Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
A resposta de células únicas para fármacos anti-cancro contribui significativamente para a determinação da resposta da população, e, portanto, é um factor importante que contribui para o resultado global. Immunoblotting, citometria de fluxo e experimentos com células fixas são frequentemente usados para estudar como as células respondem a drogas anti-câncer. Estes métodos são importantes, mas eles têm várias deficiências. A variabilidade nas respostas ao fármaco entre o cancro e as células normais, e entre células de cancro de origem diferente, e transiente e respostas raras são difíceis de entender utilizando ensaios de média da população e sem ser capaz de controlar directamente e analisá-las longitudinalmente. O microscópio é particularmente bem adequado para células vivas imagem. Os avanços na tecnologia permitem-nos rotineiramente células de imagens em uma resolução que permite não só o acompanhamento de células, mas também a observação de uma variedade de respostas celulares. Nós descrevemos uma abordagem pormenorizada que permita a imagem contínua de lapso de tempo decélulas durante a resposta da droga para, essencialmente, desde que desejado, tipicamente até 96 horas. Utilizando variantes da abordagem, as células podem ser monitorados durante semanas. Com o emprego de codificados geneticamente biossensores fluorescentes numerosos processos, caminhos e respostas pode ser seguido. Mostramos exemplos que incluem acompanhamento e quantificação do crescimento celular e na progressão do ciclo celular, a dinâmica de cromossomas, danos no ADN e morte celular. Discutimos, também, variações da técnica e sua flexibilidade, e destacar algumas armadilhas comuns.
microscopia de células vivas e acompanhamento longitudinal de células individuais não é uma técnica nova. Desde os primeiros microscópios, os entusiastas e cientistas têm observado e estudado células individuais e organismos, seus comportamentos e desenvolvimento 1-3. Um exemplo famoso do falecido David Rogers na Universidade de Vanderbilt na década de 1950 mostra um neutrófilo humano em um esfregaço de sangue perseguindo uma bactéria Staphylococcus aureus e, eventualmente, o processo de fagocitose 4. Este filme-célula viva é um excelente exemplo de como os processos múltiplos podem ser observados e correlacionados em um único experimento: detecção de um gradiente químico, mecânica e velocidade da motilidade celular, celular formas dinâmicas, adesão e fagocitose de um patógeno.
O advento de microscópios totalmente automatizados e câmeras digitais altamente sensíveis resultou em um aumento do número de investigadores por meio de microscopia de fazer perguntas fundamentais em biologia celular variando from como as células mover 5,6 e dividir 7,8 a organela dinâmica e tráfico de membrana 9-11. Não fluorescente, microscopia de campo claro, inclusive de contraste de fase (PC), que recebeu o Prêmio Nobel de Frits Zernike em 1953, e contraste de interferência diferencial (DIC) permitem a observação de células e núcleos, mas também estruturas sub-celulares, incluindo feixes de microtúbulos , cromossomas, nucléolo, dinâmica de organelos, e fibras de actina grossas 12. Geneticamente codificado proteínas fluorescentes e no desenvolvimento de corantes fluorescentes contra organelas têm impactado drasticamente a microscopia de lapso de tempo 13-15. Embora não seja o foco deste artigo, a imagem latente em esferóides celulares e in situ (microscopia intravital) usando confocal e microscopia multiphoton representam uma nova expansão da abordagem, e há artigos pendentes que usam e discutir estas abordagens 16-19.
As respostas de células a anti-Cancer drogas ou produtos naturais são determinados na escala molecular e celular. Compreender as respostas das células e destinos após o tratamento muitas vezes envolve a população ensaios de média (por exemplo., Immunoblotting, medidas bem inteiras), ou pontos de tempo fixos com a detecção de imunofluorescência e citometria de fluxo, que medem células individuais. A heterogeneidade das respostas de células únicas para fármacos dentro de uma população, em especial em tumores, pode explicar alguns dos a variabilidade na resposta observada através de linhas de células e tumores que são tratados com o mesmo fármaco em saturação. A longo prazo abordagens longitudinais seguir uma dada célula individual ou uma população de células é uma abordagem menos comum mas muito poderosa que permite o estudo directo de vias de resposta moleculares, diferentes fenótipos (por ex., Morte celular ou a divisão celular), a observação de variabilidade célula-a-célula dentro de uma população, e como estes factores contribuem para a dinâmica de resposta população 20-22. Optimista, podendopara observar e quantificar respostas de célula única vai ajudar a melhorar a nossa compreensão de como os medicamentos funcionam, por que eles às vezes não, e como melhor utilizá-los.
A técnica de microscopia de longo prazo de lapso de tempo, o acompanhamento longitudinal e análise das respostas de drogas está disponível para muitos investigadores e pode ser simples, usando a luz transmitidas apenas para observar respostas fenótipo 20,21. Os principais componentes da abordagem incluem: preparação adequada das células de interesse, um microscópio automatizado com câmara ambiental, uma câmera integrada com um computador para adquirir e armazenar as imagens e software para analisar o lapso de tempo e medir e analisar as células e quaisquer biossensores fluorescentes. Nós fornecemos um protocolo detalhado com muitas dicas para a realização de microscopia de lapso de tempo de células cultivadas, enquanto vários dias usando claro e / ou microscopia de epifluorescência widefield. Este protocolo pode ser utilizado para qualquer linha de células que podem ser cultivadas em culturapara estudar as suas respostas às terapias anti-câncer. Nós fornecemos exemplos de dados adquiridos e analisados utilizando vários biossensores fluorescentes geneticamente codificados diferentes e um exemplo de microscopia de contraste de fase, discutir brevemente os diferentes tipos de sondas, as vantagens e desvantagens de longo prazo de lapso de tempo e acompanhamento longitudinal, o que pode ser aprendidas para esta abordagem que é difícil de compreender a partir de abordagens não-directos, e algumas variações que esperamos que venha a ser de interesse e valor para pesquisadores inexperientes que não ter considerado usando a abordagem, e para investigadores experientes.
Vantagens de Microscopia Time-lapse e Acompanhamento Longitudinal
O microscópio é um instrumento ideal para os estudos longitudinais de resposta à droga, uma vez que permite aos investigadores para rastrear as células individuais e os seus destinos, bem como a totalidade da população. A variabilidade na resposta à droga dentro de uma população de células é uma questão importante para anti-câncer projeto terapêutico. acompanhamento longitudinal de células indiv…
The authors have nothing to disclose.
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
Nikon laser launch | Nikon | ||
SOLA light engine | lumencor | ||
iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |