasyon içindeki ilaç tek hücre yanıtlarında heterojenliği, tümörler, özellikle de doygunluğuna aynı ilaç ile muamele edilir hücre hatları ve tümör boyunca görülen yanıt olarak değişkenlik bazı açıklayabilir. Belirli bir tek hücre ya da hücrelerin bir popülasyonu aşağıdaki uzunlamasına yaklaşımlar uzun süreli moleküler cevap yollarının doğrudan çalışma için olanak sağlayan daha az sık ama çok güçlü bir yaklaşım, farklı fenotipleri (örn., Hücre ölümü veya hücrenin bölme), gözlem hücre-hücre bir popülasyon içindeki değişkenliği ve nasıl bu faktörler popülasyon yanıtı dinamikleri 20-22 katkıda bulunur. Iyimser, güçlü olmakgözlemlemek ve uyuşturucu bazen başarısız neden çalışmak ve en iyi nasıl bunları kullanmak için nasıl anlayışımızı geliştirmemize yardımcı olacaktır tek hücre yanıtlarını ölçmek için.
Uzun vadeli time-lapse mikroskobu, uzunlamasına izleme ve ilaç yanıtları analiz tekniği birçok araştırmacı tarafından kullanılabilir ve fenotip yanıtları 20,21 gözlemlemek için sadece iletilen ışık kullanarak, basit olabilir. yaklaşımının ana bileşenleri şunlardır: ilgi hücreleri uygun hazırlanması, çevre haznesi ile otomatik mikroskop, kamera kazanmak ve zaman atlamalı yorumlayan görüntüleri saklamak, yazılım ve ölçmek ve hücreleri analiz etmek için bir bilgisayar ile entegre ve herhangi bir floresan biyosensörler. Biz aydınlık ve / veya widefield epifluorescent mikroskopi kullanılarak sürece birkaç gün kültür hücreleri time-lapse mikroskobu yürütmek için birçok ipuçları ile ayrıntılı bir protokol sağlar. kültüründe yetiştirilebilir herhangi bir hücre hattı için kullanılabilir Bu protokolanti-kanser tedavilerinin kendi yanıtlarını incelemek için. Biz elde edilen verilerin örneklerini sunmak ve kısaca farklı prob türleri, avantaj ve uzun vadeli time-lapse ve boyuna izleme dezavantajlarını tartışmak çok farklı genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler ve faz-kontrast mikroskobu örneği kullanılarak analiz, ne olabilir, olmayan doğrudan yaklaşımlar ve biz yaklaşımı kullanılarak kabul değil deneyimsiz araştırmacıların ilgi ve değer olacağını umuyoruz bazı değişimlerden anlaşılması zor ve deneyimli araştırmacılara bu yaklaşım için öğrendim.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse Mikroskopi ve Boyuna İzleme Avantajları
bu araştırmacılar, bireysel hücreleri ve kaderlerini yanı sıra tüm nüfusu izlemenize olanak sağlar olarak mikroskop ilaç yanıtının uzunlamasına çalışmalar için ideal bir araçtır. bir hücre popülasyonu içinde, ilaç yanıtındaki değişkenliği, anti-kanser terapötik tasarımı için önemli bir sorundur. tek hücre Boyuna izleme araştırmacılar bu değişkenliği gözlemlemek ve hücre popülasyo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
References
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
- Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
- van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
- Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
- Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
- Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
- Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
- Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
- Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
- Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
- Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
- Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
- Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
- Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
- Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
- Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
- Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
- Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
- Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
- Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
- Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
- Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
- Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
- N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
- Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
- Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
- Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
- Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
- Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
- Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
- Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
- Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).
